鬼臼毒素结构修饰及生物活性研究进展

鬼臼毒素结构修饰及生物活性研究进展 *张雷 徐晖 朱玮 (西北农林科技大学理学院 杨凌 712100) 摘要 本文简要回顾了鬼臼毒素的研究历史，综述了国内外近年来在结构修饰， 生物活性和鬼臼毒素全合成方面的最新进展。 关键词 鬼臼毒素;抗肿瘤活性;抗病毒活性;构效关系;全合成 New Advances in Mmodification of Podophyllotoxin and Its Bioactivities *ZHANG, Lei XU, Hui ZHU, Wei (College of Science, Northwest A&F University, Yangling 712100) Abstract This review provides a brief retrospect on studies of podophyllotoxin, and summarises more recent developments in structure modifications, bioactivities, and total synthesis of podophyllotoxin. Keywords podophyllotoxin; anticancer activity; antiviral activity; structure and activity relationships; total synthesis 引言 鬼臼毒素(PPT, 1)是小檗科鬼臼属植物主要活性成分，主要从美足叶草 (Podophyllum peltatum)，印足叶草(Podophyllum hexundrum)和桃儿七 [1](Podophyllum emodi)等植物中提取。从1844年King用醇浸提Podophyllum蒸 [2]干后得鬼臼树脂，并用于治疗他的病人，到1880年Podwyssotzki用结晶的方法 得到浸膏的主要成分并正式命名其为podophyllotoxin，再到PPT化学元素组成和 [3~5][6]绝对构型的明确 ，最后到1966年Gensler W J等PPT的合成，经历了长达一 个多世纪的时间。至今PPT仍吸引着许多研究人员从事这方面的探索，这主要是 1 因为PPT及其衍生物有非常出色的抗肿瘤、抗病毒活性等生物活性。PPT的半合成衍生物Etoposide(VP-16, 3)，Teniposide(VP-26, 4)和Etopophos(5)是临床上 [7~9]非常重要的抗肿瘤药物(图1)。 PPT属于芳基四氢萘类木质素，是经莽草酸途径生成的次生代谢产物，其结 [5]构中含有一个对碱敏感的反式内酯环，遇碱异构为苦鬼臼毒素2。PPT的结构 [10]如图1。本文采用符合IUPAC系统命名规则的Moss编号规则，以四氢萘环为母体的。 PPT类化合物是一个五环体系的木质素(e.g. A, B, C, D, E)。A B C D 四个环几乎处于同一平面(见PPT三维结构，图1)。 ROHOH511O3OO4O10A9DCOOB1O122OO8OOO6'2'1'5'ECOOCHH333'HCOOCH4'HCOOCH3333OHOCHOCH33H7 R=NNO212 CH3HC3NN8 R=CH3H O1OROORRR123HO2RO3CHHOH3O 4OHOHSO5OHCHPO(ONa)32 6NMeCHH23HCOOCH333OR1 的三维结构图 图 1 鬼臼毒素类化合物的结构 Figure 1 Structures of derivatives of podophyllotoxin . 近年来国内外学者相继发了一些有关鬼臼毒素类化合物的综述性文章，主 [2,11~21]要集中在药理活性和临床应用方面 。本文就国内外近年来鬼臼毒素类化 2 合物生物活性、构效关系、结构修饰和全合成等研究进行全面综述。 1 生物活性及构效关系 1.1抗肿瘤活性 抗肿瘤活性是PPT最重要的生物活性之一。对与PPT生物活性的研究始于King，他最早将鬼臼树脂用于治疗他的病人。后来Neuberger又将PPT在青蛙，猫，狗等动物中进行试验。人体试验表明鬼臼提取物的毒性很大，对肠胃有强烈的刺激作用，难以作为临床药物，所以在此后的很长一段时间内与PPT相关的 [2]研究报道很少，直到1942年Kaphan成功地将PPT用于性病尖锐湿疣的治疗[22]，才从新激起了人们对PPT研究的兴趣。1946年King 和 Sullivan发现鬼臼 [23]提取物和秋水仙素一样具有抗有丝分裂的活性。后来Sullivan 和Weshler又证 [24]明这种抗有丝分裂的活性是由于抑制了纺锤体的形成所引起的， Suvroma [25]Gupta等证明了PPT的A环和D环，类似于秋水仙素的B环和C环，能与微管蛋白接合而起到抑制纺锤体的形成。由于这些发现人们推测PPT也可能抑制肿瘤细胞的分裂，所以很多研究机构对PPT展开了研究，期望开发出抗肿瘤药物。美国国家癌症研究所Hartwell小组深入研究了鬼臼提取物的化学组成和每种组分的抗癌活性，这些实验数据为后来PPT的研究奠定了基础。五十年代瑞士山道士公司的Sthelin 和 Von Wartburg的研究导致了两种重要抗癌药Etoposide和Teniposide的问世。这两种PPT衍生物不仅在结构上与PPT不同，而且抗癌机制也完全不同。前者是抑制纺锤体的形成使细胞不能正常分裂，后者是抑制 [26,27]DNA拓扑异构酶?(DNA TOPO?)的活性最终导致DNA的分解。对于 [27,28]Etoposide 构效关系的研究Zhang, LY给予了总结(图2)。1971年Etoposide [2]进入临床实验，1983年FDA正式批准Etoposide作为抗睾丸癌的药物上市。 3 临床应用表明Etoposide具有很宽的抗癌谱，除睾丸癌以外还可以用于子宫癌，卵巢癌，各种肺癌，白血病，恶性淋巴瘤，生殖器肿瘤，肉瘤，黒瘤等肿瘤的治[20]疗。