电磁脉冲使细胞膜电穿孔结合药物治疗肿瘤及电磁参量的初步优化

电磁脉冲使细胞膜电穿孔结合药物治疗肿瘤及电磁参量的初步优化 电磁脉冲使细胞膜电穿孔结合药物治疗肿瘤及电磁参量的 初步优化 第22卷增刊 微 波 学 报 Vol.22 Supplement 2006年6月 JOURNAL OF MICROWAVES Jun. 2006 电磁脉冲使细胞膜电穿孔 结合药物治疗肿瘤及电磁参量的初步优化 王保义1 张 弘1 王子淑2 徐宝强3 (1. 四川大学电子信息学院，成都 610064;2. 四川大学生命科学院，成都 610064; 3. 天津理工学院光电系，天津 300191) 摘 要:利用电脉冲结合抗肿瘤药物(盐酸阿霉素和博莱霉素)对小鼠实体肿瘤(S180)进行处理后，发现能明显抑制肿瘤的生长，最高抑制率为95%。通过一系列的实验，我们得到了电磁脉冲的优化参数。为电化学治疗(Electrochemotherpy, ECT)提供了最新证据。 关键词:电穿孔，ECT，肿瘤治疗，最佳脉冲参量 The Treatment of Tumors Using Electroporation of Cell’s Membrane Due to EM-Pulses with Antitumor Drugs and the Optimal of Parameters EM-Pulses WANG Bao-yi1, ZHANG Hong1, WANG Zi-shu2, XU Bao-qiang3 ——————————————————————————————————————————————— (1. College of Electronics-Information, Sichuan University,Chengdu 610064, China; 2. College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China; 3. Department of Photo-Electronics, College of Tianjin Science and Engineering,Tianjin 310019, China) Abstract:The treatment to S180 tumor cells using EM-Pulses and antitumor drugs evaluated that the growth of S180 sarcoma was inhibited evidently. The maximum inhibition ratio exceeded 95%. After systematic experiments, we have got the optimal parameters of EM-Pulses. The new evidence of Electrochemotherapy(ECT) was advanced. Key words: Electroporation, ECT, Tumor treatment, Optimal parameters of EM-Pulses 引 言 当今对肿瘤的治疗多采用下列手段:1.采用抗癌药物治疗，此办 法有部分效果，但由于抗癌药物很难进入肿瘤细胞内，效果不理想; 2.手术治疗结合化疗，也能取得较好效果，但手术后伴随着部分肿瘤 细胞转移的风险，化疗对正常细胞副作用较大;3.微波和超声治疗， 将能量聚焦到肿瘤部分，杀死肿瘤细胞，对集中性肿瘤有较好疗效， 对弥漫性的难以见效且能量聚焦有一定的难度;4.传统的电化学疗法 (ECT)，即通过电脉冲和抗肿瘤药物相结合也能取得较好的治疗效果。 1996年G. A. (即通过电脉Hofmann等人提出了新的ECT方法[1] ——————————————————————————————————————————————— * 冲使肿瘤细胞产生电孔穿，再导入抗肿瘤药物)，结果治愈率大幅度提高。