PRMT1_shRNA质粒转染大鼠主动脉内皮细胞条件的优化

PRMT1_shRNA质粒转染大鼠主动脉内皮细胞条件的优化 () 文章编号 : 1007 - 6611 200806 - 0486 - 04 P RMT12sh RNA 质粒转染大鼠主动脉内皮细胞条件的优化 3 3(方雅琴 , 邱 龄 , 肖传实 , 焦延景 , 张圣雪 山西医科大学第二临床医学院心内科 , 太原 030001 ; 通 )讯作者 , Tel :0351 - 7243435 , E2mail :oldnestle @yahoo . co m. cn TM( ) ( ) 摘要 : 目的 优化在聚乙烯亚胺转染剂 jet P EI2R GD 介导下将蛋白精氨酸甲基转移酶 1 PRM T1短发夹 RNA shRNA质 粒转染入原代培养大鼠主动脉内皮细胞时的转染条件 。 方法 贴块法原代培养大鼠主动脉内皮细胞 ,经免疫细胞化学法 TM( ) SP 法鉴定 ,取 3 - 4 代细胞 ,按不同 jet P EI2R GD/ p PRM T12shRNA 比例进行转染 ,24 h 后测定各组转染效率及细胞存活 TMμ率 。 结果 使用 6 孔细胞培养板时 ,每孔加入 3 . 0 g 的 p PRM T12shRNA 并以 N/ P = 5 加入 jet P EI2R GD 转染效率最高 为 53 . 54 % 。 结论 本研究结果为高效地进行细胞转染及进一步在体基因干扰 PRM T1 的研究奠定了基础 。关键词 : 蛋白精氨酸甲基转移酶 1 ; 同型半胱氨酸 ; 非对称性二甲基精氨酸 ; 短发夹 RNA ; 细胞转染 ; 聚乙酸亚胺 衍生物 中图分类号 : Q813 文献标识码 : A Optimization of transf ection conditions f or transf ecting pPRMT12sh RNA into rat arterial endothel ial cells 3 ( FAN G Ya2qin , Q IU Ling , XIAO Chuan2shi , J IAO Yan2jing , ZHAN G Sheng2xue Dept of Ca r diology , S econ d Cl i nical M edical 3 Col lege , S han x i M edical U ni versi t y , T ai y u an 030001 , Chi n a ; Cor res pon di ng aut hor , Tel : 0351 - 7243435 , E2m ail : ol d nest le @ )y ahoo. com . cn Abstract : Object i ve To op timize t he t ransfectio n co nditio ns for t ransfecting t he exp ressio n plasmids of short hairpin RNA ( ) ( ) shRNAtargeted to t he p rotein arginine met hylt ransferases 1 PRM T1gene into p rimary cult ured arterial endot helial cells mediated TMby polyet hyleneimine jet P EI2R GD. M et hods The p rimary rat arterial endot helial cells was cult ured using t he met hod of at tach2 ment block ,and identified wit h immuno histochemical SP met hod. Cells of t he 3rd to 4t h passages were chosen and t ransfected at t he TMdifferent p roportio ns of jet P EI2R GD and p PRM T12shRNA. Af ter 24 h ,t he t ransfectio n rate and cell viability were detected using μ() Res ul ts The t ransfectio n rate was highest 53 . 54 %when 3 . 