但是Etoposide存在诸如水溶性较差、易形成耐药性等缺点，为了克服鬼臼毒素类抗肿瘤药物的这些缺点，人们又开发出活性高毒性小选择性高的PPT [29][30]类抗肿瘤药物，如Etopophos(5)和正处于临床实验的NK611 (6),GL331 (7), [31] TOP53 (8)等(图1)。 4位必须为β构型β-D-葡萄糖苷对抑制TOPO?不是必须的，但大的基团有助与提高活性。 R 反式内酯环起关键性作用 O43 ACBDO 2亚甲二氧基环的保留对于O1抗肿瘤活性非常重要。2位α构型很重要衍生成二氮杂环后细胞毒O性增强，但TOPO?抑制活性降低。 E环能够自由转动也是必须的E 5'3'OCHCOH33 OH3',5'-去甲用于稳定TOPO?-DNA4'-酚羟基很重要，磷酸酯化允许，中间体，但体内体外活性均降低。但是其他基团取代活性不高。 图 2 Etoposide及其类似物的构效关系 Figure 2 The structure and activity relationships of Etoposide and its analogous 1.2 抗病毒活性 很多药典将PPT列为抗HPV病毒的药物，用来治疗尖锐湿疣等各种由病毒引 [32]起的疣。其作用机理是在病毒复制循环的早期抑制病毒复制，或是降低感染 [33]细胞释放病毒的能力而达到治疗的目的。近年来人们又将PPT及其类似物用 [34,35]于抑制HIV活性的研究。Lee KH等研究了PPT及其类似物抗HIV的活性，研究发现将A环打开,再将酚羟基甲基化,同时E环4′-去甲后抗HIV活性增强。 4 [36]Kashiwada的研究表明，这种抗HIV活性可能是由于抑制了拓扑酶的活性而引 [37]起的。Tian X等将PPT及其衍生物与抗病毒药物司他夫定(stavudine)结合得到了很好的抗HIV的化合物，构效发现4位取代基的构型变化对活性影响不大，对于A环的分析得到的结果与Lee KH的相同。 1.3 杀虫活性 [38] 目前对PPT类化合物的杀虫活性报道还不多。七十年代Russell 等在研究植物源害虫控制剂时，发现植物x(L ibocedrus bidwillii) 很少被害虫侵犯，后来从该植物中分离出脱氧鬼臼毒素(9) 和5-甲氧基鬼臼毒素(10) (图4)。这两种化合物在 [39]100mg/L 浓度下对家蝇的致死率高达98%。Kozawa 等又研究了9对尖音库蚊、德国蜚蠊、菜青虫等害虫的杀灭活性，也发现具有很好的效果。后来日本学 [40~44]者也发现9具有杀虫、植物生长抑制等活性并初步研究了其药理活性。在国 [45]内对于PPT及其衍生物杀虫方面的研究起步还要稍晚一些，九十年代初张兴等发现沙地柏提取物具有杀虫活性，并通过活性跟踪分离得到其活性成分——PPT [46~51]类化合物。张兴研究小组在这方面做了很多工作，他们初步研究了PPT类化合物杀虫活性与结构之间的关系,研究发现PPT的E环和D环对这类化合物杀虫活性影响很大，具有反式内酯环的鬼臼衍生物活性大于顺式内酯环的衍生物;内酯 [52]环打开活性降低;4′-去甲后活性降低。Xu H等制备了一系列4β-苯酰胺基PPT衍生物，研究了不同卤素取代以及不同取代方式对这类化合物杀虫活性的影响。 1.4其他活性 [53]除以上所述活性外PPT及其衍生物还有免疫抑制活性，能够治疗风湿性关 [54][55][56]节炎，抗辐射损伤，抗真菌，用于治疗慢性肝炎保护肝不受肝毒素损伤， [57,58]抗炎、抗氧化等活性。 5 2 结构修饰 由于PPT对肠胃有强烈的刺激作用，从而限制了其临床上的应用，而临床抗肿瘤药物Etoposide又存在诸如水溶性小、代谢易失活、骨髓抑制、形成抗药性 [8,59]等缺点。为了克服这些缺点，同时也为了寻找活性更好和具有不同抗癌机制的鬼臼毒素衍生物，在过去的几十年里，有大批的研究人员从事PPT及其类似物 [18]结构修饰改造方面的研究。美国的北卡罗来纳大学Lee HK研究小组在PPT的研究开发方面取得了卓越的成绩，他们开发了具有很强抗癌活性，正处于二期临床阶段的GL331 (7)。 从PPT的环木脂素结构，我们可以看出几乎所有的环都能够进行修饰改造。下面从不同的环来论述近年来PPT研究的进展。 2.1 A环的修饰改变 对于A环的修饰主要有:将亚甲二氧基脱去，使两个酚羟基游离;在游离的酚羟基上引入不同取代基;将芳香体系扩大等。 [60] Castro 及其合作者为了研究PPT类化合物的构效关系，将亚甲二氧基(-OCHO-)脱去制备了新的A环为五员或六员环的PPT类似物11~22(图3)。这2 些化合物对四种肿瘤细胞(P-388, A-549, HT-29 和 MEL-28)的细胞毒活性都比母体化合物低，但仍在微摩尔水平。其结果也进一步说明完整的亚甲二氧基是保持该类化合物较强抗癌活性必需基团。 6 ONOOHOROOOOOHOCOOCHAr3OArR15 2-α13 R= COOH16 2-β13a R= COOCH11 R=Ar314 R=OCH12 R=Ar'3 ONONONOOOHCOO3COCOOCH3OCOOCHO3COOCH3RRR17 R= Ar21 R= Ar19 R= Ar18 R= Ar'22 R= Ar'20 R= Ar'H OOHC3OOOHHNHOOHRNNONONONRNnOArOAr'OAr'2523 R= H26 n=1, 2, 324 R= Cl MeOOMeMeOOMe OMeOH Ar'Ar 图 3 A环修饰改变化合物 Figure 3 A ring modified Compounds [61][62,63]Sung JC、Meresse等根据MacDonald的TOPO?抑制表达复合药效基团 [64]模型理论，分别合成了GL-331吩嗪衍生物23、24和鬼臼哒嗪衍生物25及Etoposide哒嗪类似物26(图3)。