兰州地区人乳头瘤病毒16型E6、E7基因克隆及表达

兰州地区人乳头瘤病毒16型E6、E7基因克隆及表达 兰州大学 硕士学位论文兰州地区人乳头瘤病毒16型E6、E7基因的克隆及表达 姓名:任睿 申请学位级别:硕士 专业:临床医学、妇产科 指导教师:杨毓琴 20100601 兰州地区人乳头瘤病毒,,型,,、,,基因的克隆及表达 任 睿 (兰州大学第一临床医学院，甘肃兰州,,,,,,;甘肃省人民医院妇产科，甘肃兰州,,,,,,) 摘 要背景与目的: 人乳头瘤病毒(,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,，,,,)是一种为无包膜的小型双链环状,,,病毒，目前已鉴定有, ,,型，而其中有约,,型可感染生殖道粘膜。根据,,,感染后诱发病变的良恶性不同进一步分为高危型和低危型两大类，,,,以上的宫颈癌组织中可检测到高危,型,,,,,，,,，,,等型的,,,,?，以,,,,,型为主。,,,,,型,,、,,基因在,,,,,感染相关的宫颈癌及,,,以上中重度宫颈上皮内瘤变(;,,,,;,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,，,)中持续性表达，因此,,,,,型,,、,,蛋白与宫颈癌的发生发展密切相关，而,,、,,蛋白被认为是用于免疫治疗的首选蛋白。本研究主要进行,,,,,型,,、,,基因的克隆，并在体外诱导表达,,、,,蛋白，为今后的蛋白疫苗的动物实验、进一步探索,,,,,型,,、,,蛋白致宫颈癌分子机制及宫颈癌及癌前病变的免疫治疗奠定基础。方法:,(用,,,法从宫颈癌组织中扩增,,,,,型,,、,,基因;,(将,,,,,型,,、,,基因片段与克隆载体,,, ,,,, ,,,,,, ,,;,,,连接，构建,,,,,型,,、,,的克 隆质粒,,, ,,,,,,,，,,, ,,,,,,,,,(用限制性内切酶,,,, ，、,,,,,,，将,,,,,型,,、,,基因从克隆质粒,,, ,,一,,,,，,,, ,,一,,,, 切下，用,,连接酶与表达载体,,,,,,(，)连接，构建,,,,,型,,、,,的表达质粒,,,,,,(，)一,,、 ,,,,,,(，),,,;,(将表达质粒,,,,,,(，),,,、,,,,,,(，),,,转化至大肠杆菌,,,,中，诱导,,,,,型,,、,,蛋白表 达，运用,,,(,,,,蛋白电泳检测,,,,, ,,、,,,蛋白的表达。结果:,(以宫颈癌组织标本中提取的,,,作为，,,,扩增反应之后，得到了大小分别约为,,,,,、,,,,, 的基因片段;,(将重组的克隆质粒,,, ,,,,,,,，,,, ,,,,,,,和表达质粒,,,,,,(，)一,,、,,,,,,(，),,,测序，测序 结果均显示,,基因的,,,位碱基,,,,,,突变为,,,,,,，编码氨基酸由组氨酸突变成酪氨酸，,,基 因测序结果与,,,,,型,,序列完全一致;,(构建的表达质粒,,,,,,(，)一,,、,,,,,,(，)(,,可在大肠杆菌,,,,中稳定表达,,,,,型,,、,,蛋 白。 ,,,,结论:,(成功克隆了,,,,,型,,、,,基因:,(成功构建了,,,,,型,,、,,蛋白原核表达系统:,(成功诱导,,,,,型,,、,,蛋白的原核表达。关键词:人乳头瘤病毒,,型;,,、,,蛋白;克隆;表达;宫颈癌 ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,锣,, ,, ,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,, ;,,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,，,,,,,毛,,,,帆。,,,,,,;,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;, ,,,,,,,,;,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,;,，,口凇群,,,,,,,，,,,,,,) ,,,,,;,;,,,;,,,,,,, ,,, ,,,,;,,,,: ,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,, ;,,,,,, ;,,;,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,(, , , ,,,,,,,,, ,,,,,，,,,—,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,，,, ,,,;, ,,,,, ,, ,,,,;, ,,, ,,,,,,, ,,;,,,(,,,,, ;,,,;,,,,,,,,, ,,,, ,,,,?,,,, ,, ,,,—,,,, ,,,,,, ,;;,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,;,,,,, ,,,,,,, ,,,;, ,,,, ;,,,,(,,【,,,,,,, ,,,,，,,;, ,, ,,,,,，,, ,,, ,,，,,, ,,,,;,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ;,,,,;,, ;,,;,, ,,,;, ,,, , , ,, ,,, ,,,,(,,,〔,,，,,, ,, , ,,,,, ,,;,,,,,, ,, ,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ;,,,,;,, ;,,;,, ,,, ,,,, ,,,, ,,,,, ;,,,,;,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,(,,’,)，，—,，，,, ,, ,,,,, ,,,,, ;,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,;;,,,,,,,, ,,, ;, ,,, ,,,,,,,,,,, ,, ;,,,,;,, ;,,;,,(,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,, ;,,,,,, ,, ,,, ,,,, , , ,, ,,, ,, ,,,,，,,, ,,,,,,,,,, ,, ,, ,,, ,, ,,,,,,,, ,, ,(;,,,(,,,, ,, , ,,,,;,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,, ,,;;,,, ,, ,,,,,,，,,, ,,,,;,,,, ,,;,,,,,, ,, ;,,,,;,, ;,,;,, ,,,,;,, ,, ,, ,,, ,,,,;,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,; 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,、不对论文从事收集、保存、发布以外的其他活动; ,、未经著作权入同意，不得从事营利性活动。 院系:、矛，?,瞻医学伤 学号:, ,加:;, ,，; 作者(授权人)签名: 仁睿 时间:,?，,(,(叫? 被授权人:兰州大学图书馆 第一章,,,研究背景及分子生物学特征 第一章,,,研究背景及分子生物学特征 ,(, ,,,的研究背景 宫颈癌发病率 居全球女性恶性肿瘤的第二位，发病率仅次于乳腺癌，每年约有,,万宫 颈癌新发病例，其中约,,,为死亡病例【,】，近,,,死亡病例发生在发展中国家，在我国每年新 增宫颈癌病例约为,,(,,万，占到全球发病数量的,,,,,〕，所以宫颈癌是危及女性健康的重要 疾病。 ,,,,年,,,,,,等最先在电镜下从普通疣体浸出液中观察到人乳头瘤病毒(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,)的病毒颗粒，,,,,年德国科学家,,,,,, ,,, ,,,,,,在对宫颈癌风险因 素探索研究的基础上首次提出宫颈癌可能由,,,感染引起，其所在的实验室于,,,,”,,,,, 年从生殖道疣中克隆至,,,,(,、(,,、(,,和(,,，,,世纪,,,,,,,,年代证实,,,感染可诱发包括宫颈癌在内的多种恶性肿瘤，发现人乳头瘤病毒(,,,)导致子宫颈癌的主要原酬引。国 际癌症研究组织(，,,,)对世界,,个国家(不包括东亚地区)的, ,,,例宫颈癌组织标本研究发现了,,种高危型,,,，按照其在宫颈癌组织中检出的阳性率由高至底分别为,,,(,,(,,(,,)、一, ,(,,(,,)、,,,(,(,,)、?, ,(,(,,)、一,,(,(,,)、?,,(,(,,)、?,,(,(,,)、一,,(,(,,)、(,,(,(,,)、,,,(,(,,)、,,,(,(,,)、,,,(,(,,)、?,,(,(,,)、一,,(,(,,)和一,,(,(,,)。