0g p PRM T12 fluorescent microscope and M T T assay ,respectively. shRNA was added into each well of cult ure plate and t he N/ P ratio was equaled to 5 . Concl usion This experiment may lay t he foundatio n for performing efficient cell t ransfectio n and f urt her research o n RNA interfere of PRM T1 gene i n v i vo. Key words : p rotein arginine met hylt ransferase 1 ; ho mocysteine ; asymmet ric met hylarginine ; short hairpin RNA ; cell t ransfectio n ; polyet hylenimine derivatives 冠状动脉粥样硬化性心脏病是危害人类健康 类细胞中占优势的 PRM T ?,该酶在血浆 Hcy 、AD2 ( ) 生命的主要心血管病之一 ,同型半胱氨酸 Hcy曾 MA 升高及冠心病发生发展中所起的作用尚未见国 因被认为是与冠心病发生发展密切相关的危险因 内外相关研究 ,亟需进一步的研究证实 。本实 验旨在通过加入不同比例 p PRM T12sh RNA 与转染素而备受关注 ,但 2006 年发表的 NO RV I T 、HO P E2 2 等临床试验证实降低血浆 Hcy 水平并不能减少冠 剂所形成的复合物摸索 p PRM T12sh RNA 转染大鼠 心病的发生发展 , 推测 Hcy 可能只是一个旁观者 。 主动脉内皮细胞的最适条件 ,为进一步研究该质粒 的功能打下基础 。近年来研究发现 ,血浆中内源性一氧化氮合酶竞争 ( ) 1 材料及方法性抑制剂非对称性二甲基精氨酸 ADMA与血管 1 . 1 材料内皮功能失调关系密切 ,是急性心血管事件独立的 1 . 1 . 1 实验动物 健康成年 SD 大鼠 ,体重 120 -预测因 子 。几 个 实 验 已 证 明 , 在 动 物 和 人 类 中 高 150 g ,由山西医科大学动物实验中心提供 。Hcy 血症常伴有 ADMA 浓度增高 。 ?型蛋白精氨 ( ) ( ) 1 . 1 . 2 试剂及仪器 噻唑蓝 M T T及二甲基亚砜酸甲基转移酶 PRM T ?是 Hcy 与 ADMA 的合成 () DM SO购自美国 Sigma 公司 ,兔抗人 ?因子一抗 代谢通路交点上关键的限速酶 ,其基因表达及活性 和 F I TC2羊抗兔二抗购自美国 SAN TACRU Z 公司 , 的增高理论上可引起血浆 ADMA 增高而导致内皮 TMjet P E I2R GD 转染剂购自法国 Polyplus 公司 ,并使 功能紊乱 , 同时引起 Hcy 产生增多 。PRM T1 是人 用作 者 之 前 构 建 经 鉴 定 达 转 染 级 的 p PRM T12 ,贴块培养 3 d 后即有内皮细胞从组织块周围移 察 sh RNA 。TS100 倒 置 显 微 镜 为 日 本 Niko n 公 司 生 出 ,呈扁平多角形 , 边界清楚 , 胞质丰富 , 核圆形或 () 产 , IX51 荧光倒置显微镜为日本 Olymp us 公 司 生 椭圆形 ,居中 ,偶见双核 见图 1。约 10 d 细胞开始 产 ,台式超速离心机为德国 Eppendo rf 公司生产型融合成片 ,呈“铺路石样”。传代培养的细胞和原代 号 Cent rif uge 5415D 。形态相似 ,生长较快 ,3 - 4 d 可融合成单层 ,传至 3 - 1 . 2 方法4 代时细胞开始变形脱落 。荧光显微镜下可见细胞 1 . 2 . 1 大鼠主动脉内皮细胞的原代培养及鉴定 将呈多边形 ,细胞核圆形或椭圆形 ,边界清晰 ,胞质发 大鼠颈椎脱臼处死 , 贴块法原代培养 , 待细胞融 () 绿色荧光 见图 2。 合成单层铺满瓶底时 , 胰蛋白酶消化法传代 , 免疫 ( ) 细胞化学法 SP 法鉴定 。 1 . 2 . 2 p PRM T12sh RNA 转染大鼠动 脉 内 皮 细 胞 TM按照 jet P E I2R GD 转染剂要求 ,取 3 - 4 代细胞 于5 转染前 24 h 按每孔 3 . 0 ×10个细胞接种于 6 孔 板 中 ,使 细 胞 于 转 染 时 达 50 % - 60 %融 合 。参 照 jet TMμ( P E I2R GD 转染剂说明书 ,各吸取 2 g P1 - P3 ) μ) μ) ( ( 管、3 g P4 - P6 管 、4 g P7 - P9 管 的 ( )图 1 大鼠主动脉内皮细胞 ×100 p PRM T12sh RNA 分别加入 150 mmol/ L 的 NaCl 溶 ( )Fig 1 Rat arterial endot helial cells ×100 μ液至 100 l 稀 释 。