1999年G. A. Hofmann等用传统剂量的药物进行ECT治疗人又进行实验[2]， 的效率比传统的ECT法的效率高出七倍以上，他们还进行了第二期临床实验取得了巨大的进展，这种新办法特别适合于浅表性肿瘤的治疗。 利用电穿孔技术这是新的ECT方法的关键，所谓电穿孔[3~5][14~15]，是应用脉冲电场使细胞膜产生瞬时穿孔，从而改变细胞膜通透率的一种生物物理现象，它提供了一种通路，使DNA、离子和蛋白质及各种药物分子可进入细胞内部。 我们对电穿孔及其应用开展过大量的研究[6~11]，本文就是利用电穿孔治疗肿瘤的一部分。 收稿日期:2005-04-18;定稿日期:2005-12-05 基金项目:国家自然科学基金资助(60451001) 208 微 波 学 报 2006年6月 在ECT治疗的过程中，电磁脉冲参数的选取非常关键，我们将利用ECT技术治疗植入昆明鼠内的S180肉瘤，通过大量的系统实验得到最佳电磁脉冲参数并取得了非常满意的结果，肿瘤抑制率最高达95%，平均抑制率也达到90%左右。 1 实验系统、材料与方法 ——————————————————————————————————————————————— 本实验使用LN-101型脉冲基因导入仪(由天津理工学院生产)，可以输出变化的高电压和强电流脉冲波形，脉冲最高输出为2500V，最大瞬时电流为150A，机内设有不同的电容值，以便改变脉冲的宽度。 ?材料与方法 S180肉瘤细胞为本实验室冻存;昆明小白鼠购自四川大学华西动物养殖中心，平均体重为20g/只。 将S180细胞接种到昆明小鼠腹腔，第4天抽取，用生理盐水稀释成1.0×107细胞/ml。然后将稀释的细胞接种到昆明小鼠右后肢皮下，每只接种0.2ml。10天后，将肿瘤生长情况良好的小鼠随机分组。对照组不作任何处理;其余各电化学治疗组先用博莱霉素多点注射肿瘤块，用药量0.04mg/只，用药后在局部给予肿瘤块电脉冲处理。电脉冲处理时的参数设置如下:固定脉冲个数(5个)，改变电压及电容(电压500V、700V、900V，电容6μF、10μF、14μF);或者固定电压及电容(700V，10μF、14μF);改变脉冲个数(5、7、9个)。每隔2天处理一次，共3次。在电化学处理前及小鼠断颈处死前对小鼠肿瘤进行测量、计算，以评价肉瘤生长情况。(见主要结果的3和4) 抑瘤率(%)=(对照组肿瘤平均体积-实验组肿瘤平均体积)/对照组肿瘤平均体积×100%。处理小鼠后，用立体解剖镜观察剥离肿瘤表面血管生长情况，然后按常规方法对剥离肿瘤进行石蜡切片、HE染色，观察肿瘤内部血管密度。 ——————————————————————————————————————————————— 将肿瘤生长情况良好的小鼠随机分成4组:对照组不作任何处理;药物组11只，每只小鼠肿瘤块注射0.2ml浓度为0.67mg/ml的盐酸阿霉素;电场组10只，只给予小鼠肿瘤块电脉冲处理(电压600V，电容10μF，5个脉冲);电化学组6只，每只小鼠肿瘤块先注射0.2ml浓度为0.67mg/ml的盐 酸阿霉素，再立即电脉冲处理，参数同电场组。各实验组每隔2天照此方法处理一次，共3次。10天后断颈处死，将肿瘤块切成1mm3左右的小块经过生物学系列处理，用H-600?型透射电子显微镜观察肿瘤细胞内部超微结构变化。(见主要结果的1和2) 2 主要结果 2.1 电化学疗法对小鼠S180肿瘤血管生长的影响 电化学治疗过程中，第一次治疗后，发现肿瘤部位皮肤微红，肿瘤及周围组织开始水肿，颜色变白。第二次电化学治疗后肿瘤部位颜色更加苍白，肿瘤体积开始逐渐变小、质地开始变硬。第三次电化学治疗后，部分小鼠肿瘤已经基本消失，其中有些小鼠原肿瘤部位痂壳脱落形成小坑，肉眼已经不能分辨出有肿瘤的存在(见图1，相邻两次之间相隔两天)。 