在药用植物研究领域中分子生物学技术的应用

在药用植物研究领域中分子生物学技术的应用 在药用植物研究领域中分子生物学技术的 应用 摘要:对近年来分子生物学技术在药用植物研究工作中的应用现状进行了综述,并对主要的技术与及分子生物学在开展药用植物研究方面的优势和应用前景进行了阐述。 关键词:药用植物;分子标记;基因 The application of biological technology in the research of medicine-plants Abstract: This thesis summarized the application of biological technology in medicine-plants, and illustrates main, and methods, it showed that the superiority and broad applied aspects in developing the research of medicine-plants. Key words: medicine-plants; molecular genetic marker; gene project 分子生物学是第二次世界大战后,由生物化学、遗传学、微生物学、病毒学、结构及高分子化学等不同研究领域结合而形成的一门交叉科学。目前分子生物学已发展成生命科学中的带头学科。医药理论与分子生物学虽属两种不同的体系,但两者科学研究的生命活动物质基础是一致的。因此,从分子水平研究药用植物,推动中西医结合,促进医药学的发展和防病治病具有重大的意义。药用植物在我国有10 000多种,其中常用中药约600多种,是我国人民防病及治疗的重要手段,同时是寻找和开发新药的基础。传统中药和天然产物的开发和利用受到越来越多的重视。应用分子生物学技术对药用植物进行研究开发和利用,将促进医药学研究的进一步深入。下面简单综述分子生物学技术在药用植物研究中的应用情况。 1分子生物学技术在药用植物优良品种培育中的应用 药用植物的基因与转基因工程可以改变传统遗传性状,培育优良品种,提高有效生药成分含量,增强植物抗病毒和抗虫害的能力[1],还可以保护和繁殖濒临灭绝的植物材料[2]。运用植物转移病毒的外壳蛋白基因,利用植物病毒的卫星DNA基因及反义RNA等方法,实现药用植物抗病毒能力的提高,如易感染烟草花叶病毒的白花曼陀罗、八角莲等,可用此项技术提高植株的抗病毒能力。转抗虫害的δ内毒素基因得到抗虫害的植物,对于保护花、果入药的药用植物有重要意义。转基因器官和组织研究是近几年我国中药研究中比较活跃的领域之一。现有青蒿、黄芪、丹参、决明等10多种药用植物的发状根诱导成功并建立了培养系统[3]。胡之璧等[4]应用植物细胞培养技术进行洋地黄培养细胞的生物转化研究,筛选出高产细胞并获相当好的遗传稳定性。在甘草毛状根培养物中检测到高于正常培养物含量的黄酮类化合物[5,6],且已培养出抗癌活性成分三尖杉酯含量高于原植物的三尖杉培养细胞[7]。国外转基因获得成功的药用植物已达8种,其中紫草和人参已达规模[8]。基因工程与有机合成相结合,可生产中药和发现新的先导物,是缓解药源紧张的有效手段。药用植物中重要酶基因的克隆、重组,可从根本上提高其有效次生代谢产物的含量,获得稳定的生产植株。我国现已克隆出青蒿素生物合成途径中的关键酶基因,东北红豆杉中紫杉醇生物合成途径中起限速作用的紫杉烯合成酶基因等其他相关基因[9];Wildung等人成功利用PCR(DNA聚合酶链式反应,Polymerase Chain Reaction)技术克隆到该酶的cDNA片段,该片段由2 586个核苷酸组成,把该cDNA片段导入红豆杉细胞后,将影响紫杉醇含量。还可以利用反义核酸技术,用反义 DNA或RNA片段导入植物细胞,控制某一代谢途径上关键酶的活性,从而使成分含量提高,如用反义技术调节亚麻植物(Linum flavum)毛状根中肉桂醇脱氢酶活性,抑制木质素的合成,使主要抗癌活性成分5-甲基鬼臼素含量提高[10]。 2在药用植物研究中DNA分子标记技术的应用 DNA分子标记技术也称DNA分子鉴别技术,是分子生物技术的主要技术手段。它通过直接分析遗传物质的多态性来鉴别生物内在核苷酸排布及其外在性状表现规律的技术。包括RAPD(随机扩增多态性DNA)、AFLP(限制性内切酶酶片段长度多态性分析)、SSR (简单序列重复)、DNA序列标记等分子生物技术。随着中药资源及分类鉴定研究的不断深入,新种不断发现,新种的确立常有异议,同一物种分类地位经常变动,给正本清源及一系列的研究带来困难通过DNA水平的分析研究确定药用植物间的亲缘关系,借助计算机建立数据库,绘制系统发育框图,使植物分类和资源的研究更加科学化。通过DNA标记辅助性状选择,指导药用有效成分方便、快捷、正确地寻找与开发利用。 