按 N/ P = 3 , 5 , 8 分 别 吸 取 jet2 TMP E I2R GD 加入到 J 1 - J 9 管 150 mmol/ L 的 NaCl μ溶液至 100 l 稀释后 ,立即加入到 P1 - P9 的溶液 TM中混 合 , 室 温 孵 化 30 min , 制 备 成 jet P E I2R GD/ p PRM T12sh RNA 复合物 。吸弃 6 孔板中旧的培养 基 ,用无血清无抗生素的 DM EM 冲洗 2 遍 ,将上述 复合物逐滴加入各孔中 ,摇匀后 37 ?孵育 。转染 4 h 后更换新的 10 %DM EM 继续培养 。所有的转染 ( )图 2 内皮细胞 ?因子免疫细胞化学鉴定 ×100 实验均重复三次 。 Fig 2 Identificatio n of endot helial cells wit h immuno histo2 ( )chemical met hod ×100 转染效率的测 定 1 . 2 . 3 p PRM T12sh RNA 真 核 ( ) 表达载体含有增强绿色荧光蛋白 E GF P基因 , 故 2 . 2 不同转染条件下的转染效率 转染 24 h , 倒 而于细胞转染 24 h 后在荧光显微镜下观察 ,两人同 ( 置荧光 显 微 镜 下 观 察 阳 性 细 胞 发 绿 色 荧 光 见 图时独立估计相同视野下绿色荧光细胞数与自然光 ) 3,转染效率见表 1 ,经统计学分析可知 :p PRM T12 下总细胞数百分比 ,取其平均值作为转染效率 。 sh RNA 量 相 同 时 , N/ P = 5 组 的 转 染 效 率 高 于 1 . 2 . 4 各转染条件下转染复合物细胞毒性的测定 ( ) N/ P = 3组及 N/ P = 8 组 P < 0 . 05; N/ P = 5 时 ,使 () 转染 24 h 后加入 M T T 溶液 5 mg/ ml,孵育 4 h 后μ用 p PRM T12sh RNA 为 3 . 0 g 组的转染效率高于 终止培养 ,吸弃上清 ,加入 DM SO 溶解 。酶联免 疫 μμ( ) 2 . 0 g 及 4 . 0 g 组 P < 0 . 01。( ) 检测仪上测定光吸收值 波长 : 490 nm。计算公 ( ) 式 :细胞存活率 %= 实验组光吸收值/ 对照组光 吸收值 ×100 % 。 1 . 2 . 5 统计学分析 结果以 xx ?s 表示 ,多组间均 数比较采用单因素方差分析 ,两两比较采用 SN K2 q 法 ,数据分析用 SPSS13 . 0 统计软件进行 , P < 0 . 05 具有统计学意义 。 2 结果 ( )图 3 荧光显微镜下被转染的内皮细胞呈绿色荧光 ×200 Fig 3 The t ransfected cell showed green fluorescence un2 ( ) der fluorescent microscop y ×2002 . 1 细胞培养及鉴定结果 倒置相差显微镜下观 ( )各转染条件下的转染效率 % 1 表 重复性差 , 转染率低 。阳离子脂质体法适用性广 , Ta b 1 The transf ection rates at diff erent transf ection con2 重复性好 , 目前被大量应用于体外基因干扰实验 , ( )% ditions 但仍存在一定的缺陷 , 如 DNA 质量对转染效率影 TM 按不同N / P比加入 je tPEI2R GD时的转染效率 响非常大 , 转染过程需在无血清的环境中进行 , 还 p PRM T12shRNA 量 N/ P = 3N/ P = 5N/ P = 8 有脂质体本身的不稳定性也限制了其应用范围 。μ32. 8?75 . 6 42. 2?23 . 4 29. 3?32 . 7 2. 0g1 ( ) 从 Bo ussif 等 发现聚乙烯亚胺 P E I具 有 转 3 μ43. 5?62 . 835. 1?14 . 13. 0g53. 5?44 . 7 基因功能以来 ,聚乙烯亚胺转染方法被推崇为转染 μ 4 . 0g 25 .27 ?2 . 0 29 .40 ?2 . 3 23 .61 ?1 . 4 方法的一个新革命 , P E I 是一种具有较高的阳离子 3 与其余任一组相比 , P < 0 . 05 电荷密度的水溶性有机大分子 , 可 包 裹 压 缩 DNA μ形成 0 . 2 - 0 . 4 m 颗粒状的阳离子复合物 ,后者与 2 . 