抗凝血酶-Ⅲ对内毒素血症大鼠凝血功能异常的治疗作用

抗凝血酶-Ⅲ对内毒素血症大鼠凝血功能异常的治疗作用 抗凝血酶-?对内毒素血症大鼠凝血功能异 常的治疗作用 生垦鱼重鱼塾堕!生旦蔓!鲞芝期_chinCritCareMed,March2007,V01.19,N0.3?165? ? 论着? 抗凝血酶一?对内毒素血症大鼠凝血功能异常的治疗作用 乔佑杰祝君梅由希雷张宇 【摘要】目的探讨抗凝血酶一皿(AT一?)对内毒素血症大鼠凝血功能异常的治疗作用.方法采用静 脉注射革兰阴性菌脂多糖(LPS)复制大鼠内毒素血症凝血功能异常模型.24只Wistar大鼠随机分为正常对 照组,凝血功能异常组和AT—m治疗组,每组8只.采用连续2次股静脉插管注射LPS[1.4ml/kg(100g)和 2.8ml/kg(200g),每次间隔12h]制备内毒素血症凝血功能异常模型.AT一?治疗组在第二次注射LPS后 1h经股静脉注射AT一11125U/kg.3h后取血并处死大鼠,观察各组血小板计数(PLT),活化部分凝血活酶 时间(APTT),凝血酶原时间(PT),D一二聚体,AT一皿活性,纤维蛋自原(FI),丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨 酸转氨酶(AST),碱性磷酸酶(ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)的水平,取肺,肾,肝组织观察其病理学变化.结果 凝血功能异常组大鼠PLT,FI和AT一?均较正常对照组明显降低(尸均<0.01),APTT,D一二聚体,PT, ALT,AST,ALP和LDH则均较正常对照组显着升高(尸均G0.01);AT一?治疗组各项指标均显着改善,接 近正常对照组水平(尸均>O.05),与凝血功能异常组比较差异也均有显着性(尸均G0.01).肺,肾,肝组织病 理学检查结果显示,AT一?治疗后,内毒素血症大鼠各器官组织病理学损伤程度 明显减轻.结论检测血中 AT一?水平对内毒素导致的弥散性血管内凝血(DIC)具有早期诊断的价值.在内 毒素血症凝血功能障碍早期 预防性使用AT一?,对内毒素血症大鼠凝血功能异常有治疗作用. 【关键词】抗凝血酶一皿;多器官功能障碍综合征;凝血功能异常;治疗 Treatmenteffectsofantithrombin一? oncoagulationabnormalitiesinratswithendotoxaemiaQ1A0 You—fie,zHUJun—mei,Y0UXi— zei,zHANGYu.Tianj;inTianheHospital,Tianfin300050,China [Abstract]ObjectiveTostudythetreatmenteffectsofantithrombin一皿(AT一 ?)oncoagulation abnormalitiesinratswithendotoxaemia.MethodsTwenty— fourWistarratswererandomlydividedinto controlgroup,coagulationabnormalitygroupandAT一? group(each:8).Endotoxaemiacoagulopathy modelwasreproducedbyintravenousinjectionoflipopolysaccharide(LPS)intwodosesof1.4ml/kg (100g)and2.8ml/kg(200Pg)12hoursapart.IntheAT一?group,AT一?25U/kgwasgiven intravenously1houraftersecondinjectionofLPS.Thechangesinbloodplatelet(PLT)count, activated partialthromboplastintime(APTT),prothrombintime(PT),D—dimer(DD),AT,? activity,fibrinogen (FI),alanineaminotransferase(ALT),aspartateaminotransferase(AST),alkalinephosphat ase(ALP)and lactatedehydrogenase(LDH)weredetermined3hourslater.ResultsLevelsofPLT,FIandAT一?in coagulationabnormalitygroupwereloweredcomparedwithcontrolgroup(allPGO.01),whileAPTT,DD, PT,ALT,AST,ALPandLDHwereincreased(allP<0.01).A儿indexesweresignificantlyimprovedin AT一? group,thevalueswereclosetothoseofnormalcontrolgroup(allP>0.05),andthedifferenc es