【doc】腺病毒壳蛋白抗原提取,鉴定及其抗血清的制备

【doc】腺病毒壳蛋白抗原提取,鉴定及其抗血清的制备 腺病毒壳蛋白抗原提取,鉴定及其抗血清的 制备 252'免疫学杂志~1994年第10卷第4期 1一 腺病毒壳蛋白抗原提取,鉴定及其抗血清的制备 吴志潮Dr.EficjUron一(福建省立医院小儿科福州350001) , R;2,3; A摘要本文报道作者于1992~1993年在澳大利亚应用DEAE唾phadexA?50层析法对腺病 毒群特异性抗原——六面体壳蛋白(Hera.)进行提取,纯化井免疫动物获得高效价的腺病毒群特异 性抗体.在抗原洗脱过程中分别在005M,02M和048M出现了3个波峰.壳蛋白的洗脱浓窿为 0.48M.为明确其生物学特性.作者应用SDS?PAGE电泳.证实其分子量大约为45KD.本文的实验 结果为解决腺病毒的诊断抗体提供了新的简便,经济的. 关键词毫酗塑经南 腺病毒与人类多种疾病的发生都有着密 切的关系.目前在诊断上,理想的特异性抗体 尚难获得,制备理想的诊断学清,必需要有纯 化的特异性抗原.已知腺病毒的群特异性抗 原是来自六面体壳蛋白(Hexoa)[],以纯化的 六面体壳蛋白免疫动物,即可获得群特异性 的诊断抗体.因此如何分离和纯化壳蛋白抗 原是当前解决腺病毒诊断抗体的重要一步. 目前国内对这方面的报道甚少.作者于1992 , 1003年在澳大利亚皇家儿童医院.在Dr. EricUron指导下改进了DEAESephadexA.50 层析柱方法.获得了满意结果.兹将方法及其 生物学特性报道如下; 1材料与方法 1.1材料 1.1.1病毒株:Ad2由皇家儿童医院病毒室 提供. 1.1.2细咆培养:Holacoil(RhinoSensRJve) 由Dr.Tyroll惠赠. 1.1.3抗腺病毒壳蛋白的单克隆抗体:由 Dr.J.C.deJong惠赠. 1.1.4白兔:由皇家儿童医院动物室供给. 1.2方法 1.2.1抗原提取I将Ad2接种于Hela细咆 培养管及培养瓶,按常规培养,增殖至20ml '车文为中国国际人才交瀛协台资助的项丑 一指导老师-澳太刺亚皇家儿童医院病毒室.墨尔车.3052 后接种于2个Roux瓶中,用含2胎牛血清 的190液培养2d.PBS洗3次后改用不叠 牛血清的109液培养,CPE呈*什后收获并反 复冻融3次,超声粉碎,7000r/mia(1000g) 离心10rain,取上清液用AmJcon(Filter10PM 10)透析浓缩至20ml. 1.2.2抗原纯化:采用层析柱法.取DEAE sep|lodoxA-5028,加100ml0.01M,pH7.1 PBS使其充分饱和.负压除气泡后装柱 (Pharmacia).加入样本前先以不含NaC!的 PBS(0.01M,pH7.1)50ml平衡.然后缓缓加 入样本.继而以含不同克分子浓度的NaCI的 PBS(0.01M,pH7.1)进行浓度梯度洗脱. 1.2.3动物免疫及血清抗体提纯:动物免疫 按文献进行E,抗体提纯采用硫酸铵沉淀法. 1.2.4SDS.PAGE电泳:按文献进行E". 2结果 2.1在抗原的洗脱过程中,在NaC!为 0.05M,0.2M,和0.48M时得到了3个波峰 (Pharmacia自动记录仪记录,见图1). 2.2以抗腺病毒壳蛋白的单克隆抗体 (McAb)对3个渡峰的洗脱液进行检测,以 PBS为空白对照,以同等条件冻融,超声粉 碎,离心后的Holacell上清液为阴性对照,结 果证明壳蛋白抗原的洗脱浓度为0.48M(见 t免疫学杂志H994年第10卷第4期253 表1). neX0n O5M.2OM.48M 卜】aCf 囤1应用DEAESePl1axA一层析柱浓度梯度 法洗脱抗原蛋白.于0.帖M.0.2M.0.48M时 得到3十波峰(m01M.PBS.pH7.1) Fig1ResultsobtainedfromchromatograpiLvofAd2 oRDEAE!%phedexA.50showed3peaks.with ant噜enelutionbygradientincreaseolNaC1 addedtophosph丑tebuffer.0-01M-pH7-1 表1抗腺病毒壳蛋白MCAb对3十波峰洗脱 液ELISA世驯结果 TabIThe3fractionsfromDEAESeDhadexA一50 ~lotiontested=sainstanti—hexonMeAbin ELISA SampleOpticm[density(×100) Frac【ion 0.05M 0.20M 0.48M Control btank n8gtire 20 2{ ll8 15 17 2.3诊断抗体1:2000稀释后对腺病毒各 亚群代表抹检测的结果表明,该抗体具有群 特异性和敏感性,对各亚群腺病毒均能结合 (见表2). 