而与我国 宫颈癌密切相关的高危型,,,类型依次为,,,(,,、(,,和(,,，其中,,,,,型占,,,以上，是诱导我国妇女宫颈癌的主要病毒型。此外，高危型,,,如,,及,,型还是阴道癌、外阴癌、肛门和阴茎癌的重要病因【,卅。 慢性持续性高危型,,,感染是宫颈癌发生的主要诱因，从慢性持续性高危型,,,感染到最后进展为恶性肿瘤通常需要,,”,’,,年的时间，这为宫颈癌的防治提供了很好的机会，如臬能及早发现,,,感染，并及时清除机体内病毒，宫颈癌便成了“容易被治愈的癌症”。,,,,,型,,、,,基因在,,,,,相关的宫颈癌及,,,中重度宫颈上皮内瘤变(;,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,，,,,)中持续性表达,,，故,，,,,,型,,、,,蛋白与宫颈癌的发生发展密切相关，所以,,、,,蛋白被认为是用于免疫治疗的首选蛋白。本研究主要进行，,,, ,,型,,、,,基因的克隆，并在体外诱导表达,,、,,蛋白，为今后的蛋白疫苗的动物实验，进一步探索,,,,,型,,、,,蛋白导致宫颈癌分子机制及宫颈癌及癌前病变的免疫治疗奠定基础。,(, ,,,的分子生物学特征 , 第一章,,,研究背景厦分子生协学特? ,,,属乳多空腐毒科,亚群内的一组,,,病毒，为无包膜的小型双链环状,,,病毒。,,,颗粒外形呈球形(为二十面体对称型(外壳有,,个表壳体，直径约,,,,,,,。,,,的基因组是双链闭环,,,(图，)，各型,,,基因组,,,长度在, ,,,,,之间，分子量约, ,×，,,,,。,,,基因组分为编码区和非编码区，编码区又分为早期编码医(,区)和晚期编码区(,区)，早期编码区编码的蛋白有,,、,,、,,、,,、,,和,,(所有蛋白质均由有义链依赖的多顺反子编码研，开放读码框架之间可以部分或者完全重叠:晚期编码区编码的蛋白有,,和,,;非编码区又称上游调控区(,,,)或长控制区(,;,)(位于,,与,,之间，长度大约,?, ,,，该区域主要包括,,,复制的起始位点及重要的转录调控元件，如细胞分化特异性的增强子及各种结合位点、与核基质的结台点和与,,、, ,蛋白的结合位点。编码区基因的作用见表，。 ,， ,, 图， ,,,的基因结构示意图 第一章,,,研究背景及分子生物学特征 表, ,,,基因产物的概述基 因 作 用 酊 是一类,,,结合蛋白，具有,,,,,,酶和解旋酶活性，参与病毒,,,复制与转录 眩 病毒转录因子;参与病毒,,,复制与转录 ? 与细胞结构蛋白相互作用。参与细胞骨架的破坏，利于病毒颗粒的出胞。参与病毒 的组装，故目前倾向于将其归类为晚期蛋白 酹 与多种细胞生长因子受体结合，通过活化多种细胞生长因子的受体信号通路，刺激 细胞增殖:下调细胞表面,,,(,分子的表达 ? 参与细胞的永生化;,,,的降解;端粒酶的激活;抗凋亡效应;诱导宿主基冈组不稳 定性 (翳 参与细胞的永生化;与视网膜细胞瘤肿瘤抑制蛋白家族(,,，,,,,，,,,,)、级氮酸酰 化酶、,,,,转录因子、细胞周期素、细胞周期素依赖激酶(,,,,)和细胞周期素依赖 激酶抑制物相互作用，参与诱导细胞增殖、永生化和转化等过程;诱导宿主基因组 不稳定性 , 主要衣壳蛋白 , 小农壳蛋白 , 第二章,,,的基因分型 第二章,,,的基因分型 人乳头瘤病毒基因组十分保守，依据,,基因序列的同源性比较，进行病毒型别的区分和鉴定。如果,,基因的同源性与其他型别相比小于,,,，则称其为一个新“型’’，目前已发现,,,型。根据,,,的组织嗜异性，将入乳头瘤病毒分为嗜黏膜组和嗜皮肤组两大类，嗜皮肤组占,,,，仅嗜黏膜型仅占,,,;嗜黏膜组又根据感染后诱发病变的良恶性不同进一步分为【,】: (,)高危型,,,(,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,)，如,,,?,,，,,,，,,,，,,,， (,,，(,,，,,,，(,,，(,,，(,,，(,,，(,,，(,,，(,,和(,,共计,,种型别，它们以诱 发上皮组织恶性增生为特征。