活性研究发现23和24对KB细胞都有很强的抑制作用，IC都低于微摩尔(23，0.11?0.03μM;24，0.48?0.17μM)，且作用机制不50 同于Etoposide 和PPT及其它们的类似物，而哒嗪衍生物25却没有活性。 [35]Zhu XK 等合成了一系列A环开环的GL331类似物27~34(图4)并进行了抗HIV活性筛选(结果见Table 1)，化合物的EC都小于0.001g/mL。29、30为 50 7 4′-不去甲衍生物，31、32是相应的去甲化合物，后者活性远远大于前者。初步的构效关系研究表明: 在4-位苯胺基的对位有较大取代基; A环打开并甲基化; 4′-去甲的化合物具有很强的抗HIV活性。 RR1 OOR3OOORO3O O HCOOCH33 OCHHCOOCH333 9 R= HOR2 10 R= OCH27~343 图 4 脱氧鬼臼毒素和鬼臼毒素A环修饰化合物 Figure 4 Depodophyllotoxin and A ring modified Compounds 表 1 A环修饰化合物的细胞毒活性 Table 1 Compounds of A ring modified and Cytotoxicity EC IC 5050IT Compd. RRR1 2 3 (g/mL) (g/mL) CHH 4.30 9.57 2.23 27 3 OH CH3 CH3 0.389 7.53 19.4 28 OH CH3 CH3 2.45 5.29 2.16 29 NNO2H CH3 CH3 0.151 1.43 9.5 30 NFH H CH3 <0.001 0.158 >158 31 NNO2H H CH3 <0.001 0.166 >166 32 NFH 8 H CH3 <0.001 0.141 >141 33 NCNH H CH3 <0.001 0.120 >120 34 NCOEt2H 2.2 C环的修饰 2.2.1 4-位酯、胺、磺酰胺等衍生物 在所有对PPT结构修饰改造中，C环的修饰是最多也是成果最丰富的。修饰主要集中在C-4位，通过取代反应生成一系列β-型衍生物如醚类、硫醚类、酯类、 [65~71]和含硫杂环类等;4-位羟基氧化成酮后与肼、羟胺作用胺类、酰胺类、含氮 [72,73]生成腙、肟等。 [74]Raffele等用甲基三氧化铼(MTO)催化，采用一锅煮的方法制备了一系列C,D及E环不同程度氧化的产物。其中C环4位羟基被氧化成酮和内酯环开环的衍生物37 (图5)有很强的TOPO?抑制活性。 HH OOOOCHOHC3O3OOOOHHOHOOOHOHOCOCH3OOOOHOCOOHOO OO MeOOMeCOOCHHCOOCHH3333OMeOHOH373536 图 5 Etoposide在体内水解失活的产物 Figure 5 Hydrolyzed and epimerized derivative of Etoposide 自从发现了4β-N取代的PPT衍生物具有很强的生物活性以后，一大批4β-N [35]取代的PPT类似物被合成出来，而且很多都具有相当好的活性。Zhu XK 等 [75]利用改进的kuhn法制备了一系列4β-芳胺PPT衍生物，抗HIV活性实验表明 9 化合物38、39、40(图6)的活性最强。作者将这些化合物与27~34比较，得到了PPT衍生物抗HIV的构效关系。 [76]Kamal等合成了一些4β-酰胺和磺酰胺类PPT衍生物，并将所合成的化合物对六种肿瘤细胞进行活性筛选，发现4β-苯磺酰胺基PPT 20对六种肿瘤细胞都有很强的活性。20对六种细胞的GI都小于0.02μM，最低的<0.004μM 50 (HT29)，而与它对应的4′-去甲衍生物41(图 6)活性却很差，对六种细胞的GI50都大于11.2μM，最高的>42μM (MCF7)。 [77]Dominique 等也合成了一系列4′-去甲-4β-磺酰胺类PPT衍生物包括脂肪磺酰胺、芳香磺酰胺(包括一些杂环)和氨基磺酰胺(图6)，并研究了它们对DNA TOPO?的抑制作用。结果表明脂肪磺酰胺衍生物中甲基磺酰胺42的活性最强，总体趋势是随着脂肪链的增长活性下降。芳香磺酰胺(包括一些杂环)的活性都较弱,而氨基磺酰胺例如含有吗啉环的43、44和含有哒嗪环的45表现出很好的活性(Table 2)。从这些报道可以看出磺酰胺基团的存在有助于提高PPT衍生物的抗肿瘤活性。 N3NHSOR2ORR1OOPhMe40OOPhH41OOMeH42O-N(Me)H243 H44NOMeOOMe MeOOMeOR45MeHNNOR38 R=CH13 39 R=H, b-N3 图 6 鬼臼毒素的磺酰胺类衍生物 Figure 6 Derivatives of Podophyllotoxin of Sulfamides and its Precursors 表 2 化合物42~45的拓扑酶抑制活性 10 Table 2 Activity of compound 42~45 inhabitation of human DNA TOPO? a b c (μM)Cell cycle effectTOPO?ICcompd 50 (%linear DNA) 50 0.830 80% (2.5μM)) Etoposide 50 0.070 77% (0.5μM) 42 44 0.037 66% (0.25μM) 43 31 0.100 76% (0.25μM) 44 45 0.048 84% (0.1μM) 45 a每个值都是平行三组实验中居中的一个，药物浓度50μM。 b对L1210的抑制中浓。c所示浓度下L1210细胞停留G2+M阶段的比例。 [78,79]Zhu等研究报道了4位连有杂环的PPT衍生物能够提高生物活性，同时 [80]也能克服Etoposide的一些缺点，并合成了化合物46、47(图 7)。Kamal等通过PPT与红磷/碘在不同的溶剂中反应，得到4β-碘代衍生物，然后再与氨基嘧啶或氨基苯并噻唑反应制备了4β-嘧啶和苯并噻唑的PPT类似物48~51(图 7)。