【word】 响应面设计优化醋酸杆菌产乙醇脱氢酶发酵培养基

【word】 响应面设计优化醋酸杆菌产乙醇脱氢酶发酵培养基 响应面设计优化醋酸杆菌产乙醇脱氢酶发 酵培养基 酿酒科技2010年第7期(总第193期)?LIQUOR—MAK/NGSCIENCE&TECHNOLOGY2010No.7(T o1.193) 响应面设计优化醋酸杆菌产乙醇脱氢酶发酵培养基 肖仔君,黄国清,钟瑞敏 (广东韶关学院英东食品科学与工程学院,广东韶关512005) 摘要:利用响应面分析法优化醋酸杆菌产乙醇脱氢酶培养基.在单因素试验的基础上,采用Box—Be~.ken中心 组合试验设计.选定碳源,氮源和生长因子3个因素为响应因子,以乙醇脱氢酶的酶活为响应值建立二次回归方程, 相关系数R2=o.9652,在分析各个因素的显着性和交互作用后,确定了醋酸杆菌产乙醇脱氢酶最优的培养基,即碳源 15.1g/L,氮源7.0g/L,生长因子272.5mI/I,,在此条件下,乙醇脱氢酶活力理论响应值为0.352U/mL,验证值为 0.349U/mL. 关键词:醋酸杆茵Acetobac~rsp.CCTCCM209061;乙醇脱氢酶;响应面;培养基优化 中图分类号:Q93—3;Q55文献标识码:A文章编 号:1001—9286(2010)07—0017—04 OptimizationofFermentationMediumforAlcoholDehydrogenaseProduced fromAcetobactersp.CCTCCM209061byResponseSurfaceMethodology XIAOZiqun,HUANGGuo.qingandZHONGRui.min (FoodScienceandEngineeringCollege,ShaognanCollege,Shaoguan,Guangdong512005,China) Abstract:FermentationmediumforADHproducedfromAcetobactersp.CCTCCM209061wasoptimizedbyresponsesurfaceanalysis(RSA). Basedonsinglefactorexperiment,threefactorsincludingcarbonsource,nitrogensourceandgrowthfactorswereselectedasresponsefactorsby useofBox?-Behnkencenter-compositeexperimentaldesignandenzymeactivityofADHwasusedasresponsevaluetoestablishthequadricre?? grcssioneuation(theco.elationcoefficientR2=0.9652).TheoptimumfermentationmediumforADHproductionfromAcetobac~rsp.CCTCC M209061wasdeterminedasfollowsthroughtheanalysisofthesignificanceandtheinteractionofeachfactor:15.1g/LcarbonSOurce,7.0g/Lni- ~ogensource,and272.5mL/Lgrowthfactor.Undertheaboveconditions,thetheoreticalvalueoftheenzymeactivityofADHwas0.352U/mL andtheverifiedvaluewas0.349U/mL. Keywords:Acetobactersp.CCTCCM209061;alcoholdehydrogenase(ADH);responsesurface;~rmentationmediumoptimization 乙醇脱氢酶(AlcoholDehydrogenase,ADH)是生物 体内重要的氧化还原催化剂之一,是一种广泛专一性的 含锌金属酶,能够催化乙醇氧化生成乙醛,乙醛经乙醛脱 氢酶(Aldehydedehydrogenase,ALDH)继续氧化生成乙 酸[1].随着生物技术的发展,乙醇脱氢酶在生物催化,生 物医学和工业生产等领域都有较为广泛的应用.例如. 利用乙醇脱氢酶作为生物催化剂合成一些原料以及中 间产物回:可以利用检测血清中乙醇脱氢酶的活性来诊 断肝脏疾患t3];利用含有乙醇脱氢酶的微生物进行果酒, 果醋的生产【4.习;在食品工业中,借助于乙醇脱氢酶氧化 的产物乙醛与单宁作用,去涩退廿【6】. 