2.1 RAPD分子标记技术 RAPD(随机扩增多态性DNA, Random Amplified Polymorphic DNA)是指用合成的较短的单个随机引物,以药材总DNA为模板,在DNA聚合酶作用下,进行非特异性的聚合酶链式反应,分析扩增产物电泳图谱在不同类群中的变异,扩增片段具有品种、品系特异性。任冰如等[11]用RAPD技对南、北苍术不同居群间的亲缘关系作了鉴定,从DNA水平上证实了南、北苍术亲缘关系很近,差异很小。为后者的观点提供了有力的证据。徐朝晖等[12]在用TLC法(薄层色谱法,Thin Layer Chromatography)不能有效区分的情况下,成功地用该技术将牛蒡子及其5种常易混淆的毛头牛蒡、大翅蓟、水飞蓟、云木香和紫穗槐的果实区分。黄璐琦等[13]应用RAPD技术对来源于13个种3个变种的天花粉及其类似品进行鉴别研究,证明RAPD技术鉴别药材具有一定的可靠性和实用价值,为解决粉末及破碎药材的鉴别提供了新的方法。曹晖等[14]采用AP-PCR(任意引物聚合酶链反应,Arbitarily Primed PCR)和RAPD方法扩增菊科植物地胆草、白花地胆草和假地胆草以及商品药材苦地胆的基因组,获得可靠的DNA指纹图谱。Cao等[15]采用RAPD方法扩增蒲公英(Taraxacum mongolicum)及6种土蒲公英混淆品的基因组DNA,获得清晰可靠的DNA指纹图谱,根据琼脂糖凝胶上显示的DN带型差异可鉴别蒲公英和土蒲公英混淆品。RAPD技术在药用植物领域的应用还包括:人参属(Panax)12种植物的ITS区及5.8srRNA基因区序列分析[16];OPD-2和OPE-2引物进行RAPD扩增,获取甘草属4种药用植物指纹图[17,18];通过对中药白芷种质资源的RAPD分析,确定祁白芷、禹白芷、杭白芷和川白芷同属一类群与野生白芷有一定区别[19];木蓝属8种生药的RAPD研究[20]等方面,均取得了令人满意的结果,对实际科研工作的开展提供了一定的理论依据。 2.2 RFLP分子标记的应用 RFLP(限制性片段长度多态性分析,Restriction Fragment Length Polymorphism)是指DNA经限制性内切酶酶解后,产生若干个不同的小片段,其数目和每一片段长度反映了DNA限制性位点的分布。RFLP技术首先在研究人类基因组中发展起来。日本千叶大学山崎真[21]己采用RFLP技术分析了羽扇豆属(Lupinus)5种药用植物的亲缘关系;以BamHI,Dral,Ecol,Hinfl 和HcolI酶解后与水稻rDNA基因pRR217进行分子杂交和RFLP指纹图分析,建立其亲缘关系树,结果发现富含甘草甜素(Glycyr rhizin)的品种光果甘草和甘草之间遗传关系非常相近,两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远,与传统植物分类研究结果吻合;Shirota等[22]采用RFLP标记有效的辨别不同化学型的大麻品系。可见,RFLP在鉴定药材的药理、药性及分子标识有效成分等方面的重大作用。 2.3其他分子标记技术 主要包括AFLP(限制性内切酶酶片段长度多态性分析,Amplified Fragment Length Polymorphism)、SSRs(简单序列重复,Simple Sequence Repeats)、DNA序列标记等分子标记技术。与RFLP、RAPD比较AFLP法构建的DNA指纹图谱重复性好、灵敏度高,充分显示了AFLP在药材鉴定中的应用价值。罗志勇等[23]运用这一技术,成功地构建出多态性丰富和重复性好的人参、西洋参DNA指纹图谱,并运用计算机软件对结果进行二维图象处理,计算出不同样品间的相似度指数,并且从相似度指数发现西洋参与引种到我国吉林的西洋参基因组DNA发生了一定的变异,但变异程度小于人参与西洋参间的差异。SSRs亦称微卫星DNA,是近几年来发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记,由于复基序的数目变化大,SSRs显示出较强的多态性。最早是在人类基因组研究中发现,在整个基因组中很丰富。这种微卫星DNA指纹技术可作为一种分子标记进行生药分析。1996年香港大学成功地运用这项技术分辨出人参与西洋参[24]。药材加工贮运过程中,DNA一般均已严重降解。因此,难于用于商品药材的鉴定。DNA序列标记对药用植物鉴别更为适宜。自日本名古屋市立大学用5srRNA基因隔区(ISR)序列分析大和当归以来,也有不少报道。如运用5srRNA-ISR基因序列分析伞形科生药[25]; rbcl基因序列分析鉴定甘草属6种药材[26]、半夏属4种药材及天南星科6种药材[27]。trnk基因序列鉴别苍术属5种药材[28];mark基因序列分析杜鹃属22种药材的亲缘关系等[29]研究工作。