同时对六种肿瘤细胞进行了体外抗肿瘤活性测试，结果显示49的活性较好，对六种肿瘤细胞GI都小于10.4nM。 50 11 1RR N46H S NHNRH47 NOH O NO49MeOSF NMe48MeOOMeS 1ClOR NH46~5150 NCH3 N51 HHCSNCl3 图 7 含有杂环的鬼臼毒素衍生物 Figure 7 Derivatives of podophyllotoxin contain heterocyclics [81]很多不饱和脂肪酸(FA)具有防癌抗癌的作用，在化疗时多吃含脂肪酸丰富的食物有助于减少化疗药物的副作用。为了降低PPT类抗癌药物的毒副作用， [82]Marcel等将一些不常见的脂肪酸与PPT的4-OH相连和成了含有三键、呋喃环、环氧等官能团的化合物。 [83~85] Mustafa等也合成了一系列脂肪酸与PPT的4-OH相连的衍生物，其中含有末端羟基链长为10个C的52(图,)及含有4个顺式双键的53(图,)对五种肿瘤细胞(SK-MEL, KB, BT-549, SK-OV-3,和 HL-60)都有很好的抑制作用。 在54的基础上该研究小组又制备了亲脂性根强的衍生物和含有F、N、S原子的衍生物。活性研究发现前一类衍生物对四种肿瘤细胞活性都不高，而且对实体肿瘤都没有活性，但是值得注意的是55~57(图8)既表现微管抑制活性又表现 12 TOPO?抑制;后一类衍生物对五种肿瘤细胞的活性试验发现含硫的化合物58、59具有很强的活性。总体来看，这些衍生物的活性都没有PPT高，但是细胞毒性试验发现这些化合物(最高15μM)对正常细胞都没有毒害作用，而PPT的细胞毒性很强，这一点尤其值得关注。为了搞清其作用机理，他们进一步对54进行抗 [86]癌机理的研究，发现这种抗癌作用虽然发生在细胞循环的G/M时期，却不是2 抑制微管形成而是抑制TOPO?，但是又不像Etoposide那样是通过稳定cleavage complex来发挥作用。 R OOOO OOOOOOCOROOO HCOOCH33HCOOCH33OCH3OCH352~5455~57R 52 n=9OHnR53CH3OH5554CHCH33 56588SOH57CH3598OHSOH 图 8 鬼臼毒素与脂肪酸结合物 Figure 8 Compounds of podophyllotoxin conjugate with FA [56]Kumar等将PPT与7个含苯环的酸结合生成酯，然后测定了这些衍生物对4种真菌(Macrophomina phaseolina, Fusarium oxysporum, Myrrotheciumverrucarria 和 Asperigillus candidus)的抑制活性，并通过活性与分子描述符构建了定量的构效关系。 13 [52]PPT及其衍生物表现出缓效的杀虫活性，Xu H等制备了一系列4β-苯酰胺基PPT衍生物，研究了这些化合物对菜青虫的杀虫活性，得到了初步的定性构效关系。测试浓度为250ppm时发现60、61(图9)第15天对菜青虫的死亡率分别为 [87]94.73?1.48%和94.95?2.86%高于母体化合物PPT。Di XD等合成了一系列4-吡啶酰氧基PPT衍生物，测定了这些化合物对菜青虫的拒食率和杀虫活性以及对淡色库蚊的杀灭活性。结果显示62~65对菜青虫的拒食率和杀灭活性都高于PPT而66~67(图9)对淡色库蚊幼虫的杀灭活性很高(浓度分别为1.66，3.96，1.54 mg/L)。4′-去甲后活性降低。 ONO62NHCROCRN63OOOONOO64OO 65ClNHCOOCHCl33HCOOCH33NOCH366OCH3 62~67N6061Cl67 ClBr 图 9具有杀虫活性的衍生物 Figure 9 Compounds with insecticidal activities 2.2.2 聚合物和接合物 聚合的药物可以起到缓释的作用，通过这种缓慢释放就可以加强药效、降低 [88,89][90]毒性甚至改变代谢的途径。Wang JQ等根据这一原理设计合成了PPT的聚合物。PPT与丙烯酰氯反应生成丙烯酰氧基PPT，然后在自由基引发剂的作用下发生聚合生成均聚物，或是加入丙烯酰胺生成共聚物，但是这些聚合物活性都不高。 14 [91]Lee NJ等也合成一类PPT聚合物，他们先合成单体68(ETPA-Gly-Gly-PPT)(图 10) 然后通过DMPC(2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮)引发聚合生成poly(ETPA-Gly-Gly-PPT)，凝胶渗透色谱测定了不同聚合度产物的平均相对量。抗肿瘤活性试验发现，这些化合物的活性都比PPT高。 OOOMeOOOHOMeNNONHOOOMe FOO68PhCH2OON5NHHNOHOHOOOOOO NHNHCOCO HNOO HCOOCHHCOOCH3333NOHOHO 6970 图 10 鬼臼毒素与其他药物结合 Figure 10 Compounds of podophyllotoxin conjugate with other drugs [92]为了增加水溶性Greenwald等将PPT通过聚乙二醇(PEG)和氨基酸(AA)连接制备二聚体(PPT-AA-PEG-AA-PPT),这些化合物都有良好的水溶性，体内抗肿瘤活性大于PPT。从这些实验结果可以看出，增强化合物的水溶性，抗肿瘤活性往往也增强。 [93~95]田瑄研究小组也合成了很多PPT衍生物，其中两类化合物抗肿瘤活性比较显著，一类是自旋标记的衍生物，从中筛选出了一些具有很好抗肿瘤活性PPT衍生物，其中效果最好的是GP-11(69)，这是一个D环开环的化合物;另一 [37,96,97]类是通过氨基酸链与抗癌药5-氟尿嘧啶(5-FU)连接的衍生物。