植物基因组DNA的提取

植物基因组DNA的提取 植物基因组DNA的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD相当于dsDNA 50 μg/ml，ssDNA 33 μg/ml和ssRNA 40 μg/ml。可以此来计算260 核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系 统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 μl量程各一支)、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、 吸头、1.5 ml EP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。 三、试剂 1. 2×CTAB buffer 2. 70%乙醇 3. RNaseA 4. 0.5×TBE缓冲液(工作浓度) 5. 凝胶加样缓冲液(6×) 6. 核酸染料 7. DNA marker 8. 酚/氯仿 (1:1, V/V) 【实验步骤】 1. 取约100 mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5 ml EP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。(在液氮中先取出研磨棒和离心管，离心管要迅速打开，防止温度升高而弹开。研磨时要先把样品一次推到底部，然后快速研磨，研磨过程中要不断用液氮冷冻，防止样品融化) 2. 加入0.6 ml 2×CTAB提取液(用前加入0.2,的巯基乙醇)，混匀，颠倒几次，可Vortex。65? 水浴30 min，每10 min颠倒混匀一次。(加巯基乙醇时要在通风厨进行) 3. 取出离心管，冷却后加入0.6 ml酚氯仿混合液，混匀，充分悬浮，需要Vortex。(吸取酚氯仿混合液时要吸取下层液体，上层为tris-HCl) 4. 12,000 rpm室温离心8 min(若没离好可重复一次)。 5. 将上清液(约450 μl)转移到另一新的1.5 ml离心管中，加入与上清等体积的氯仿，需要Vortex，12,000 rpm 离心8 min。 6. 取上清约400μl，加入600 μl无水乙醇，上下颠倒混匀，-80?放置30 min。 7. 4?，12,000 rpm离心20 min，弃上清。 8. 1 ml 70,乙醇(预冷)洗涤沉淀，上下颠倒几次，不能Vortex，7,000 rpm离心3 min，弃上清。 9. 再次用1 ml 70,乙醇(预冷)洗涤沉淀，上下颠倒几次，不能Vortex，7,000 rpm离心3 min，弃上清。 10. 乙醇充分挥发后，加入20 μl无菌水(含20 μg/ml RNase A)，37? 水浴30 min溶解DNA。 11. 取5 μl DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。