图1 肿瘤消失后剩下的小坑(箭头) 处死小鼠后剥离肿瘤，发现电化学治疗组肿瘤与周围正常组织分界清楚，容易剥离，瘤体小，较硬，肿瘤表面颜色苍白，血管非常少。而对照组肿瘤与邻近正常组织连接紧密，很难剥离，瘤体大，较软，肿瘤表面颜色鲜红，血管丰富(见图2)。 ——————————————————————————————————————————————— 图2 对照组(左)与电化学治疗组肿瘤(右 ) 组织切片发现电化学治疗组肿瘤内部血管密度减小，对照组血管分布比较密，而且电化学治疗组肿瘤细胞数量减小(见图3)。这些结果表明，电化学疗法对小鼠肿瘤血管的生成具有明显的抑制作用。 (a) 对照组肉瘤，血管丰富 (b) 电化学治疗组肉瘤，血管很少 图3 S180肉瘤组织学观察 2.2 电化学疗法对小鼠肉瘤S180细胞超微结构的 影响 电镜观察发现，电脉冲或者药物处理S180肉瘤，细胞内线粒体等细胞器结构无明显变化，而经过电脉冲和盐酸阿霉素同时处理的S180细胞核出现大量染色凝集，内质网肿胀，线粒空泡化等现象(见图4)。说明电化学协同作用比电脉冲或者药物对肿瘤细胞的毒性更大。(其中(a)、(b)、(c)经多次切片对比，差异不显著) 2.3 电化学疗法对小鼠S180肉瘤生长的影响 固定脉冲个数，不同电压及电容的脉冲场结合博莱霉素对小鼠S180肉瘤生长的影响，实验结果见表1。统计表明各电化学处理组的肿瘤平均增长率明显比对照组低，差异极其显著(<0.001)，但各处理组间差异不显著(>0.05)。这说明在实验电参数范围内改变参数设置并不影响电化学疗效。 (a) (b) ——————————————————————————————————————————————— (c) (d) (a) 对照组，肿瘤细胞器形态正常;(b) 药物组，细胞器形态基本正常;(c) 电场组，细胞器形态基本正常;(d) 电化学组，细胞核出现大量的染色质凝集，如白箭头所示，内质网肿胀，线粒体空泡化现象明显，如黑箭头所示 图4 S180肿瘤细胞超微结构观察 表1 不同电压及电容电化学疗法对小鼠S180肉瘤生长的 影响(5个脉冲) 脉冲参数 小鼠数量 肿瘤增长率抑制率(%) (%)500V, 6μF 9 12.6?19 90.50 500V, 10μF 7 13.9?23 86.70 500V, 14μF 8 33.7?53 73.60 700V, 6μF 7 15.7?29 92.10 700V, 10μF 6 15.9?19 90.90 700V, 14μF 6 19.6?25 84.97 900V, 6μF 9 10.2?16 92.40 900V, 10μF 8 14.7?19 90.50 900V, 14μF 7 16.3?14 90.10 对照 6 205.2?104 不同脉冲个数的脉冲场结合博莱霉素对小鼠S180肉瘤生长的影响，电脉冲电压700V，电容10μF，脉冲个数分别为5、7、9个时，结合博莱霉素处理小鼠S180肉瘤，结果见表2。 210 微 波 学 报 2006年6月 表2 不同脉冲个数的电化学疗法对小鼠S180 ——————————————————————————————————————————————— 肉瘤生长的影响 (电压700V，电容10μF) 脉冲参数 小鼠数量 肿瘤增长率抑制率(%) (%) 5 6 15.9?19 90.9 7 5 16.9?35 91.1 9 8 7.7?6.0 95.5 对照 6 205.2?104 对表2中各实验组的肿瘤增长率进行统计，结果表明各电化学处理组的肿瘤增长率明显比对照组低，差异极其显著(<0.001)，但各处理组间差异不显著(>0.05)。这说明实验中的脉冲个数对实验结果影响不显著。 电化学治疗过程中给药后不同时间电脉冲处理对小鼠S180肉瘤生长的影响，用药1min或15min后电脉冲处理，小鼠S180肉瘤生长情况见表3。