weresignificantwhencomparedwiththoseofcoagulationabnormalitygroup(allP<0.01) .Pathological changesofthelung,kidneyandlivertissueswerelighterinAT一噩groupthanthoseofcoagulation abnormalitygroup.ConclusionThesefindingsindicatethatAT一?canbeusedtotreatdisseminated intravascularcoagulation(DIC)inratswithendotoxaemia.PreventiveuseofAT,?inratswith endotoxaemiaistherapeutica儿yeffective. [Keywords]antithrombin一11;multipleorgandysfunctionsyndrome;coagulationabnormalities; treatment 多器官功能障碍综合征(MODS)的诱发病因 中,多以革兰阴性菌内毒素引发的感染性休克,弥散 性血管内凝血(DIC)最为多见.本研究应用抗凝血 酶一?(AT一?)对内毒素血症大鼠凝血功能异常进 行治疗,以改善重要器官缺血,缺氧,使器官功能得 以恢复,达到预防和治疗MODS的目的. 作者单位:300050天津市天和医院 作者简介:乔佑杰(1962一),男(汉族),天津市人,硕士,硕士生 导师,主任医师. 1材料与方法 1.1实验材料:大肠杆菌O111:B4脂多糖(LPS) 由上海生物制品研究所提供,用无菌生理盐水配成 70mg/L浓度;AT一?由Sigma公司提供;MS9血 细胞分析仪(法国),STAGO全自动血凝仪(法国), BECKMANCX5生化分析仪(法国),CHB一28双 目显微镜(日本). 1.2动物分组及模型制备:健康Wistar大鼠24只 (军事医学科学院四所动物中心提供),雌雄不拘,平 ?166?主垦重重璺塾堕兰生旦笙!鲞第3期ChinCritCareMed,Marh2007,Vo1.19,N..3 ,=8) 1各组大鼠凝血指标检测结果比较(? Table1Comparisonofbloodcoagulationindexesofratsineachgroup(x~s,,l一8) 注:与正常对照组比较:P<0.01;与凝血功能异常组比较:Ap<o.O1 均体重(240+_15)g.实验前于天津市医药科学研究 所动物室饲养2周,自由进食,饮水.按下列步骤插 入股静脉导管:用质量分数为0.35的戊巴比妥钠 溶液35ml/kg腹腔注射麻醉大鼠,将动物仰卧固定 于实验台,剪去右腹股沟部被毛,医用乙醇消毒手术 部位,沿股动,静脉走向切开右大腿内侧皮肤,分离 一 段长约1.5cm的股静脉,剪开股静脉并将导管插 入约2cm,结扎缝合,固定,检查导管回血情况,良 好后塞上无菌不锈钢针备用,并缝合皮肤.按随机数 字表法将大鼠分成3组,每组8只.?正常对照组: 股静脉插管注射生理盐水1.4ml/kg,12h后再给 予生理盐水2.8ml/kg;?凝血功能异常组:股静脉 插管注射LPS1.4ml/kg(100g),12h后再给予 LPS2.8ml/kg(200p-g);?AT—m治疗组:在凝血 功能异常组两次给予LPS后1h经股静脉注射 AT一?25U/kg. 1.3观察项目及方法:治疗后3h收集3组动物血 标本,测定血小板计数(PLT),活化部分凝血活酶时 间(APTT),凝血酶原时间(PT),纤维蛋白原(FI), D一二聚体,AT一?活性,丙氨酸转氨酶(ALT),天 冬氨酸转氨酶(AST),碱性磷酸酶(ALP)和乳酸脱 氢酶(LDH)水平.取血后处死动物,摘取大鼠肺, .肾,肝组织,置于体积分数为10的甲醛溶液中固 定,常规切片,苏木素一伊红(HE)染色,光学显微镜 下观察组织和细胞形态的改变. 1.4统计学方法:数据以均数?标准差(?5)表 示,采用t检验;P<O.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1各组大鼠凝血指标检测结果比较(表1):凝血 功能异常组大鼠PLT,FI和AT一?均较正常对照 组明显降低(P均<0.01),APTT,D一二聚体和PT 则均较正常对照组显着升高(JP均<0.01);AT一? 治疗组上述各项指标均有所恢复,并接近正常对照 组水平(P均>0.05),与凝血功能异常组比较差异 均有显着性(P均<0.01). 2.2各组大鼠血生化指标检测结果比较(表2):凝 血功能异常组大鼠ALT,AST,ALP和LDH均较 正常对照组明显升高(P均<0.01);AT—m治疗组 各项指标均显着降低,接近正常对照组水平,与凝血 功能异常组比较差异均有显着性(P均<0.O1). 表2各组大鼠血生化指标检测结果比较(土,一8) Table2Comparisonofbloodbiochemistryindexes ofratsineachgroup(x~s.n一8)U/L 注:与正常对照组比较:P<O.Ol;与凝血功能异常组比较: ?P<O.01 2.3器官组织病理学观察结果:正常对照组肺组织 肺泡壁,肺泡大小,充气及肺泡间隔结构基本正常 (彩色插页图1);.