目前.在动物,植物,微生物,真核生物以及原核细菌 中都已发现醇脱氢酶,且在微生物中广泛存在.由于微生 物的发酵周期短,培养基廉价,以及酶制剂可以实现大规 模的生产,因此.从微生物细胞中提取ADH并制成酶制 剂具有广阔的市场前景. 发酵培养基的优化是提高ADH产量,降低生产成 本的重要途径之一.响应面分析法(RSA)是综合试验分 析和数学建模最经济合理的试验,采用多元二次回归方 程来拟合因素与响应值之间的关系,对影响产量的各因 子水平及其交互作用进行优化与评价.并在一定的范围 内求出最佳值.本试验利用Box—Behnken响应面分析 法对筛选得到的1株高产ADH的醋酸杆菌的培养基进 行了优化. 1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1菌株与培养基 菌株:醋酸杆菌(Acetobactersp.)CCTCCM209061, 韶关学院英东食品科学与工程学院食品微生物教研室. 基金项目:广东省科技攻关项目(项目编号:2009B0203120l7),韶关市科技项目(项目编号):韶科[2009]80. 收稿日期:2010-05—12 作者简介:肖仔君(1973一),男,主要从事食品生物技术和生物催化与生物转化的研究. 通讯作者:黄国清. 酿酒科技2010年第7期(总第193期)?LIQUOR—MAK/NGSCIENCE&TECHNOLOGY2010No.7(T o1.193) 基础培养基:葡萄糖10g/L,蛋白胨10g/L,pH6.0, 西红柿汁50JnL/LfV/v),于121?灭菌20min. 斜面培养基:西红柿汁50mL/L(v/v),琼脂l5g/L, 葡萄糖10gIL,酵母浸膏10g/L,蛋白胨10g/L,于 121?灭菌20min 1.1.2仪器和设备 超声波细胞粉碎机(JY92一II,浙江宁波);紫外可见 分光光度计(721型,上海棱光);超净工作台(sw—CJ一 2FD,苏州),培养箱(PYX一250Z—B,科力)等. 1.1-3试剂 酵母浸膏,蛋白胨购于广东环凯生物有限公司,其他 试剂均为分析纯. 】.2试验方法 1.2.1醋酸杆菌培养 将醋酸杆菌菌株接种于斜面基础培养基.在30?恒 温培养箱中培养48h,再将醋酸杆菌株接于液体基础培 养基,于30?恒温摇床中培养24h. 1.2.2醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的单因素试验 ?不同碳源对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响 分别用10g/L葡萄糖,5g/L蔗糖,5g/L麦芽糖和 5g/L乳糖替代基础培养基中的碳源,其他成分不变,以 5%的接种量将醋酸杆菌分别接人各种不同碳源的培养 基中,30?,150r/min培养24h,在600nin下测其OD 值,并取50mL发酵液离心后,提取粗酶液,测其酶活, 研究不同的碳源对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶培养基的影 响. ?不同浓度的碳源f葡萄糖)对醋酸杆菌产乙醇脱氢 酶培养基的影响? 配制含不同浓度(2g/L,5g/L,10g/L,15g/L,20g/L) 的葡萄糖,基础培养基中其他成分不变,以5%的接种量 将醋酸杆菌分别接人含有不同葡萄糖的浓度的培养基 中,30?,150r/min培养24h,在600nln下测其OD值, 并取50mL发酵液离心后.提取粗酶液测酶活.研究不 同浓度葡萄糖对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶培养基的影响. ?不同氮源对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响 分别用10g/L蛋白胨,10eyE酵母浸膏,混合氮源 (5g/L蛋白胨与5g/L酵母浸膏,10g/L蛋白胨与10g/L 酵母浸膏)替代基础培养基中的氮源,基础培养基中其他 成分保持不变.以5%的接种量将醋酸杆菌分别接入各 种含有不同氮源的培养基中,30?,150r/min培养24h, 在600nrn下测其OD值,并取50mL发酵液离心后,提 取粗酶液.测其酶活,研究不同的氮源对醋酸秆菌产乙醇 脱氢酶培养基的影响. ?不同浓度的生长因子对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶培 养基的影响 配制含不同浓度,50mL/L,100mL/L,200mL/L, 300m饥,400mE/L)的西红柿汁,混合氮源(5g/L蛋白 胨与5g/L酵母浸膏),基础培养基中其他成分不变.