[业务]伯氏嗜线虫致病杆菌蛋白酶抑制因子基因的克隆, 表达及生物活性的研究

[业务]伯氏嗜线虫致病杆菌蛋白酶抑制因子基因的克隆, 表达及生物活性的研究 伯氏嗜线虫致病杆菌蛋白酶抑制因子基因的克隆、表达及生物活性的研究 薛仁风 【摘要】: 天然的蛋白酶抑制因子(PI)是一类对蛋白水解酶有抑制活性的小分子蛋白质。它们能与蛋白酶的活性部位或变构部位结合,抑制酶的活性。昆虫体内存在着大量蛋白酶,在食物的消化等很多新陈代谢过程中起重要作用。昆虫摄食蛋白酶抑制因子后,导致其消化功能失调,生长发育受阻,易受环境中不利因素的影响,以至昆虫发育不正常甚至死亡。因此,蛋白酶抑制因子在农业害虫防治中具有十分重要的作用,本项研究应用基因工程手段,克隆了伯氏嗜线虫致病杆菌蛋白酶抑制因子基因,构建了高效重组表达载体,进行了重组蛋白的纯化及生物活性的研究,结果表明重组蛋白对桃蚜(Myzus persicae)、绿盲蝽(lygus lucorum Meyer-Du r)及白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)都具有良好的防治效果,而且对哺乳动物细胞和植物本身没有不良影响。本实验取得如下研究结果: 1参照Genbank中已知的蛋白酶抑制因子基因序列和ATG起始位点、TAA终止位点,设计合成了两条寡核苷酸引物,以伯氏嗜线虫致病杆菌BJFS-526菌株的基因组DNA为,进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到长度约为360bp的蛋白酶抑制因子基因片段,命名为Xbpi-1(Xenorhabdus bo vienii protease inhibitor gene 1)。 2将扩增出的目的片段插入pMD18-T Vector克隆载体获得重组质粒pT-PI。重组质粒经大肠杆菌转化后进行抗生素筛选,提取阳性菌落的质粒进行PCR检测和酶切鉴定,结果所得片段大小和目的片段一致。鉴定后的菌株送交北京三博远志生物技术有限责任公司测序并进行blast比对分析。结果表明所克隆的插入片段长360bp,与预期设计的大小一致,同已知基因序列相似性达到78%。 3设计 ,以pT-PI为模板,进行PCR获合成两条5’端分别含有限制性内切酶NedI和XhoI酶切位点的寡核苷酸引物 得目的片段,将扩增出的目的片段插入pMD18-T Vector克隆载体获得重组质粒pT-PI-NX。重组质粒经大肠杆菌转化后进行抗生素筛选,提取阳性菌落的质粒进行PCR检测和酶切鉴定,结果所得片段大小和目的片段一致。将重组质粒pT-PI-NX和重组表达载体pET42a(+)经限制性内切酶NedI和XhoI双酶切,通过T4DNA连接酶,构建重组表达载体pET42a-PI,提取阳性菌落的质粒,酶切鉴定确定Xbpi-1基因已成功插入到表达载体中。 4利用IPTG进行化学诱导并筛选最佳表达条件,使目的基因获得高效表达;对含有表达载体的大肠杆菌总蛋白进行电泳和Western blotting分析表明,外源基因获得高效表达,利用Ni SepharoseTM6 Fast flow(G E Healthcare)纯化柱进行纯化,以含有40mM咪唑的wash buffer上样,以含250mM咪唑的elution buffer洗脱,获得纯度较高的表达蛋白;将表达蛋白煮沸30min,没有明显改变蛋白的溶解度,说明重组表达蛋白是一种热稳定蛋白。 5生物活性测定表明重组蛋白能明显抑制桃蚜和绿盲蝽的生长和发育,提高其死亡率,有效降低桃蚜繁殖数量,而且对绿盲蝽体内的蛋白酶活性具有明显的抑制作用,同时对温室中白粉虱也具有很好的防治效果,而对正常的哺乳动物细胞生长和植物本身蛋白酶活性没有影响。 【关键词】:伯氏嗜线虫致病杆菌 蛋白酶抑制因子 基因克隆 分离纯化 生物活性 【学位授予单位】:中国农业科学院 【学位级别】:硕士 【学位授予年份】:2009 【分类号】:S476 【DOI】:CNKI:CDMD:2.2009.152534 【目录】: , 摘要6-7 , Abstract7-12 , 第一章 绪论12-20 , 1.1 蛋白酶抑制因子的研究现状13-16 , 1.1.1 国外蛋白酶抑制因子研究现状13-16 , 1.1.2 国内蛋白酶抑制因子研究现状16 , 1.2 蛋白酶抑制因子在农业害虫防治中的应用16-19 , 1.2.1 几种供试重要农业害虫的生物学特性16-17 , 1.2.2 蛋白酶抑制因子应用于农业害虫防治的主要方法17-18 , 1.2.3 蛋白酶抑制因子的优点18 , 1.2.4 蛋白酶抑制因子应考虑的问题及相应措施18-19 , 1.3 本研究的目的和意义19-20 , 第二章 BJFS-526 菌株蛋白酶抑制因子基因的克隆与表达20-44 , 2.1 BJFS-526 菌株蛋白酶抑制因子基因的克隆20-32 , 2.1.1 材料与仪器20-21 , 2.1.2 方法21-25 , 2.1.3 结果分析25-31 , 2.1.4 讨论31-32 , 2.2 BJFS-526 菌株蛋白酶抑制因子基因的表达与重组蛋白的纯化32-44 , 2.2.1 材料与仪器32-33 , 2.2.2 方法33-37 , 2.2.3 结果分析37-42 , 2.2.4 讨论42-44 , 第三章 BJFS-526 菌株蛋白酶抑制因子基因重组表达蛋白杀虫活性的研究44-63 , 3.1 XBPI-1 基因重组表达蛋白对桃蚜生物活性的研究44-50 , 3.1.1 材料与仪器44 , 3.1.2 方法44-46 , 3.1.3 结果分析46-49 , 3.1.4 讨论49-50 , 3.2 XBPI-1 基因重组表达蛋白对绿盲蝽生物活性的研究50-60 , 3.2.1 材料与仪器50-51 , 3.2.2 方法51-54 , 3.2.3 结果分析54-59 , 3.2.4 讨论59-60 , 3.3 XBPI-1 基因原核表达菌株发酵液防治温室白粉虱的研究60-63 , 3.3.1 实验材料60 , 3.3.2 方法60 , 3.3.3 结果分析60-61 , 3.3.4 讨论61-63 , 第四章 BJFS-526 菌株蛋白酶抑制因子基因重组表达蛋白生物安全性的研究63-70 , 4.1 重组表达蛋白对哺乳动物细胞的影响63-67 , 4.1.1 材料与仪器63 , 4.1.2 方法63-64 , 4.1.3 结果分析64-66 , 4.1.4 讨论66-67 , 4.2 重组表达蛋白对植物蛋白酶的影响67-70 , 4.2.1 材料与仪器67 , 4.2.2 方法67-68 , 4.2.3 结果分析68-69 , 4.2.4 讨论69-70 , 第五章 全文结论70-71 , 参考文献71-79 , 致谢79-80 , 作者简历8