统计发现，用药1min后电脉冲处理组与用药15min后电脉冲处理组的肿瘤增长率分别比对照组要低，差异极其显著(<0.001)，而且用药1min后电脉冲处理组比用药15min后电脉冲处理组的肿瘤增长率要低，差异显著(=0.02)。这一结果国内外尚未见有别的文献报道，其原因尚待认真研究。 表3 给药后不同时间电脉冲治疗对小鼠S180 肉瘤生长的影响 肿瘤时间 起始肿瘤 最后肿瘤 肿瘤 体积 体积 增长率 抑制率 1min 179.4? 70.9 12.6? 17.1 6.9?8 95.2215min 176.4? 73.1 45.8——————————————————————————————————————————————— ? 66.4 25.1? 33 82.6对照 176.4? 144.5 263.6? 142.4 205.2? 104 2.4 电磁参量的优化 尽管各ECT治疗组在抑制率方面没有显著差异(<0.001)，但各组之间仍存在差别，即在相同给药量下不同电磁参数之间是值得深入研究的，最好能选出它们的优化结果。经过我们按不同天数处死小鼠，对比不同电磁参数对肿瘤的抑制率，获得了优选电磁参数的满意的结果，图5可以看出它们的差异。 当电容是6μF，脉冲数是5而电压变化时，实验结果表明，电压是700V时总体效果最好，而 电压是900V时总体效果较差(见图5(a))。 当电压和电容固定，而脉冲数在变化时，随着脉冲数的增加抑制效果变好，而脉冲数为9时最好。(见图5(b))。 (对照) (对照) (a) 电压变化 (b) 脉冲数变化 图5 不同电磁参数对肿瘤的抑制率 3 讨论 为了进一步探讨肿瘤生长受到抑制的原因，对肿瘤血管的生长及——————————————————————————————————————————————— 肿瘤细胞超微结构进行了观察，发现经过电化学治疗后，分布在肉瘤表面和内部的血管比对照组明显减少，S180肿瘤细胞超微结构改变明显，出现线粒体肿胀、染色质凝集等现象。这说明，肿瘤生长受到抑制跟肿瘤血管生成受到抑制及肿瘤细胞超微结构改变有关[16 ，17] 。由于肿瘤血管 的生长受到了抑制，减少了对肿瘤的营养供给，肿 瘤的生长速率放慢并逐渐死亡。同时，作为细胞内重要的能量转换细胞器，线粒体结构的损伤意味着肿瘤细胞的生长受到严重抑制，甚至逐渐死亡。另外，S180肉瘤细胞核出现染色质凝集现象，也提示肿瘤细胞出现了凋亡的早期形态特征，肿瘤细胞在电化学过程中会逐渐死亡。 电化学治疗肿瘤的优势在于电脉冲导致细胞膜电穿孔，使通透性低的化疗药物容易通过质膜，从而大大提高对靶细胞的毒性，减少用药量[12]。博莱霉素由于其亲水性特点，正常情况下很难进入细胞内，因此传统的用药剂量往往比较高，很容易产生副作用。电穿孔使博莱霉素在细胞内大量积累，对肿瘤细胞的毒性大大提高。电脉冲增强了博莱霉素治疗肿瘤的效果[13]; 盐酸阿霉素是一类广谱抗瘤药物。但由于其毒副作用大，因此，降低盐酸阿霉素的用量是很重要的。实验中发现，电脉冲结合低剂量的盐酸阿霉素对小鼠S180肉瘤细胞超微结构 有明显的改变作用。这些都说明，电穿孔增强了抗肿瘤药物的毒——————————————————————————————————————————————— 性，电化学治疗肿瘤具有很明显的优势。从使用的两种药物来看，盐 酸阿霉素的效果比博莱霉素更好一些。 实验中我们发现分布在肉瘤表面和内部的血管比对照组少。这一 现象说明肿瘤血管的生长受到了电脉冲和抗肿瘤药物的协同抑制。但 是，肿瘤血管生成受到抑制的分子机制是什么还要进一步研究。 参 考 文 献 [1] Hofmann G A，Dev SB Electrochemotherapy. 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