其中大部分 15 活性都比Etoposide高或相当，例如70(图10)活性比Etoposide和5-FU 对肿瘤(HL-60 和 A-549)细胞都高，IC分别为0.04和<0.01μM。 最近该研究小组50 又报道了PPT衍生物与抗HIV药物stavudine的结合物71~75及4β-氰基化合物76和相应的水解产物77(图 11)，其抗HIV活性结果见Table 3。分析结果发现4′甲基与活性有关，去甲的73、94活性分别大于相应甲基保留的71、72，而4位的构型对活性没有什么影响。 O NHORONOOHNOMeO NHORO MeOOHOONROOO O HCOOCH33 OCHHCOOCH33stavdine3 OR'76 R= CN71~7577 R= COOH R′ 4-configuration R R-R = -CH2- CH3 4-α 71 R-R = -CH2- CH3 4-β 72 R-R = -CH2- H 4-α 73 R-R = -CH2- H 4-β 74 CH3 CH3 4-β 75 图 11 鬼臼毒素与其他药物的结合物 Figure 11 Compounds of podophyllotoxin conjugate with other drugs 表 3 化合物91~97的抗HIV活性 Table 3 Anti-HIV Activity of compounds 91~97 (μM) EC(μM) ICCompd. TI 5050 3.39 0.24 14.42 71 68.15 5.46 12.47 72 103.79 0.29 354.53 73 79.14 0.17 466.91 74 >294.55 4.39 >67.11 75 16 137.56 1.05 131.28 76 >436.68 46.90 .>9.31 77 <0.15 0.009 53.3 PPT [98]Bastow等将具有TOPO?抑制活性的抗癌药喜树碱与TOPO?抑制活性的GL331类似物通过亚胺键结合(图 12)。活性试验发现，虽然这些化合物的活性降低，但却同时具有了抑制TOPO?和TOPO?的活性。 NHN OHNONOONOONOO NOONHCOOCH33O OHHOHCOOCH33OOOHHOO7879 图 12 鬼臼毒素与喜树碱结合的结合物 Figure 12 Compounds of Podophyllotoxin conjugate with Camptothecin 研究表明结合体的活性不仅与两端的单体有关而且与连接链的种类长度有[99][100]关，Bruno等根据二硫键在碱性条件下可以交换的特性，构建了一个类似于组合化学原理的结合体库:将N-脱乙酰基硫代秋水仙素(DTC)或PPT分别通过含有二硫键的二羧酸连接形成二聚体80~83(scheme 1)，再将这四种化合物等比例溶解在丙酮中，经三乙胺催化发生交换反应，平衡后体系中存在10种化合物(4种底物和84~89) (scheme 1)。然后用高分辨质谱仪分析反应物，各种预计产物都有一定丰度，并且根据丰度的不同可以计算出每种组分的含量。这些结合物对NCI-H460细胞的抑制活性试验表明，随着链的增长PPT二聚体活性逐渐减低PPT>80>81，而秋水仙素则不太明显。 17 OOOOSSPPTPPTxnSSPPTPPTnn88 n=1, x=2 +80 n=1 81 n=280 81 O+ON(Et)3+SSDTCAcetonePPTnX 84 n=1, x=1OO85 n=1, x=2 86 n=2, x=1SSDTCDTCnn87 n=2, x=2 82 n=1OO83 n=2+ SSDTCDTCxn 89 n=1,x=2O +OMeO82O ONHDTC=83PPT=MeOOHMeO HCOOCH33 OCH3MeSO Scheme 1 2.2.3 2-位取代衍生物 C-2位的修饰主要是基于保持反式内酯环，避免或减少2-位差向异构化而进行的。研究表明，Etoposide在体内经两条途径代谢后生成活性很低的衍生物。其中差向异构化反式内酯环转变成顺式生成35活性降低100倍，而内酯环水解 [101,102]并且伴随2位差向异构化生成36(图5)活性降低500倍。 将2-H转变成其烃基、卤素等他基团，这样就可以避免顺式内酯环经烯醇式，转变成热力学更稳定的反式内酯环，进而避免代谢活性的丧失或减弱。一系列2- [103]甲基、2-氯、2-溴、2-甲硫基、2-羟基被合成出来，活性试验发现只有2-氯代衍生物对P388、L1210表现出一定的细胞毒活性。考虑到2-位取代基的大小可能 [104]会对活性产生影响，VanVliet等合成了一系列2-F代的衍生物(图13)，并对 18 四种肿瘤细胞(KB、CACKI-1、A549和CMF)细胞毒活性实验，发现90对KB [105]细胞的活性最强，GI约为30nM。但总体来看2-F代的活性都不好。Laatsch等50 合成了一系列2-烷基取代的衍生物(图14)，但对三种肿瘤细胞(L1210、HT29、A549)活性都比PPT低(Table 4)。 ORR23 OHNOR3OOFOOp-F92OFOp-CN93HCOOCH33p-NO942OR1HCOOCH3395RRp-NH12OH2 90HH92~96963,4-OCHCHO-22CH913H 图 13二位取代的鬼臼毒素衍生物 Figure 13 Derivatives of C2 substitued of Podophyllotoxin OHOH OOONOOOOOOR1RO2OO O HCOOCH33HCOOCH33OCH3OCH3HCOOCH33RR21OCH397-CH-CH=CH100-CH-CH=CH2222 103-CH-CH=CHCH-CH=CHCH-CH981012323 -CH=CHPh-CH-CH-CH=CHPh9910222 图 14二位取代的鬼臼毒素衍生物 Figure 14 Derivatives of C2 substitued of Podophyllotoxin 19 表 4 2-位烷基取代的鬼臼毒素和表鬼臼毒素衍生物细胞毒性 Table 4 Cytotoxicity of 2-alkylated podophyllotoxins and picropodophyllin IC (μg/mL) Compd. 