蛇毒类凝血酶的研究现状

蛇毒类凝血酶的研究现状 蛇毒类凝血酶的研究现状 综述 蛇毒类凝血酶的研究现状 陈小飞,马海泉,赵冠人(解放军总医院第二附属医院药剂科,北京,100091) 摘要在40余种含有类凝血酶成分的蛇毒中,已有10余种蛇毒类凝血酶的全部或部分氨基酸序列得到明确,并有20余种先 后得到分离和纯化,在其生物化学特征,基因工程研究,药理学作用等方面均取得了重要成果,并在临床上得到了广泛应用. 关键词蛇毒;类凝血酶;基因工程研究;药理作用;临床应用 中图分类号:R973~.1文献标识码:A文章编号:1672-8157(2oo7)06—0051—04 蛇毒中含有多种蛋白水解酶[1],根据酶的活性位 点的不同,可以分为两种:丝氨酸蛋白酶和含金属的 蛋白酶,后者底物较广,而丝氨酸蛋白酶底物则专一 性较强,只作用于特定的肽键,其中,最引人注意的就 是类凝血酶(Thrombin—likeenzyme,TLEoTLE在体外 可使血浆或血纤蛋白溶液直接凝固,而在体内因血纤 蛋白原水平显着下降,同时生成的血纤蛋白凝块结构 松散,导致血浆纤维蛋白原浓度降低,易被纤溶系统 清除,故现出抗凝作用圜.TLE只在血管破损处促进 止血,因此不会造成血管内凝血.自1936年Klobusitzki 和Konig首次用硫酸铵,醋酸铅及透析法从巴西矛头 蝮蛇毒液中获得部分纯化的类凝血酶以来[31,迄今已经 发现40余种蛇毒中含有类凝血酶成分,并有20余种先 后得到分离和纯化.尤其是近几年,有关蛇毒类凝血 酶分子结构及酶学性质的研究取得了很大进展,有些 已经在临床得到了广泛的应用. 1蛇毒类凝血酶的生物化学特性 蛇毒类凝血酶主要存在于蝮亚科,且不同地区的 蝮蛇类凝血酶有较大区别,见表1. 表1不同地区同类型凝血酶的区别 蛇毒来源类凝血酶名称纤维蛋白释牧方式分子量(1(D1 【作者简介】陈小飞,女,药师,在读硕士研究生,研究方向:药剂学. 大部分蛇毒类凝血酶的分子量在30kD,45kD之 间,少数较大,如美洲矛头蝮的Botrombin分子量为 71kD.与凝血酶的二硫键连接的双链结构不同,蛇毒 类凝血酶均由一条链组成.绝大多数蛇毒类凝血酶 肽链中都含有12个,13个半胱氨酸残基,有六条二硫 键[41.除了来自黄绿烙铁头(Trimeresurusflavoviridis) 的flavoxobin和来自角蝰(Cerastesvipera)的Viperabin 不含糖外,几乎所有的蛇毒类凝血酶都是糖蛋白,且多 呈酸性.与凝血酶不同,蛇毒类凝血酶寡糖链多与天 冬酰胺连接,而不是与丝氨酸连接[51. 目前,已经有十余种蛇毒类凝血酶的全部或部分 氨基酸序列得到阐明,有Acutin,Ancrod,Calobin,Pal— labin,巴西矛头蝮蛇的Batroxobin,黄绿烙铁头的Flav— oxobin,角蝰的Viperabin等.它们的一级结构很相似, 只有少数差异,如Flavoxobin的活性位点丝氨酸两边 的序列被取代:Gly206---~Phe,Gly210--~Thr,此外229位 的Ser_Tn,o对Flavoxobin,Crotalase,Batroxobin与凝 血酶,胰蛋白酶及激肽酶的氨基酸序列分析表明,蛇毒 类凝血酶的一级结构与胰蛋白酶,激肽酶更为相似.将 Calobin的N一末端氨基酸序列与其他数种丝氨酸蛋白 酶序列比较,Calobin与其他类凝血酶结构很相似,有 61%的氨基酸残基与Ancrod相似,有72%与Batroxobin 相似,与人的0【凝血酶以及血管舒缓素(Kallikrein)也具 有一定程度的相似性.分析表明,大多数类凝血酶的 N末端为缬氨酸.Acutin与Ancrod,Batroxobin的氨基 酸同源率分别为66%和63%嘲;Pallase与Ancrod,Ba— troxobin的氨基酸同源率分别为58%和68%;Pallabin 与Calobin,Ancrod和TSv—PA的氨基酸同源率分别为 中国药物应用与监测2007年第6期51 综述 67%,92%,59%和67%. [91对Batroxobin的基因结构进行细致分析, Itoh等 发现其基因约由8kD组成,含有5个外显子和3个内 含子.