肾组织可见.肾小球,肾小管结构基 本正常(彩色插页图2);肝组织中央静脉及肝细胞 结构尚清晰,肝细胞索排列尚整齐,肝细胞结构无明 显病变(彩色插页图3).凝血功能异常组肺泡有部 分实变,肺泡腔出血,红细胞破坏和凝集,有含铁血 黄素颗粒(彩色插页图4);.肾组织结构不清,.肾小球 肿大,球囊内有变形红细胞及少许蛋白,.肾小管细胞 高度变性,管腔不清,上皮严重变性及坏死,管腔内充满粉染液问质炎性细胞浸润(彩色插页图5);肝 小叶结构不清,肝细胞索排列紊乱,有肝细胞解离现 象,部分肝细胞肿胀,有灶性坏死,汇管区炎性细胞 浸润(彩色插页图6).AT—m治疗组肺组织结构基 本趋于正常,肺泡无塌陷,未见明显炎性细胞浸润 (彩色插页图7);.肾组织结构均明显恢复,结构趋正 常,肾小球清晰,肾曲管能分辨(彩色插页图8)肝 脏结构基本趋于正常,肝细胞索排列尚整齐,核浆结 构清晰,充血及炎症反应明显减轻,有少许空泡变 性,肝窦内皮细胞无明显增生(彩色插页图9). 3讨论 在MODS的发病诱因中,以感染性内毒素血症 为主,它可通过各种不同发病机制,其中包括凝血功 能异常及器官功能衰竭时体内代谢,免疫,体液因子 和各种炎症介质的改变,造成广泛的组织细胞缺血, 缺氧,血管内皮和血小板功能异常,并可出现能量代 谢紊乱,最终导致MODSj.DIC是MODS的一个 部分,不论是感染因素还是非感染因素,当发展到 中国危重病急救医学2007年3月第19卷第3期 ChinCritCareMed,March2007,VoI.19,N0.3 MODS时均可能引发DIC. 血液凝固是一系列凝血因子连锁性酶反应的结 果,正常机体的抗凝血系统与凝血系统维持动态平 衡状态,若平衡失调就有出血倾向或有形成血栓的 危险.抗凝血系统可分为抗凝血活酶及抗凝血酶两 类,AT一?是使凝血酶灭活的一种最重要的血浆蛋 白质,主要在肝脏合成,AT一?可使凝血酶灭活, 并通过xa的灭活而干扰血小板聚集,从而起到抗 凝血的作用.在机体遭受革兰阴性菌感染后,其细 菌,内毒素所造成的内毒素血症可破坏正常机体凝 血和抗凝血的平衡,启动凝血系统后,AT一?首先 被消耗而减少,FI下降,PT和APTT延长,PLT减 少;还可有D一二聚体,蛋白C(PC)等的变化;同 时还有纤溶酶原,组织纤溶酶原活化物和其抑制物 异常,从而导致DIC.这提示在重症感染合并 MODS时,其凝血,抗凝和纤溶系统功能紊乱,这在 MODS发生发展中具有重要作用. 对由感染引发的MODS发病机制的研究已明 确为内毒素导致的微循环障碍及炎症介质释放,导 致组织细胞损伤和坏死.我们试图从凝血及微循环 障碍角度进行研究,以证实AT一?阻断凝血,DIC 和微循环障碍,从而改善重要器官缺血,缺氧,使器 官功能得以恢复,达到预防和治疗MODS的目的. AT一?是血浆中抑制凝血的关键物质,约占血 浆总抗凝血酶活性的50,70,它可直接抑制凝 血酶,也可与凝血酶形成复合物抑制多种凝血因子 的活性;AT一?协同肝素与凝血酶形成复合物时, 由内源性或外源性凝血机制引起的凝血都可以被 AT—ill阻断.文献报道,AT一?在治疗脓毒症时, 可防治凝血功能紊乱,改善肺,肝,肾功能,从而阻止 肝,肾功能衰竭的发生..但在治疗严重感染和感染 性休克时,大剂量AT一?同时并用肝素不但不能降 低其病死率,还能明显增加出血的危险性. 本实验在注射外源性LPS后1h给予AT一? ?167? ,3h后观察相应指标,结果显示,治疗 25U/kg干预 组凝血,生化指标及组织病理学变化均得到明显改 善,并接近正常对照组水平.提示AT一?对早期细 胞功能受损和MODS有防治作用. 综上所述,AT一?在DIC早期即有明显下降, 测定AT一?水平对内毒素导致的DIC及MODS具 有早期诊断的价值.同时,AT一?能有效改善内毒 素血症大鼠凝血功能障碍,继而改善微循环和组织 供血,供氧,避免机体在内毒素攻击后演变为 MODS,对内毒素血症造成的器官损害有保护和治 疗作用,因此,在内毒素血症凝血功能障碍早期如能 预防性使用AT一?,则可避免因血中AT一?浓度 过低而造成的凝血功能障碍加重. 参考文献: 1LindseyDC,EmersonTEJr,ThompsonTE,eta1.Characteri— zationofanendotoxemicbaboonmodelofmetabolicandorgan dysfunction[J].CircShock,1991,34(3):298—310. 2deSousaJC,FerreiraR,CarricoF,eta1.AntithrombinII, physiologicphysiopathologicandlaboratoryaspects[J].Rev PortCardiol,1991,10(9):693—699. 3刘贵健,王宝恩,张永宏,等.重症感染并发多系统脏器功能衰竭 时凝血和纤溶系统变化的研究(J3.中华内科杂志,1996,35(10): 673—677. 