50 L1210 HT29 A549 0.007 0.008 0.008 PPT 4.10 5.20 6.80 97 4.60 5.10 5.60 98 4.90 5.00 5.80 99 0.40 1.10 1.40 100 1.00 1.20 1.40 101 4.80 5.10 6.70 102 >10 >10 >10 103 2.2.4 C-环其它修饰 [106][107]C环的其他结构修饰还有3α-溴代，C环的芳香化等。 2.3 D环的修饰 对D环的修饰主要有差向异构化，开环和扩环等。 为了避免2-位构型异构失活，前文已经提到了一种方法:将2位的氢取代，使之不能经烯醇式发生互变，还有就是将内酯环转变成呋喃，噻吩，内酰胺以及 [108]环酮等结构，但是这两种结构改变都导致了活性的降低或丧失。Roulland等[109,110]将原来的γ内酯转变成δ内酯，希望通过减小环张力来降低差向异构的可能，但最终只合成了扩环的顺式衍生物104(图15)，活性试验发现抗肿瘤活性降低。由构效关系推断这可能与反式内酯环转变成顺式内酯环有关。他们又制备了一系列羰基异位的δ内酯105~109(图15)。这类衍生物虽然不会发生异构，但抗肿瘤活性几乎消失，所以2位羰基的吸电子作用也可能是这类化合物保持活 [111]性的重要因素。Xiao ZY 等通过6步反应制备了D环为7员环的GL331类似物110(图15)，体外抗肿瘤实验表现出较强的活性。而该衍生物的抗肿瘤机理却不是抑制拓扑异构酶?，因此有可能代表一类新的PPT抗肿瘤类似物。(图15) 20 OH4O O2 O ONO2 O HCOOCHOH33OOORSOO ORO2-confi.4-confi.OOCHα3105β αOαCH1063 HCOOCH33βαCH1073HCOOCH33OH 108αβOCHH3 110109α104Hα 图15 D环扩大位7员环的衍生物 Figure 15 Derivatives of D-ring expanded as δ lactone [112,113]前文构效关系中提到反式内酯环是抗肿瘤活性的必须基团，但Duvvuri 的研究结果却不尽相同。他们制备了一系列D环脱羰基的衍生物，其中化合物111(图16)表现出比Etoposide更强的活性和更好的选择性，构效关系研究发现反 [114,115]式内酯环并不是保持活性必须的。Castro等也制备了一系列缺少内酯环的化合物，活性筛选发现没有内酯环的112(图 16)及其亚胺衍生物活性都很强而且选择性也有所提高。后来他们又从112出发将醛基氧化成羧基制备了一系列酯、 [116]酰胺、腈、酸酐等衍生物。对四种肿瘤细胞(P-388、A-549、HT-29和MEL-28)的细胞毒活性试验，发现这些D环开环的化合物对四种细胞的抑制差别不大，说明112醛羰基被氧化后原有的选择性丧失。尽管这些衍生物的活性都比PPT和112要低，但仍都在微摩尔水平。 [115]化合物结构与活性之间的关系是非常复杂的，所以正如Gordaliza M所说，化合物结构的不同，其用作机制也可能不同，很难明确哪些微小的结构一定是其活性所必须的。另外不同供试肿瘤细胞、测试技术等也对试验结果产生影响。 21 ROHO OCRH1121O OOHOCOCH1133OOOArOCHAr3114 OCOCH112~1151113115 OOCOOHOHOOOOCOOHOOOArOArOAr 117116118OOHOOCHONCOOHOOOCOCH3 ArOHOArAr 120119121 ROCNEt123OCONHR2 OCOCH3124N-CH613OCOCH3OArOArMe125122123~126OMe 126OMe OMe OAr OOCONHCH613N OOCONHCH613HOOArArMeOOMe 128OMe127 图 16 D环修饰的衍生物 Figure 16 Compounds of D-ring modified 2.4 E环的修饰改变 对于E环有两点需要关注，一是E环在影响抗癌机制中起着关键性的作用, 当E环为3,4,5-三甲氧基苯基时表现为抑制微管的形成，当E环为3,5-二甲氧基 [117]-4-羟基时表现为抑制TOPO?的活性;二是这类化合物在体内的氧化代谢过 22 程中，首先被细胞色素P-450氧化成3′,4′-二酚的结构，然后再被活性氧或前列腺素合成酶将E环氧化成3′,4′-邻醌结构129(图 17)。这两种代谢产物都能与 [12]小牛胸腺DNA结合，这可能就是这类化合物表现出细胞毒性的原因之一。根 [118]据这一研究结果Zhang YL等制备了一系列4β-芳氨基取代3′,4′-邻醌结构的PPT衍生物，并研究了这些化合物抑制TOPO?活性、诱导DNA断裂活性和对KB细胞的毒性。但发现这些化合物细胞毒活性与抑制TOPO?能力和诱导DNA断裂能力没有直接的联系，同时也暗示此类化合物的细胞毒活性，除了与抑制TOPO?的能力和诱导DNA断裂能力有关外，可能还与其他机制协同作用。 [119]Castro等也将E环氧化成3′,4′-邻醌的结构，然后与二胺或烯胺缩合合成芳杂环衍生物，大部分化合物对肿瘤细胞(P-388、A-549、HT-29和MEL-28)保持了一定的活性，同时发现化合物130、131(图17)具有很好的抗单纯疱疹病毒?(HSV-2)的活性。 OHRON OOOOO OOCOOCHO3OO 130 R= H 131 R= CH3HCOOCHCOOH33CONH33OCORON Ph132 R= -CH2129133 R= -CH=CH2R R 图 17 E环修饰的衍生物 Figure 17 Compounds of E-ring modified [75]Zhu XK 等先将4′-位甲基脱去，再用酰氯选择性酯化4′-酚羟基得到化合 [120,121]物132、133(图 17)并测试了其抗HIV活性。