外显子1包含了1个5非编码区域,还编码大 部分信号肽.外显子5除了编码酶的糖端外,还包含一 个较长的3非编码序列,活性位点的组,天冬和丝氨 酸残基分别由外显子2,3,5编码. 2蛇毒类凝血酶的基因工程研究 由于蛇毒资源比较有限,提纯工艺相对复杂,从蛇 毒液中提取天然蛇毒类凝血酶不仅产量不大,而且纯 度难以保证,因此,以基因工程技术生产类凝血酶成 为近期研究的重点?.1991年,Maeda等人工合成了矛 头蝮蛇(BothropsatroxMoojeni)类凝血酶Batroxobin的 成熟蛋白基因,在大肠杆菌中表达,采用含Batroxobin 基因的融合基因表达质粒pBat—SS49,在E.coliHBIO1— 16表达出含Batroxobin的融合蛋白,产物以包涵体的 形式存在,再经纯化,酶切,重折叠,可得到具有一定生 物活性的Batroxobin,但活性较低(60%左右)…1.You WK等用PCR将Batroxobin的cDNA扩增产物转入P. pastoris表达载体pPIC9,再经Sail限制酶消化后,转化 宿主细胞GS115.经实验证明这种重组的Batroxobin 在体外具有比天然Batroxobin更高的生物活性.体内 应用时缩短凝血时间(CT),出血时间(BT)的作用也比 天然Batroxobin略强ll21. 潘华等以江浙蝮蛇的类凝血酶Pallabin为研究对 象,从毒腺中抽提总RNA,再合成Pallabin的cDNA, 经PCR扩增后,以大肠杆菌表达载体pET一24a(+)构 建1-7启动子控制下的蝮蛇类凝血酶Pallase的大肠杆 菌表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IFrG诱导 表达,产物经SDS—PAGE和蛋白印迹分析获得证明,但 是否有生物活性未见报道171.他们又将尖吻蝮蛇类凝 血酶Acutbin基因以两种融合蛋白的形式表达于E. coli中,表达量分别达到了30%和20%,但产物仍以包 涵体形式存在,实际收率较低嘲.Fan等采用PCR法扩 增出蝮蛇(AgkistrodonhalysPallas)的蛇毒类凝血酶基 因Pallabin,克隆入pT722中构建成表达载体pT7一Pal— labin,在E.coliBL21(DE3)中表达,产物经SDS—PAGE 和蛋白质印迹法证明有具有生物活性的Pallabin表 达[81.李民等将大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶(Gloshedobin) 基因克隆到载体pET32一a(+)上,在,I7lac启动子下以 52中国药物应用与监测2007年第6期 N端融合硫氧还蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中 进行表达,再经纯化,得到相对较高生物活性的产物旧. Jeong等利用E.coli的细胞表面展示技术来表达 朝鲜蝮蛇类凝血酶Salmobin.Salmobin基因与INP蛋 白(丁香假单胞菌的外膜蛋白)的c端连接起来,构成 融合蛋白,并在中间插入了凝血酶识别位点.在E.coli 中表达以后,分别通过SDS—PAGE,Western—blotting,全 细胞ELISA和免疫荧光显微镜检测,证实Salmobin在 细菌表面成功表达.酶切纯化后,验证了重组Salm— obin具有生物学活性"41. 类凝血酶在真核系统中的表达相对来说就比较容 易.YangQing等报道长白白眉蝮类凝血酶Gussurobin 和大连蛇岛蝮类凝血酶Gloshedobin在毕氏酵母中获 得表达.这两种酵母重组类凝血酶都保持了较高的 酰胺裂解活性,但精氨酸酯酶活性却相对较弱.