花生蛋白质的亚基组成及分子量研究

花生蛋白质的亚基组成及分子量研究 () 广西师范大学学报自然科学版第 16 卷 第 1 期V o .l 16 N o. 1 1998 年 3 月 1998JOU RN A L O F GU A N GX I N O RM A L U N IV ER S IT Y M a rch 3 花生蛋白质的亚基组成及分子量研究 ))))1233 韦 一 能陈 元 发陈 国 汉陈 全 斌 ( ) ) 1广西师范大学生物系, 541004, 桂林; 2广西师范大学化学化工系, 541004, 桂林;) )3广西师范大学计算分析测试中心, 541004, 桂林; 第一作者 57 岁, 男, 副教授 摘 要 花生蛋白质乳状液, 及其经等电聚焦, 或用硫酸铵分级分离后, 分别进行 2结 , SD SPA GE 果都显出 18 条比较明显的区带 1 这 18 条区带在凝胶柱上的分布情况可自然地分成, , , 4A B C D 个区域. 其中, , , , , , , 等 8 条区带, 在不同等电点蛋白质, 不同饱和度的硫酸铵 A 1 B 1 B 2 B 3 C 3 C 4 C 6 D 8 所沉淀的蛋白质, 以及乳状液中的蛋白质, 都共同显出的主要区带. 它们的分子量分别是 0. 40, 2. 8, 3. 4, 3. 8, 5. 2, 5. 4, 5. 6, 7. 8 万. 这 8 条区带的蛋白质亚基或肽链可能是构成花生蛋白主要组 成的亚基或肽链. 由于区带比较细小, 而区带在不同等电点、不同饱和度硫酸铵所沉淀的蛋 A 1 D 3 白质中差异比较明显, 因此, , , , , , 等 6 条区带的蛋白亚基或肽链是构成花生球蛋白 B 1 B 2 B 3 C 3 C 4 C 6 的主要亚基或肽链; 而区带的蛋白亚基可能是伴花生球蛋白的一种组成.D 3 关键词 花生蛋白; 等电聚焦; 2蛋白亚基; 分子量 ; SD SPA GE 629. 73分类号O () ( ) 为了研究花生 种子中蛋白质 下称花生蛋白的主要种类和等电点, 我们曾经采 P ean u t ()用聚丙烯酰胺凝胶电泳 、等电聚焦、等电聚焦后进行 、醋酸纤维薄膜电泳等方 PA GE PA GE 1 法对花生蛋白进行了分析, 结果显示, 等电聚焦可显 11 条区带, 其中 6 条很明显, 说明花生 至少有 11 类不同等电点的蛋白质. 等电点分别为 4. 3, 4. 5, 5. 1, 5. 4, 6. 5, 6. 7 的蛋白质是主要 的, 它们的聚丙烯酰胺凝胶电泳和花生蛋白乳状液的醋酸纤维薄膜电泳的结果都有 3 条区带, 其中 2 条比较明显, 说明花生蛋白有两种主要组分和一种次要组分. 为了研究花生蛋白主要种 类的亚基组成及其分子量, 本研究对花生蛋白乳状液采用十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电 ()泳2、等电聚焦后将主要区带的蛋白质进行 2、以及硫酸铵分级分离后 SD SPA GE SD SPA GE 进行 2等方法对花生蛋白进行分析研究.SD SPA GE 3 国家自然科学基金资助课题 收稿日期 1997 09 22 1 实验部分 1. 1 材料及蛋白质的提取 供试材料有粤油 116、汕油 527 等. 花生果经人工剥壳, 去掉红衣和胚, 并研磨成粉. 称取 () 花生粉数克, 加 4, 5 倍体积的提取缓冲液 0. 1 ƒ2缓冲液, 8. 3, 于研钵中研 m o lL T r isH C l pH () 磨成浆, 离心 1 500 去掉沉淀和上浮的奶油层, 取乳状液备用.ƒ15 , rm in m in 1. 2 硫酸铵分级分离 在花生蛋白乳状液中加硫酸铵粉末, 使成 40% 的饱和度, 置于冰箱中沉淀 1, 2 , 离心后 h 沉淀留作电泳加样用, 上清液加硫酸铵粉末, 使成 70% 的饱和度, 置于冰箱中沉淀 1, 2 , 离 h 心后沉淀留作电泳用, 上清液加硫酸铵饱和, 置于冰箱中沉淀 1, 2 , 离心后上清液弃去, 沉 h 淀留作电泳用. 经不同饱和度的硫酸铵处理后, 所产生的沉淀用 2分析.SD SPA GE 1. 3 电泳 花生蛋白乳状液直接进行 2乳状液等电聚焦后, 分别取未经固定染色的凝胶; SD SPA GE () (3, 4. 5, 5. 1, 5. 4, 6. 5, 6. ) 柱上 6 种不同等电点 的蛋白质 分别为 4. 7, 分别进行 2 p Ip I SD S ; 硫酸铵分级分离后, 用 2分析. 2具体操作大体上按文献2 的方PA GESD SPA GE SD SPA GE 法进行, 本实验有变动, 分离胶浓度为 11% 左右, 8. 