3 不 同 转 染 条 件 下 的 细 胞 存 活 率 p PRM T12 细胞表面带负电的蛋白多糖结合 ,通过细胞内吞作 μμ sh RNA 量为 2 . 0g 及 3 . 0g 时 ,N/ P = 3 组之细胞 用进入细胞 ,形成内吞体 。P E I 每相隔二个碳原子 ,存活 率 与 N/ P = 5 组 无 统 计 学 差 异 , 但 均 高 于 ( ) N/ P = 8组 P < 0 . 01; N/ P = 3 与 N/ P = 8 时 , 2 . 0 都是质子化的氨基氮原子 ,当溶酶体内的 p H 下降μμ- g 组细胞存活率与3 . 0 g 组之间无统计学差异 ,但 时 , P E I 能够大量捕获质子 , 并引起 Cl 内流 , 导致 μ( μ) 均高于 4 . 0 g 组 P < 0 . 05; N/ P = 5 时 2 . 0 g 组 溶酶体渗透性肿胀 ,最后溶酶体破裂从而将内吞的μμμ细胞存活率高于 3 . 0 g 组 , 3 . 0 g 组高于 4 . 0 g DNA 释放到细胞质 ,即质子海绵效应 ,酸性环境使( ) 组 P < 0 . 05,见表 2 。 2 核酸酶失活 ,从而保护 DNA 免受核酸酶的降解 , DNA 释放后进入细胞核中并表达 。P E I 分为两种 : 分枝状的聚乙烯亚胺和线性的聚乙烯亚胺 。分枝 ( )% 表 2 各转染条件下的细胞存活率 状的 P E I 有利于形成小的转染复合物 ,从而提高转 ( )Tab 2 The cell viabil ity at different transfection conditions % TM染效率 ,但同时细胞毒性也增大 。单纯的 P E I 相对 按不同N / P比加入 je tPEI2R GD时的细胞存活率 p PRM T12shRNA 量 病毒载 体 而 言 , 转 染 效 率 仍 偏 低 , 无 治 疗 靶 向 性 。 N /P = 3 N /P = 5 N /P = 8 μ 95. 8?2 . 8 93. 7?2 . 0 81. 3?2 . 7 2. 0g近年有研究通过相应配体的功能段多肽修饰载体 3 μ3. 0g92. 4?3 . 490. 4?1 . 476. 5?2 . 0来赋予其特定的细胞靶向性,配体也可以启动受 μ体介导的细胞内吞过程 ,以部分取代 P E I 的单纯依 4 . 0g 87 .8 ?1 . 6 82 .8 ?1 . 1 74 .5 ?2 . 9 4 靠电荷引力接触细胞。 TM本实验所用 jet PEI2R GD 是精氨酸 - 甘氨酸 - 由此可知 , 在保证较高的细胞存活率下 , 为获 ( ) 天冬氨酸 R GD三肽共轭的线性聚乙酸亚胺衍生物 , 得最 高 的 转 染 效 率 , 应 选 择 于 6 孔 板 每 孔 内 加 入该肽段具有整合素特异的靶向性 ,可选择性的转染表 μ 3 . 0g 的 p PRM T12sh RNA 并按 N/ P = 5 加入 jet2 TMμ P E I2R GD 即 6 l 。() αβα 、大多包含如包含V 的蛋白的上达整合蛋白 5 1 3 讨论皮细胞和内皮细胞 ,故而该转染方法转染效率高 ,操 转染技术是将 DNA 、RNA 及蛋白质等生物大 作步骤简便 ,不受血清和抗生素的影响 ,细胞毒性极 分子转入到真核细胞中并进行表达 ,进而研究基因 () 低 ,重复性高 。氮磷比 N/ P是复合物中离子平衡的 TM 转录调控和基因功能以及蛋白表达调控及蛋白功 度量方法 ,指每一 DNA 磷酸盐中 jet PEI- R GD 所能 ,是生物学研究中的常用工具 。体外 DNA 转染 含氮残基的数量 。本实验中根据以下公式计算不同 TM 技术是转染中最基础的技术 ,目前常用的有以下几 ( μ) N/ P 时所需加入的 jet PEI- R GD 溶液量 l:种体外 DNA 转染方法 : ?物理转染方法 : 常见的是 (μ) 质粒量 g×2 ×N/ PTM jet PEI - R GD 用量 = 。 5 电穿孔法 ,适用于所有细胞 ,但细胞致死率高 ,且需 TM 要昂贵的设备和辅助试剂 。 ?病毒介导的转化 : 转 本实 验 通 过 加 入 不 同 N/ P 比 例 的 jet PEI- R GD 与 p PRM T12shRNA 所 形 成 的 复 合 物 摸 索 出 染效率非常高 , 特别是难转染的细胞 , 但复杂的制 p PRM T12shRNA 转染大鼠主动脉内皮细胞的最适条 备技术及潜在的危险性使其使用受到限制 。 ?生 TM μμ件 ,即 6 孔板每孔加入 3. 0 g 及 6 l 的 jet PEI- 化转染方法 :包括磷酸钙共沉淀转染 、脂质体转染 、 R GD 。