他们 经酵母表达系统的加工修饰,均含有7%的糖基,故而 对专门结合糖蛋白的亲和基质ConASepharose具有 亲和性.Bach等人将Ancrod的cDNA利用构建的载 ,重组Ancrod可以从 体转到鼠成纤维细胞(C127I)中 无血清的细胞培养基上清液中获得『l61.Geyer等为了 研究重组Ancrod的糖基化特点,也将Ancrod的编码 序列克隆到牛乳头瘤病毒表达载体中,转染鼠成纤维 细胞,获得了糖基化率达31.5%的重组Ancrod,令人兴 奋的是重组产物与天然Ancrod具有同样的比活性ll71. 3蛇毒类凝血酶的药理学作用 3.1对凝血因子和纤溶活性的影响 凝血酶在体内及体外均可作用于纤维蛋白原的 Act链,快速分解出纤维蛋白A肽,随后缓慢作用于BB 链,裂解出纤维蛋白B肽,形成可溶性的纤维蛋白单 体,同时激活FXm,使可溶性的纤维蛋白单体形成不 溶性的纤维蛋白凝块;蛇毒类凝血酶对纤维蛋白原的 A链和B链的作用是不等效的【l81,大部分仅裂解纤维 蛋白肽A,部分还同时裂解纤维蛋白肽B(少数两者都 裂解,但裂解能力不同),生成的纤维蛋白聚合物仅为 纤维蛋白单体首尾连接而成,而不能使纤维蛋白链发 生交联.不交联的纤维蛋白很容易被体内的纤溶酶降 解.蛇毒类凝血酶的作用不受一般抗凝药物的抑制 (如肝素,水蛭素等).除了对纤维蛋白原的作用外,几 乎所有的蛇毒类凝血酶都同时具有精氨酸和酰胺酶 活性.蛇毒类凝血酶均可被二异丙基氟磷酸(DFP)和 综述 苯甲基磺酰氯(PMSF)所抑制.部分类凝血酶如Cro— talase还受对甲基苯磺酰—L-精氨酸氯甲酮(TLCK)的影 响. 3.2对血小板功能的影响 蛇毒类凝血酶与凝血酶相反,不诱导血小板聚集 和释放,与富含血小板的血浆所形成的凝块不收缩.血 小板与Batroxobin孵育后,在膜结构上无任何变化,因 而不能发生聚集. 从角蝰中提取的Vipcrabin具有中等的血小板聚 集效应.Bothrombin本身并不能诱导血小板聚集和释 放反应,但通过外源性的纤维蛋白原的存在能使血小 板聚集,这种效应能完全被抗GPIIb/llIa(anti—glyco— proteinIIMIIa)单抗或抗GPIb(anti—glycoproteinIb) 单抗所抑制.来自Bernard—Soulier综合征患者的洗涤 血小板,即使在外源性纤维蛋白原存在的情况下,对 Bothrombin也无反应,提示Bothrombin与血小板结合 部位是GPIb,而不是凝血酶受体口91. 4蛇毒类凝血酶的临床应用 蛇毒类凝血酶在临床上主要用于止血,抗血栓,诊 断试剂等方面. 4.1止血作用 临床常用药"立芷血"的主要成分是巴曲酶(Ba— troxobin),该类凝血酶在血管内只产生纤维蛋白A单体, 同时只促进出血部位血小板聚集,而对正常血管系统 内无血小板聚集作用,因此人体凝血酶仅在出血部位 形成,而血管内不会存在凝血酶,也不会有纤维蛋白 AB单体.故立芷血仅在出血部位产生凝血(止血)作 用,而在血管内没有凝血作用. 4.2抗血栓作用 类凝血酶清除纤维蛋白的前体,可以有效的预防 前者而控制血栓的发展,并增强纤溶作用.实验证明 Batroxobin大剂量使用时,对大鼠实验性动脉及静脉血 栓形成有预防作用,故大剂量的立芷血是一种血液的 抗凝药,50Ku,lOOKu为"去纤维蛋白原"的药量(目前 国外已有每支50Ku的剂型,专供血液抗凝药使用). 4.3作为诊断试剂 血浆中纤维蛋白原含量水平是评价凝血功能的一 项重要参数,它可以通过测定凝血酶时间来进行检测 (Thrombintime,TT).如果使用蛇毒类凝血酶(如Ba— troxobin),它同凝血酶一样,可以裂解纤维蛋白原,引 起血浆凝固,因不会受到抗凝剂的影响,所得到的结 果用来评价血浆纤维蛋白原水平更可靠,被称为Repti— laseTime.另外,某些疾病如恶性肿瘤时会伴有异常 纤维蛋白原血症,既包括纤维蛋白原量的减少,也同时 存在纤维蛋白原质的异常.