2.4壳蛋白抗原分子量测定SDS.PAGE电 泳结果证明:所分离出的蛋白抗原比较纯,它 的分子量大约为45KD(见图2). 表2诊断抗体对雎病毒各亚拜代表埠ELISA 挂语?的结果 Tab2ELISAreactivityofsnti—hexonantibodywith selectedstrainsofadenovirtlsfromeach ,ubgroup SampleKnown哪bBmupOpticaldensity(×100) ?磷xl8 ?1l一 2一 ?, 一 一 二麓, ' 譬一 囤2SDS-PAGE电津结果表明腺病毒壳蛋白钪 原的分子量大约为45KD Fig2SOS-polyacrilamidegdelectrophoresisshowed themolecularweightofhexonwasaboot4; KD 5讨论 ' 目前国内在腺病毒的诊断上,大多还是 254《免疫学杂志)1994牛幕10卷幕4期 采用电镜,聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法.新近 有的采用多聚酶链反应和限制性内切酶的方 法.这些方法存在着一定的条件局限性,且代 价较高,不易普及,而应用诊断抗体则能克服 上述的缺点.但报道者甚步.在制备腺病毒特 异性抗体上,以往免疫动物多采用完整的病 毒颗粒,但通过密度悌度离心所分离出的病 毒颗粒中还多少夹杂一些组织培养细咆和培 养液中的蛋白质,这些都影响到抗原的纯度 和抗体的滴度.作者亦曾发现此法所制备出 的抗血清可与Helacell上清液呈假阳性反 应.此外.此法分离出的病毒颗粒中还可能有 相当一部份仍是活的病毒.用于免疫动物时 剂量难以掌握.本文所介绍的方法则无以上 的缺点.且在技术操作上也较为简便易行,成 本也低.所分离出抗原蛋白纯度较高,免疫动 物后能获得特异性强,效价高的抗体,有实用 和推广的价值. 此外.作者在洗脱过程中仅见3个波峰, 因此认为今后提取腺病毒壳蛋白时只需用 0.05M,0.2M和0.48M三种浓度的NaC1.这 样可以大大节约时间和材料. 参考文献 1郑卷明,蚝学军?向j匠敏,等(译).医用瘸奉学.第一版. 北京t科学出版社,1990-416,428 2Sper??D,K?o,McLmeAR,n.The呻f-donof M,irali~rlinaIoad~lrusVoup(b)antiSm.tobe usedforimmunofluccclcntde"曲n州thdlffer~taden- ovtrm~.ArO;vFarDieC-~lantlt~V.删,ht'dIur,1971I 3l一340 3Si~h-NazN.N卫RX?I)evelopmamtandapplicationof ?n?I"lIlarutbodi~f.|q嗍cd戚睇Uol1ofhud把一 tic|dnoviru?曙.Ja删叮od,1986~23l840 (1994年1月25日收膂-1994年5B28日回) Purification,CharacterizationofAdenovirusGroupAntigen-Hexon. andPreparationofIt,sAntiserum Wu.Er/c' (脚l酬Ped~la./cs,曲H聊日坤,"Faz~350001) AbWcaetUsingDEAE-SephadexA一 50Column?wesu~ssfuUypurifiedadenovirusgToupantigcn---he~on.IlIgh tRcran~bodieswefeachievedbyimmunizingthanimalwiththepurifiedan【i自 en-Intheprocessofehromatogmishy. therewere3peakswhenthemor;竹 ofNaC1wa90.95M.m2OMand0.48M-andl~xonantigenwa9e『u喇at0. 48M-TheSDS-PAGEshowedthemolecularweightofhexonantigenwasabout45KD.Thest ucb,willhope~beni~it preparingdiagnosticant;bodiesagainstedenoviruses. KeyoI曲Adenovirus.xOn Fr.mmu.nologicalJournal1994l1o(4):252] 'D'哪Io|?V]ru~?I.ry,RoyalaU"阽呐Hospital,Ausmdia,3092 3 皂 疰 学