总之,DNA分子标记技术为药用植物的亲缘关系鉴定、单味药材的鉴别、濒危物种的保护、复方质量分析、基因定位与分离、品种鉴定、资源等方面提供了宝贵的理论根据与科学基础,使药材鉴定有强有力的技术保障,加快了整体的研究进程。 3 在珍稀濒危药用植物保护中的应用 多样性的重要任务是使种群保持足够的遗传多样性,进而保护种群未来的适应能力、扩展能力以及在自然环境下恢复重建的能力,最好的保护方法是原生境保护。长期以来,人们认为物种适应环境的能力主要取决于该物种所包含的遗传变异水平。如果物种没有一定程度的遗传多样性,该物种被认为是不能适应日益改变的环境和进化的竞争对手。目前认为,如果对濒危植物的遗传资料一无所知,要想充分保护遗传多样性就必须保护更多的居群。但保护所有的居群是不现实的,因此利用DNA分子标记提供遗传多样性信息,并通过生态学等方面的资料,确定核心样本区域,进而确定濒危植物的重点保护地点和范围。廖文芳等利用ISSR-PCR标记比较了中国特有植物华木莲的遗传多样性与物种的平均水平和同科的其他种类以及其他特有植物,华木莲遗传多样性极低。建议华木莲的保护应以就地保护为主,将华木莲的整个生长区域保护起来,以保护尽可能多的遗传多样性。同时为了增加遗传变异,在就地保护同时应进行迁地保护。物种在实施原地保护的同时,为增加遗传变异,要进行一定的迁地保护工作;有些由于原生境的严重破坏,无法原地保护的物种,必须进行抢救性的迁地保护。实践中应该选取多少种群和每个种群应该选取多少个体才能达到保护的目的?迁地保护能否有效涵盖该物种基因库完整的遗传信息,以及恢复重建中能否保持足够的遗传多样性? DNA分子标记通过检测濒危药用植物遗传多样性和遗传结构,对居群间和居群内遗传多样性的分析,确定迁地保护的取样策略,有助于解决上述问。同时通过评价野生居群和引种栽培群体的遗传差异,可以指导科学引种和迁地保护工作。葛永奇等利用ISSR分子标记研究了江苏泰兴、美国纽约的栽培银杏群体和中国3个可能为野生的银杏自然群体(浙江西天目山、贵州务川、湖北大洪山区)的遗传多样性水平和群体遗传结构。结果表明:美国纽约群体与湖北大洪山群体具有较近水平的亲缘关系,且多样性水平较低,可能为同一野生群体的后裔;贵州务川群体遗传多样性最高,可能为野生。基于银杏群体遗传学和生态学研究成果,建议在自然群体最适生境和遗传多样性最高的贵州务川建立银杏保护区。由于银杏群体间出现一定程度的分化,建议3个自然群体间可进行植株和幼苗相互移栽,以提高群体间基因交流,以最大程度保护银杏的遗 传多样性。 4基因芯片技术在药用植物上的应用 基因芯片技术是指采用点样法,将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上,产生二维DNA探针阵列,然后与标记样本杂交,通过检测杂交信号来实现对生物样品的检测或医学检测。在相关基因的确定、药物筛选等方面,该项技术以其快捷方便的优势而被广泛应用于药用动、植物等方面的研究中。基因芯片技术成为解决新药开发中分离和鉴定药物的有效成分这一重大障碍的有利手段。其能大规模地筛选,从基因水平解释药物的作用机制,可以利用基因芯片分析用药前后机体不同组织器官基因表达的差异,从而发现一组病症相关基因和药物效应基因作为药物筛选靶标。生物芯片高通量、多因素、微量化和自动化检测的特点,给药用植物分析带来了极大的便利。如银杏(Ginkgo biloba)叶提取物(Egb761)作用机制尚不完全清楚,Watanable等[30]用高密度的基因芯片对服用Egb761的小鼠皮层及海马细胞的基因表达变化作了观察,证实了其拮抗神经病变的药理作用,初步展示了基因芯片在研究中药机理方面的应用前景。有关毒理学方面基因芯片已有不少报道,一种名为TOXCHIP的装置,其实质是通过检测化合物作用于细胞后基因改变研究其毒性。另有人对贝母特异性序列和鉴别芯片进行了分析。相信不久的将来会有更多的药用基因芯片上市,用于药用植物品种及品质的研究。 5展望 分子生物学技术的发展将带动药用植物领域各方面的发展,它给现代药用植物的研究注入了新的活力,带来了新的方向,从基因和分子水平进行药用植物的药理研究,将推动和加速医药学的发展。分子生物学的许多研究手段、方法已广泛应用于医药的研究工作中,而药用植物学作为一门古老的学科,正面临着巨大的挑战,应该在传统的生物学和药学基础上,应用新技术和新方法开展植物物种、遗传和生态三个层次的生物多样性和天然产物多样性相结合的研究,使对药用植物的认识进入一个崭新的阶段。 参考文献 [1]黄珞琦.展望分子生物学技术在生药学中的应用[J].中国中药杂志,1995,20(11):643-645. 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