用蛇毒类凝血酶检测异常 纤维蛋白原血症时,其特异性要较凝血酶高的多,而且 试剂本身稳定性好,操作简便,结果稳定,重复性好f2】1. Eearin是从Echiscarinatus的毒液中分离出来的 一 种金属蛋白酶,它能选择性的裂解凝血酶原的322— 323位精氨酸一异亮氨酸肽键,产生一种中间状态的凝 血酶(meizothrombin),随后meizothrombin通过自催化 作用转变为凝血酶.这样,Eearin就可以用来测定血 中凝血酶原的水平.与其他的凝血酶原测定方法相 比,Eearin能够发现血中的异常类型的凝血酶,如出现 于过量应用抗维生素K药物(华法令)病人血液中的 去羧基形式的凝血酶,也适于用来检测由于肝脏疾病 导致的凝血障碍以及用于鉴别凝血酶原异常病人的 凝血酶原的类型[z21. 蛇毒类凝血酶的用途还有很多,如Botrocetin被广 泛用于假性血友病因子(vWF)的测定,丝氨酸蛋白酶 ProtacC测定C蛋白水平等等.蛇毒类凝血酶还可以 作为工具酶用于凝血系统的研究,一些蛇毒类凝血酶 还可以作为分子模型用于生物学,物理学的研究.随 着对蛇毒类凝血酶研究的不断深人,研究手段的不断 进步,蛇毒类凝血酶必将为人类健康事业的发展进步 做出更大的贡献. 参考文献 [1]JenningsBR,SpearmanCW,KirschRE,et.Anovelhigh molecularweightfibrinogenasefromthevenomofBitisarietans[J1. BiochimBiophysActa,1999,1427(1):82. [2】MarklandFS.SnakeveHOHISandthehemostaticsystem【JJ.Toxicon, 1998,36(12):1749. [3]康佐文,时凯,黄国章.立止血的研制历史及其应用概况【JJ.蛇 志,2000,12(4):62. [4]NikaiT,OharaA,KomoriY,et.Primarystructureofacoagu— lantenzyme,bilineobin,fromAgkistmdonbilineatusvenom【JJ. ArchBiochemBiophys,1995,318:89. [5]符民桂.蛇毒类凝血酶的研究进展[JJ.国外医学?输血及血液学分 册,1995,18(5):297. 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(收稿日期:2007—03—23) 氟罗沙星致幻觉1例 李儒国(沈阳市大东区人民医院,沈阳,110042) 关键词氟罗沙星;幻觉 中图分类号:R969.3文献标识码:B 氟罗沙星属喹诺酮类抗菌药物,近年来广泛应用 于临床工作中,其抗菌谱广,不良反应较少.我院 发现氟罗沙星致幻觉1例,报告如下. 1临床资料 患者女眭,56岁,因恶心,胃痛,腹泻半天来诊,查体 T:36.7?,P:80~/min,R:167~/min,BP:120/70mmHg,神 清,心肺听诊无异常,腹软,无反跳痛,肠鸣音5L~/min, 便常规WBC:1/up,2/up,诊断为急性胃肠炎.给予病 人静滴0.9%氯化钠注射液250mL,加入氟罗沙星注射 液0.4g,病人上述症状好转.病人静滴氟罗沙星后1h, 出现幻觉症状,给予5%葡萄糖注射液250mL,加入地 塞米松5rag,维生素C2.5g静滴,2h后幻觉症状肖失. 54中国药物应用与监测2007年第6期 ? ADR病例? 文章编号:1672—8157【2007)06-0054一O1 2讨论 氟罗沙星常见不良反应为胃肠道反应,可表现为 腹部不适或疼痛,恶心,呕吐,食欲不振,也可出现中枢 神经系统反应,头晕,头痛,兴奋,嗜睡,失眠,并诱发癫 痫等,快速静滴时出现血管周围皮肤瘙痒及疼痛,偶可 发生幻觉症状,临床应用时不做皮试,本例病人考虑静 滴氟罗沙星导致幻觉症状.为预防或减少药物的不良 反应发生,提示我们对喹诺酮类抗菌药物应用时应注 意不良反应,注意事项,禁忌,仔细询问病史,对老年, 体弱多病,特异体质,中枢神经系统病人,用药过程中 应严密观察病情变化. (收稿日期:2006—12—05)