You等从Anthriscus sylvestris中提取得到脱氧PPT并使之与三甲基碘硅烷作用得到4′-去甲脱氧PPT，然后制备了 23 一系列氨基甲酸酯，碳酸酯，和氨基酸衍生物。并研究了这些化合物对三种肿瘤细胞(A549、SK-MEL-2和MCF-7)的体外抑活制性，结果显示这些化合物都没有母体化合物高。后来该研究小组又制备了一系列与脂肪酸或脂肪二酸衍生物134~152见图18，并研究了这些化合物对A549和SK-MEL-2体内和体外细胞毒性。体外活性试验发现酸链越短活性越强(其中134~139， ED由0.003μg/ml变到50 0.013μg/ml)。链长大于16个C的143~146活性相当弱，ED>2.67μg/ml，但是二50 酸单酯表现的活性都很好(Table. 5)。体内活性则不同与体外活性，中等链长的138~142表现出较好的抗肿瘤活性。 O O O O OCHHCO33 OR O 134~152 图 18 E环修饰的衍生物 Figure 18 Compounds of E-ring modified 表 5 化合物154~172的抗肿瘤活性 Table 5 Cytotoxicities and antitumor activities of compounds 154~172 a(μg/ml) IR(%) EDCompd. R 50 A-549 SK-MEL-2 Acetyl 0.003 0.006 11 134 Propanoyl 0.004 0.010 70 135 Butanoyl 0.005 0.017 21 136 3-Methylbutanoyl 0.006 0.089 25 137 Heptanoyl 0.013 0.078 72 138 Octanoyl 0.009 0.030 45 139 Decanoyl 0.027 0.004 63 140 Dodecanoyl 0.030 0.025 57 141 24 Tetradecanoyl 0.041 0.050 36 142 Hexadecanoyl 0.268 0.290 40 143 Octadecanoyl 2.670 >5 -2 144 Eicosanoyl >5 >5 11 145 Docosanoyl >5 >5 -8 146 5-Carboxypentanoyl 0.258 0.062 50 147 7-Carboxyheptanoyl 0.175 0.066 30 148 9-Carboxynonanoyl 0.014 0.015 36 149 11-Carboxydodecanoyl 0.046 0.068 25 150 13-Carboxyundecanoyl 0.019 0.070 86 151 15-Carboxypentadecanoyl 0.106 0.027 72 152 a IR:抑制率(inhabit ratio) [122]Zavala等人报道了外消旋的脱氧异鬼臼毒素153(图 19)与PPT的活性 [123]相当，而光学纯的脱氧异鬼臼毒素却没有活性。据此Feng JH等合成了一系列外消旋的脱氧异鬼臼毒素类似物。首先从有取代苯甲醛出发合成母体化合物154~157(图 19)，然后与含有不同长度异戊二烯结构单元的卤代烃反应，制备了外消旋的脱氧异鬼臼毒素烷基醚。其中158(图 19)的活性较好对KB和BEL-7404的IC分别为3.76μM和5.63μM。含有苯环苄基醚159(图 19)抗50 癌谱比其它醚的都宽，对KB和BEL-7404的IC分别为2.65μM和14.8μM，50 这可能与苯环上离域的π电子有关。接着他们又合成了6个D环开环的衍生物[124]，其中160(图 19)的活性较好，对HL-60的IC为4.54μM效果优于Etoposide50 (IC=10.5μM)，但总体上合成的这些化合物活性都低于PPT。 50 25 OMeO OO OMeO OOR1 HCOOCHRO332 OCHOR33 (?)-153RRR123 H(?)-154HMeMeOOH(?)-155HMeHMeOCOOCH3 (?)-156OMeMeOMeH (?)-157OMeHMeMeO OMeH(?)-158CH33 H(?)-159MeBn(?)-160 图 19 E环修饰的衍生物 Figure 19 Derivatives of modified at E-ring 3 全合成 由于PPT临床需求量大(到1995年美国Etoposide的需求量增长了三倍，且仍 [14]已每年10%的速度增长)，而PPT主要是从植物中提取，所以导致生物资源的过度开发，有些鬼臼属植物濒临灭绝，已经威胁到野生植物的生存。为此人们也尝试通过其他途径来获得PPT，例如通过生物技术、酶工程、组织培养、微生物 [125]代谢等手段，但效果都不是很好。 PPT卓越而广泛的生物活性自然也使得有机合成工作者，把目光集中在通过化学的手段，利用简单易得廉价的化工原料，高效选高择性地合成PPT。但是，PPT的结构决定了这项工作的艰巨性和挑战性，如何高选择性地合成出4个连续的手性中心，以及一个对碱十分敏感的反式内酯环是摆在化学家面前的一个难题[15]。目前PPT及其衍生物的合成主要有三种途径: 26 [126~128]?串联共轭加成途径( Scheme 2)。 SPhOSPhCH(SPh)2CCHOOOBuLiO OOOOOOOCH3 OOCHC3H SPhOCH3H2SPhOCCOOOHRa-NiOOOOOOHOHOOO HCOOCH33HCOOCH33HCOOCHOCH333deoxyisopodophyllotoxinOCH3OCH3 Scheme 2 [129 ]? D-A反应途径( Scheme 3)。 