高危型,,,感染主要引起宫颈、阴道、阴唇、阴茎、 肛门及口咽部的恶性肿瘤及其癌前病变的发生发展密切相关;其中,,,,,型和 ,,,,,型是引起宫颈癌的最常见的两种亚型，,,,,,型与宫颈鳞癌关系最为密切， ,,,,,型最易导致宫颈腺癌【,】; (,)低危型,,,(,,,—,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,)，目前已鉴定有,,型，有,,,一,， (,,，,,,，(,,，,,,，,,,，(,,，(,,，(,,，(,,，(,,，(,,,,,,，它们以诱发上皮组 织良性增生为特征，其中,,,以上的生殖器疣和宫颈低级鳞状上皮增生病变的发生 与,,,(,和(,,的感染密切相关; (,)中间型或可疑高危型有,型，分别是,,,(,,，(,,和(,,; (,)其它:有些型别诱发病变的良恶性的能力尚未确定，如,,,(,,，(,,和(,,。 嗜皮肤组,,,:感染人角化上皮组织后为良性病变，最常见是皮肤疣，包括寻常疣、扁平疣、跖疣等。皮肤疣通常为表皮组织的良性增生，愈后较好，多数病变在,年内自行消退。少数病例会持续更长的时间，其病程长短、病变程度及是否恶性转化与机体的免疫状态密切相关。 , 第三章高危型,?,,(,和,,蛋白与宫颈癌 第三章高危型,,, ,,和,,蛋白与宫颈癌,(,高危型,,, ,,蛋白与宫颈癌,(, ,高危型,,,,,蛋白的结构 高危型,,,,,基因开放读码框的编码约有,,,(,,,〕, ,,为,,，)个氨基酸的蛋白，分子量,,,,,,,，包含有两个锌指结构，每个锌指结构含有两个,(,(,,;(,为任意氨基酸)的序列，锌指结构与其功能如:转录激活、恶性转化、永生化等密切相关。高危型,,, ,,蛋白;端,,,氨基酸残基,((, ,,),,((,,,,,)构成的高度保守的序列(为,,,结合域，介导与宿主细胞的,,,蛋白问的相互作用(图,)〔,, ,,,,日,,,,,,,, ,,,,,协，,,岫, ;,,; ‰;,,; ;, , ;,; 器,,,,“,“,,, 图,高危型,,, ,,蛋白的结构, , ,高危型,,,,,蛋白的功能, , ,(,高危型,,, ,,与,,,蛋白 ,,,是抑癌蛋白，参与细胞周期负调控、促进细胞凋亡、,,,复制厦损伤后的修复，稳定基因组和抑制突变细胞产生的作用，从而避免肿瘤的发生。在,,,蛋白上有,个,,蛋白结合位点，一个是位于核心区的,,,,,,氨基酸残基，另一个位,,,的;末端，,,蛋白与,,,蛋白的,末端结合，不降解,,,蛋白(而主要起转录抑制功能或影响,,,蛋白的核定位四。 高危型,,, ,,与抑癌蛋白,,,的结合是通,立(,,,,,(,, ,,,,;,,,,, ,,,,,,,。,,,,,)的介导，,,,,一种泛素蛋白连接酶，,,先与,,,,结合形成复合体,,,,,,,，再与,,,蛋白的核心区结合，,,,,将活化的泛素转移到,,,蛋白上作为降解信号(被,,,蛋白酶体降解，导致细胞，匈,,,的降解。,,,蛋白的降解，使,,,,期及,,,的调控点失控，从而导致,,,的完整性受损、细胞过度增殖，致使基因突变增加和细胞染色体不稳定及外源,,,整台到宿主染色体中的机率升高，致细胞永生化，导致肿瘤发生。在高危型,,,,,感染致永生化的细胞和宫颈癌细胞中，,,,蛋白含量比正常细胞要低,,,倍，半衰期则从几个小时降到,,分钟左右，,“。活化的,,,蛋白,端可以与转录辅助活化因子,,,,,,,,结台(促进靶基因转录， 第三章高危型，,，,,,,和,,蛋白与宫颈癌其中一个重要的靶基因编码,,,蛋白，,,,蛋白是,,期特异的细胞周期抑制物，其作用是阻止,,,,节点，使其停留于,,〔,,,。,,,, ,等四研究表明，,,,,,,,蛋白能够抑制,,,的转录辅助活化因子,,,,,,,,，从而来抑制,,,的作用。,,,蛋白家族的,,,与,,,蛋白有相似的结构和功能，,,,,,, , ,等【,】研究表明，将携带,,,基因的重组腺病毒载体导入表达,,基因的,,,,细胞，使,,,,细胞的,,,合成减少、,,,节点阻止，及细胞凋亡的出现，同时,,,蛋白表达水平也相应升高，表日,,,,,与宫颈癌及癌前病变的发生有关。,(,(,(,高危型,,, ,,与端粒酶 端粒酶能以其自身,,,为模板，逆转录合成端粒,,,并添加于染色体末端，从而维持端粒长度的稳定，以维持人类基本细胞染色体的稳定性，由,,,和相关蛋白质组成。端粒酶在很多永生化细胞如干细胞和癌症细胞中检测到表达活性增高，但在大多数正常机体细胞检测不到端粒酶的表达，证明端粒酶表达活性的增强在人类癌症的发展过程中起重要的作用。现克隆出的端粒酶亚单位有:端粒酶逆转录酶(,,,,,)，端粒酶,,,(,,,)及端粒酶相关蛋白质(,,,)。测,,,,, ,,,,表达水平和端粒酶活性发现，,,,,, .