按 照5%的接种量将醋酸杆菌分别接人含有不同浓度西红 柿汁的培养基中,3O?,150r/min培养24h.在600nm 下测其OD值,并取50mL发酵液离心后,提取粗酶液. 测其酶活,研究不同浓度的西红柿汁对醋酸杆菌产乙醇 脱氢酶培养基的影响. 1.2.3产乙醇脱氢酶培养基优化试验设计 在单因素试验的基础上,采用Box—Behnken中心组 合试验设计原理,选定碳源,氮源和生长因子3个因素为 响应因子(1),乙醇脱氢酶的酶活为响应值,通过数据 分析确定产乙醇脱氢酶最优培养基. 表1试验设计的因素与水平 1.2.4乙醇脱氢酶粗酶液的制备[8] 取培养对数期(24h)细胞培养液在3000r/min离心 25min,沉淀用pH8.0,20mmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤 3次,收集湿菌体细胞.称取6g湿菌体细胞,以固液比为 1:5悬浮于pH8.0,20mmol/L的磷酸盐缓冲液.在冰水 浴中进行超声破碎(2O0W,4sx90次,间隙5s),再进行 离心(6o0or/min,15rain,4?)除去细胞碎片,细胞碎片 再超声处理1次,同条件下离心,合并2次破碎离心后的 上清液即ADH胞内粗酶液.合并后的上清液加入饱和 度100%的硫酸铵溶液.得到40%,70%饱和度的硫酸 铵溶液,在4?下静置2h.将硫酸铵沉淀后的溶液离心 (8000r/rain,20rain,4?).倒出上清液,沉淀用适量的 0.1mol的磷酸缓冲液(pH7.4)溶解并装入已处理过的透 析袋中,透析袋浸入0.1mol/L的磷酸缓冲液(pn7.4)中, 每隔1,2h换1次透析袋外的缓冲液,最好静置定容至 50mL,测其蛋白质含量和ADH的活力. 1.2.5乙醇脱氢酶活性的测定【 参照WOOD氏法,取0.5mLMcllvaine缓冲液pH 4.0,10%TrironX一100溶液0.1mL,1.0mol/L乙醇溶液 0.1mL,粗酶液0.2mL.0.1mol/L铁氰化钾溶液0.1mL 于25mL比色管中,25?保温5min,然后加入硫酸 铁一Dupanol溶液0.5mL,加入3.5mL蒸馏水混合后, 在25?条件下放置20min(同时做空白对照)后,用722 型紫外分光光度计测定660nlll处光密度. 酶活力单位定义:在上述OD值条件下.lmin氧 化li~mol的乙醇为1个酶活力单位:4.0光密度等于氧化 llxmol的乙醇. 2结果与讨论 2.1醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的单因素试验 肖仔君,黄国清,钟瑞敏?响应面设计优化醋酸杆菌产乙醇脱氢睦垒壁鲞叁 2.1.1不同碳源对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响 选用发酵工业常用的碳源,以相同的含碳量(1%)为 ,30?培养24h,获得湿菌体细胞,破碎后测酶活, 其结果表2. 表2不同碳源对醋酸杆菌菌体生长及产酶的影响 由表2中的结果可以得出,培养基中的碳源对醋酸 杆菌ADH的活性和菌体生物量的影响很大.以葡萄糖 为碳源时,1mL发酵液中细胞酶活较高,菌液的OD值 也相对高,因此,以葡萄糖作为碳源进行后续的研究. 2.1.2不同浓度葡萄糖对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响 以葡萄糖为碳源时,控制培养基中起始碳源分别为 2gm,5g门L,10g/L,15gm,20gm,30?培养24h,获得 湿菌体细胞,破碎测酶活,其结果见表3. 表3葡萄糖浓度对醋酸杆菌菌体生长及产乙醇脱氢酶的影响 表3结果表明,在所考察的碳源浓度范围内.随着培 养基中碳源浓度的不断增大,醋酸杆菌在600nlrl下的 OD值增大.但在碳源浓度为5,20gm范围,1mL发酵 液中的酶活变化不大. 2.1.3不同氮源对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响 表4为不同氮源对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响结 果.由表4可以看出,复合氮源比单一氮源对醋酸杆菌的 OD枷值和酶活的影响较大. 表4不同氮源对醋酸杆菌菌体生长及产酶的影响 2.1.4生长因子对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响 在前期的研究中,当培养基中添加西红柿汁时.