4AmstutzP,MoyoJS.Disseminatedintravascularcoagulations [J].CahAnesthesiol,1996,44(3):219—228. 5MestersRM.MannucciPM,CoppolaR,eta1.Factor?aand antithrombinIIactivityduringseveresepsisandsepticshockin neutropenicpatients(J3.Blood,1996,88(3):881,886. 6FourrierF,ChopinC,GoudemandJ,eta1.Septicshock,multiple organfailure,anddisseminatedintravascularcoagulation, comparedpatternsofantithrombinII,proteinC,andproteinS deficiencies(J3.Chest.1992,101(3):816—823. 7InthornD,HoffmanJN,HartlWH,eta1.AntithrombinII supplementationinseveresepsis:beneficialeffectsonorgan dysfunction(J3.Shock,1997,8(5):328—334. 8刘玲,郭凤梅,邱海波.《2004严重感染和感染性休克治疗指南》 系统讲座(5)严重感染的重组活化蛋白c应用成分输血和深静 脉血栓预防(J3.中国危重病急救医学,2004,16(11):643—645. (收稿日期:2006—1O一1O修回日期:2007—01一10) (本文编辑:李银平) ? 启事? 全军急诊医学新进展学习班通知 解放军总医院第一附属医院承办的"全军急诊医学新进展学习班"将于2007年4 月16—20日在北京举行.学习班授予 全军继续教育学分1O分,欢迎军地急诊同行参加.学习班将邀请盛志勇院士以及 黎沾良,沈洪,林洪远,岳茂兴,李春盛,于学 忠,王仲,何忠杰等军内外专家授课.授课内容包括:白金10min急救理念与技术,急 诊学科建设与面临的问题,脓毒症进展, 急诊相关的外科感染,特种伤害救治进展,心肺复苏进展的实践,链式复苏,呼 吸的阶梯化管理,创伤小组急救管理原则, 创伤的液体复苏,急诊应激心理,8部位16点静脉穿刺置管的操作录像学习等. 报名地址:北京海淀区阜成路51号,解放军总医院第一附属医院急救部(邮 编:100037);报名联系人:何忠杰;联系电话: 010—66867361;Email:drhezhj@126.COrn. (解放军总医院第一附属医院急救部) 脓毒症大鼠肝组织基因表达的研究 A(×3000) 图1模型组肝脏超微结构 (正文见I56页) 8000)图2脓毒症基因表达谱芯片双色荧光标记叠加图 B(× Figure1Ultra—structureoflivertissuesinmodelgroup Figure2Diagramofdoublefluorescence mageofgeneexpressionprofilemicroarray 抗凝血酶一?对内毒素血症大鼠凝血功能异常的治疗作用 图1正常对照组肺组织病理变化(HE,×200) Figure1Pathologicalchange oflungtissuesincontrolgroup(HE,×200) 图4凝血功能异常组肺组织病理变化(HE,×200) Figure4Pathologicalchangeoflung tissuesincoagulation abnormalitygroup(HE,×200) 图7AT一?治疗组肺组织病理变化(HE,x200) Figure7Pathologicalchange oflungtissuesinAT-mgroup(HE,×200) 图2正常对照组肾组织病理变化(HE,×200) Figure2Pathologicalchange ofrenaltissuesincontrolgroup(HE,×200) 图5凝血功能异常组肾组织病理变化(HE,×200) Figure5Pathologicalchangeofrenal tissuesincoagulation abnormalitygroup(HE,×200) 图8AT一?治疗组肾组织病理变化(HE,X200) Figure8Pathologicalchange ofrenaltissuesinAT一?group(HE,×200) (正文见165页) 图3正常对照组肝组织病理变化(HE,×200) Figure3Pathologicalchange oflivertissuesincontrolgroup(HE,×200) 图6凝血功能异常组肝组织病理变化(HE,×200) Figure6Pathologicalchangeofliver tissuesincoagulation abnormalitygroup(HE,×200) 图9AT一?治疗组肝组织病理变化(HE,X200) Figure9Pathologicalchange oflivertissuesinAT一?group(HE,X200)