上 述 结 果 与 文 献 报 道 使 用 P E I 转 染 剂 转 染( ) 聚乙烯亚胺 P E I转染等 。磷酸钙法 ,操作简便 ,但 () 文章编号 : 1007 - 6611 200806 - 0489 - 03 缺血后处理对大鼠缺血再灌注心律失常的影响 1 2 3 1 31 2 ( 山西医科大学第二临床医学院心内科 , 太原 030001 ; 运城市岳莉英, 李永慧, 王电烨, 李胜建 3 3 ) 中心医院心内科 ; 山西省中医学院附属医院心内科 ; 通讯作者 , E2mail :liyh368 @163 . co m 摘要 : 目的 观察缺血后处理对缺血再灌注心律失常的影响 ,进一步探讨其可能的机制 。 方法 建立大鼠心肌缺血再灌 ( ( ( ) ) ) 注模型 ,设假手术组 n = 8、缺血再灌注组 n = 8及缺血后处理组 n = 8。全程监测心电图 ,再灌注结束后 ,应用逆转录 - ( ) 聚合酶链反应 R T2PCR法半定量检测各组 Cx43 mRNA 的表达水平 ,并用室性心律失常评分来评价室性心律失常的发生率 。 ( ) 结果 R T2PCR 显示 ,缺血再灌注组与假手术组比较 ,Cx43 mRNA 的表达水平显著降低 P < 0 . 01,缺血后处理组与缺血 ( ) 再灌注组比较 ,Cx43 mRNA 的表达水平显著增高 P < 0 . 01;监测心电图显示 ,与假手术组相比 ,缺血再灌注组的室性心律失 ( ( ) ) 常评分显著升高 P < 0 . 01,与缺血再灌注组相比 ,缺血后处理组的室性心律失常评分显著降低 P < 0 . 01。 结论 缺血 后处理能抑制由缺血再灌注导致的心室肌 Cx43 mRNA 降解 ,从而减少再灌注心律失常的发生 。 关键词 : 缺血后处理 ; 室性心律失常 ; 缝隙连接蛋白 43 ; 逆转录 - 聚合酶链反应 中图分类号 : R364 . 12 文献标识码 : A Eff ects of ischemic postcondition ing on ischemia2reperf usion arrhythmias in rats 1 2 3 1 3 1 ( YU E Li2ying, L I Yo ng2hui, WAN G Dian2ye, L I Sheng2jianDept of Ca r diology , S econ d Cl i nical M edical Col lege , S han x i 2 3 M edical U ni versi t y , T ai y u an 030001 , Chi n a ; Dept of Ca r diology , Cent ral Hos pi t al of Y u nchen g ; Dept of Ca r diology , A f f il i ated 3 )Hos pi t al of T CM Col lege of S han x i Prov i nce ; Cor res pon di ng aut hor , E2m ail : l i y h368 @163 . com Abstract : Object i ve To observe t he effect s of postco nditio ning o n ischemia2reperf usio n arr hyt hmias in rat s ,and to explore it s pos2 sible mechanism. ( ) M et hods Twenty2four male Wistar rat s were rando mly divided into 3 group s : sham operatio n group n = 8,is2 ( ) ( ) chemia2reperf usio n group n = 8,ischemic postco nditio ning group n = 8. The myocardial ischemia2reperf usio n model was established by ligatio n of t he lef t anterior descending coro nary artery for 30 min ,followed by 120 min reperf usio n. EC G was mo nitored during t he entire p rocess. The exp ressio n of Cx43 mRNA was measured by reverse t ranscrip tio n2PCR ,and vent ricular arr hyt hmias was detected ( ) wit h vent ricular arr hyt hmia score VAS. Res ul ts Co mpared wit h sham operatio n group ,Cx43 mRNA exp ressio n level was signi2 ( ) ficantly lower in ischemia2reperf usio n group P < 0 . 