CH(OMe)O2OOCH(OMe)2OOHOOHBuLiOBrArCHO OCH3 HCOOCHHCO333OCH3OCH3 DMADOHOHCH2O OOMeCO2OOOCOMe2OO1 HOCOMeO22Ra-Ni2 NOaMecet.HCOOCH3 LiBHtE33 HCOOCHOCH3333HCOOCH33OCH3OCH3epipodophyllotoxin Scheme 3 [130]?氧代酯途径( Scheme 4)。 27 OHCHCOCCOCHCHOCH3222233OBrCOCHCHO2231. BuLiOCOCHCH+223O2. FCCOH32Br 3. PCCHCOOCH33HCOOCHOCH333OHOCH3O OilH(t LA-BuO) KOHO O DA1.L3OOHHB2. rHCOOCHO33O(epimerriationzOOCH3Onemt)d tlionadehyaOOOO HCOOCH33HCOOCH33OCH3OH epipodophyllotoxin Scheme 4 虽然已经报道了很多关于PPT及其类似物的合成方法及策略，但是由于步骤多，产率一般都很低，很难有实际应用价值。而不对称合成的发展使得近年来 [11,131~133] [134][135]PPT的合成有了新进展。最近Wu YM 和Ulrike Engelhardt的报道十分令人鼓舞。他们都将反应缩短到12步，前者合成PPT终产率29%，后者合成表鬼臼毒素(EPPT)终产率30%。 Wu YM等从6-溴胡椒醛(161)出发(见Scheme 5)经保护得162，162在Pd(OAc)催化下与丙烯酸叔丁酯发生Heck反应得到α,β-不饱和酯163，接下来2 163经共轭加成再烷基化的串联反应，即芳基锂与163发生1,4-共轭加成接着再加入烯丙基溴，反应得到一种非对映异构体164和少量的1,2-加成产物。这一步是反应的关键所在，反应合成出C1-C2顺式的中间体。164经脱保护，OsO和4NaIO氧化得到165，165在L-脯氨酸催化下发生醛醇缩合只得到一对非对映体4 (C4-α:β,1:1)166，由于该产物在硅胶柱上分解，所以不经分离直接将产物C4-OH氧化位成酮167，脱保护，大位阻还原剂LiBHEt还原得到唯一4α构型3 28 的产物。最后分子筛催化分子内酯交换形成PPT。该路线的亮点所在就是通过串联共轭加成再烷基化合成出C1-C2顺式的关键中间体，避开了其他串联共轭加成途径以生成C1-C2反式的难题。 Ulrike Engelhardt所设计的高立体选择性合成表PPT尤为精巧，每一步的ee值都在95%以上。反应从胡椒醛出发先合成萘母核，接下来引入手性辅助剂，在手性辅助剂的作用下与芳基锂共轭加成生成C1-C2反式中间体(ee值96%)，后在4位引入β-羟基(ee值97%)。接下来一步则是该路线的关键步骤,如何立体选择区域选择性地在3位引入羟甲基，作者通过在4位的β羟基的辅助下利用自由基反应成功地完成该步反应(ee值97%)，最后分子筛催化环生成EPPT，终产率30%。 虽然手性合成将PPT全合成步骤缩短产率提高，但是到目前为止，由于所用试剂昂贵很找到哪一种可用于大规模生产的方法。 29 OOO CHCHCHOOOOPhP ,Pd(OAc)p-TsOHO32OBu-tHOOHOOBu-tOOBrBr163O162OBuLiO161OBrArCHOOOBu-tO OCH1. p-TsOHOO4rie1. L-polnO2. OsO4OOBu-tHH3. NaIONaB 2.H4MeOOOMeOHOHOMeOMeOOMe165 OMe1 .MnOOBu-t164O 2. HClOH2OOOHO OOMeOOMeOOMeOMeOO1. LiBHEt3166O2. Molecular Sieves HCOOCH33 MeOOCH3OMe OMePPT167 Scheme 5 结论与展望 PPT虽然具有很强的体外抗肿瘤活性，可是由于其严重的毒副作用，很难作为临床药物用于抗肿瘤一线。但是该化合物却是一个非常好的抗癌药物先导化合物，其半合成化合物VP-16，VP-26是临床上非常重要的抗癌药物。对PPT的修饰改造导致了许多鬼臼类衍生物的出现，由PPT合成的一些磺酰胺类衍生物具有非常好的活性，而与脂肪酸结合成的酯选择性很好。合成衍生物的新方法也不断出现，例如利用二硫键在碱性条件下互换可以建立一个庞大的化合物库，从中筛选寻找抗肿瘤药物。随着研究的不断进行PPT的活性谱还有可能不断扩大，近年来将PPT用于抗HIV方面的研究正向着有实际应用的方向发展。此外这类衍生物还可以用于抗利什曼病(Leishmaniasis)，抗真菌等。 30 虽然将近半个世纪以来人们在PPT及其衍生物上做了很多工作，也取得了 丰硕的成果，但是该类药物诸如水溶性差，生物利用率低，代谢失活，产生抗药 性等问题仍然没有得到很好的解决。所以对于PPT的修饰改造，活性开发还将 不断进行。随着这方面研究数据的不断积累，构效关系的明确，通过合理的设计， 再加上人们对PPT不减的兴趣。相信将会有更多活性好的PPT衍生物被设计合 成出来。 致谢 参考文献 [1] 刘长军; 侯嵩生. 天然产物研究与开发, 1997, 9 : 81~89. [2] Imbert, T. Biochimie, 1998, 80: 207~222. [3] Hartwell, J. L.; Schrecker, A. W. J. Am. Chem. Soc., 1951, 73: 2909. [4] Schrecker, A. W.; Hartwell, J. L. J. Org. Chem., 1965, 21: 381~382. [5] Gensler, W. J.; Gatsunis, C.D. J. Am. Chem. 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