对醋 酸杆菌产乙醇脱氢酶有较大的影响.因此,研究了培养基 中添加不同浓度的西红柿汁对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶活 力的影响,结果见表5. 由表5可以看出.在所考察的西红柿汁添加量的范 围内,随着西红柿汁添加量增加,600nn’l下醋酸杆菌的 OD值随之增大,但与没有添加西红柿汁的相比,添加生 表5添加不同量的西红柿汁对醋酸杆菌生长 及其产乙醇脱氢酶的影响 长因子后的培养基中乙醇脱氢酶的活力有所增加. 2.2响应面法优化醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的培养基 响应面分析法是一种寻找多因素系统中最佳条件的 数学统计方法,其中最常用的是Box—Behnken的中心组 合设计原理,根据此原理,以脱氢酶酶活为响应值选取葡 萄糖,氮源(酵母浸膏:蛋白胨按照1:1的方式)和西红柿 汁3个对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶影响较大的因素,设计 了3因素3水平共17个试验点的响应面分析实验.其具 体实验及结果见表6. 表6醋酸杆菌产乙醇脱氢酶培养基响应面分析方案及结果 根据实验结果.对实验数据进行多项拟合回归,以乙 醇脱氢酶的比活力为因变量,以碳源葡萄糖,氮源(酵母 浸膏:蛋白胨为l:1),生长因子西红柿汁为自变量建立回 归方程:Y=0.32+0.022A+4.75×10一B+0.026C一0.015 AB+5.75X10_3AC一5.500xl0—3BC一0.042A2—0.012B一 O.02C;并对回归方程进行方差分析.结果见表7. 该方程表达了脱氢酶酶活与所选的3个因素之间的 关系.回归方程的决定系数R2为0.9652.当”Prob>F” 值<O.05,即表示该项指标显着,”Prob>F’’值<0.01,即 表示该项指标高度显着.从表3的分析结果来看,乙醇脱 氢酶与试验中3个因素的回归方程的F值为21.56,方程 显着.整体模型的”Prob>F”值<0.001,表明该二次方程 模型高度显着.西红柿汁和葡萄糖对醋酸杆菌产乙醇脱 酿酒科技2010年第7期(总第193期)?LIQUOR,MAKINGSCIENCE&TECHNOLOGY2010No.7(To1.193) 表7回归方程各项的方差分析 注:+为显着(Prob<0.05);?为高度显着(Prob<0.01). 0.00 糖 图1响应面法(A,B)立体分析图 图2响应面法(A,C)立体分析图 00 图3响应面法(B,c)立体分析图 氢酶影响高度显着,氮源(蛋白胨:酵母浸膏)影响不显着, 交互项中碳源与氮源交互显着,二次项中,碳源影响高度 显着,生长因子影响显着.在所选取的各因素水平范围 内,按照对结果的影响排序为:西红柿汁>葡萄糖>氮 源,同时,图1,3直观地反映了各因素交互作用对响应 值的影响.比较3组图可知,生长因子(西红柿汁)对醋酸 杆菌产乙醇脱氢酶的影响最为显着,表现为曲线较陡:其 次是碳源和氮源;失拟项p>0.05,表明该方程可以接受, 可以利用该回归方程确定最优的产乙醇脱氢酶的培养基 成分. 2-3醋酸杆菌产乙醇脱氢酶培养基成分的确定 通过软件Design—Expert7.0求解方程,给出了产乙 醇脱氢酶最优培养基组成为:葡萄糖15.080g/L,氮源 (蛋白胨和酵母浸膏)7.043gm,西红柿汁272.500mL/L, 此时醋酸杆菌中乙醇脱氢酶的酶活为0.352I『/mI,.考虑 到实际操作的局限性,培养基中的各种成分修正为:葡萄 糖15.1g/L,氮源(蛋白胨和酵母浸膏)7.0eel,西红柿汁 272.5mL/L.为检验结果的可靠性,将醋酸杆菌接入到修 正后的培养基中于相同条件下培养,破碎细胞后,测其酶 活为0.349U/mL.与理论预测值基本吻合.因此,可利用 响应面分析法得到乙醇脱氢酶. 3结论 应用Box—Behnken中心组合实验设计方法,优化了 醋酸杆菌发酵生产乙醇脱氢酶的培养基.结果表明,醋酸 杆菌产乙醇脱氢酶的最优培养基为:葡萄糖l5.1g/L,氮 源(蛋白胨和酵母浸膏)7.0,西红柿汁272.5mL/L. 参考文献: [1]SunH.,PlappB.Progressivesequencealignmentandmolecular evolutionoftheZn-containingalcoholdehydrogenasefami~ 535. 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