01. Co mpared wit h ischemia2reperf usio n group ,Cx43 mRNA exp ressio n signifi2 ( ) cantly increased in ischemic postco nditio ning group P < 0 . 01. Co mpared wit h sham operatio n group , vent ricular arr hyt hmias score ( ) significantly increased in ischemia2reperf usio n group P < 0 . 01. Co mpared wit h ischemia2reperf usio n group , vent ricular arr hyt hmias ( ) score decreased significantly in ischemic postco nditio ning group P < 0 . 01. Concl usion Postco nditio ning could reduce t he occur2 rence of reperf usio n arr hyt hmias by inhibiting degradatio n of Cx43 mRNA caused by ischemia2reperf usio n in vent ricular myocytes. Key words : ischemic postco nditio ning ; vent ricular arr hyt hmias ; co nnexin 43 ; reverse t ranscrip tio n2PCR 5 2001 ,3 :135 - 144 . 其他类型内皮细胞所能达到的转染效率 50 %基 3 Neu M , Fischer D , Kissel T. Recent advances in ratio nal gene 本相同 ,为进一步体外和在体基因干扰 PRM T1 的 ( ) t ransfer vecto r design based o n poly et hylene imine and it s 基因对 Hcy 、ADMA 水平及内皮功能的影响奠定了 ( ) derivativesJ . J Gene Med ,2005 ,7 8:992 - 1009 . 基础 。L ungwitz U ,Breunig M ,Blunk T , et al . Polyet hylenimine2based 4 参考文献 :no n2viral gene delivery systems J . Eur J Phar m Bio p har m , ( ) 1 ’h F , Zanta MA , et al . A versatile vecto r fo r Bo ussif O ,L ezo ualc2005 ,60 2:247 - 266 . gene and oligo nucleotide t ransfer into cells in cult ure and i n v i vo Zaric V , Weltin D , Erbacher P , et al . Effective polyet hylenimine2 5 ( ) polyet hylenimineJ . Proc Natl Acad Sci , 1995 , 92 16 : 7297 - mediated gene t ransfer into human endot helial cells J . J Gene ( ) Med ,2004 ,6 2:176 - 184 . 7301 . 2 Kichler A , L ebo rgne C , Coeytaux E , et al . Polyet hylenimine2 作者简介 : 方雅琴 ,女 ,1975 - 05 生 ,硕士 ,主治医师 . [ 收稿日期 : 2008 - 01 - 11 mediated gene delivery : a mechanistic st udy J . J Gene Med ,