8; 浓缩胶的浓度为 4. 5% , 6. 8; 稳压 pH pH 在 160 . 等电聚焦的具体操作和等电点的测定基本上按文献3 的方法进行.V 1. 4 染色、等电点测定及光密度扫描 ( 等电聚焦结束后, 凝胶柱用 12% 固定 2 . 用考马斯亮蓝 染色液 考马斯亮蓝T CA hR 250 ) 0. 2 , 加 50% 甲醇 91 和冰乙酸 9 染色 5 . 用乙醇: 冰乙酸?水= 25 ?10 ?R 250 g mL mL h () 65 ƒ脱色液脱色. 将未用 固定的凝胶柱的两端用水洗净, 按顺序切成 0. 5 长的小 vvT CA cm () 段, 各段分别浸泡于 1. 0 蒸馏水中过夜, 测 值. 以凝胶柱长度 为横坐标, 值为 mL pH mm pH 3 纵坐标, 作图得 梯度曲线, 量出染色的各蛋白带的距离, 对照曲线查出各带的等电点.pH ( ) 2结束后, 凝胶柱用固定液 25% 异丙醇210% 乙酸水溶液固定 3 以上, 然后 SD SPA GE h ( ) 用考马斯亮蓝 染色液 0. 15 考马斯亮蓝 溶于 100 的固定液中染色 2, 3 , 用R 250 g R 250 mL h 4 10% 乙醇漂洗并保存. 凝胶柱所显出的区带用岛津 2910 双波长 扫描仪进行扫描, 计算出各区带蛋白质 C STL C 的百分含量. 1. 5 分子量测定 经 2后, 根据样品中蛋白质在凝胶柱上的迁移率, 从蛋白质曲线查出它们 SD SPA GE 的分子量. 所用的标准蛋白质为 公司产品.P h a rm a ia 2 结果 2. 1 花生蛋白乳状液的 - 结果 SD SPA GE 花生蛋白乳状液的 2结果如图 1 所示, 实验结果表明, 花生蛋白乳状液直接进SD SPA GE 行 2可显出 18 条区带. 根据这 18 条区带在凝胶柱上的分布情况, 由正极端向负极 SD SPA GE 端, 可明显分为个区域. 将各区域的区带由正极端向负极端按顺序进行编号. 所显 , , , 4 A B C D 出的区带的相对迁移率及分子量见表 1. 所显出的区带中, , 两带特别明显, 其次是 , B 1 D 3 A 1 , , , , , , 等区带, 其余区带比较细小. 由于 , 区带的蛋白质含量较高, 其A 3 A 4 B 2 B 3 C 3 C 4 C 6 C 3C 6 相对迁移率又比较接近, 所以常连在一起呈一条粗带. 光密度扫描结果, , , , 4 个区域蛋 A B C D 白质的百分含量分别为 25. 5, 25. 6, 26. 7, 21. 7. 图 1花生蛋白乳状液的 2图 SD SPA GE 花生蛋白乳状液的 - 区带的迁移率及分子量 SD SPA GE 表 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 区带编号A 2 C 1 C 2 D 1 D 2 D 4 D 5 A 1 A 3 A 4 B 1 B 2 B 3 C 3, 6 D 3 迁移率 0. 98 0. 93 0. 89 0. 83 0. 77 0. 72 0. 68 0. 63 0. 61 0. 54 0. 44 0. 41 0. 34 0. 24 0. 14 () 分子量 万0. 40 0. 95 1. 40 2. 00 2. 80 3. 40 3. 80 4. 40 4. 60 5. 40 6. 60 6. 90 7. 80 8. 90 10. 00 3 明显区带 3 3 特别明显区带 2. 2 花生蛋白乳状液直接进行等电聚焦的结果 1 花生蛋白乳状液直接进行等电聚焦, 结果表明, 在凝胶柱上显 11 条区带. 将显出的 11条区带由正极端向负极端按顺序进行编号. 在所显出的区带中, 第 1, 2, 4, 6, 7, 9 等 6 条区带 ( ) 等电点分别为 4. 3, 4. 5, 5. 1, 5. 4, 6. 5, 6. 7比较明显, 尤其是第 6 条区带特别明显; 第 3, 5, 8 条区带为扩散带; 第 10, 11 两条为很细的带. 花生蛋白乳状液经等电聚焦后, 分别取未经染色、固定的凝胶柱上的 6 条主要区带的蛋白 质, 进行 2结果如图 2 所示. 根据 6 条区带的蛋白质所显出的区带在凝胶柱上的分 , SD SPA GE 布情况, 由正极端向负极端也明显分为个区域. 各区域的区带与花生蛋白乳状液 , , , 4 A B C D 直接进行 2的结果基本上是一致的. 所显出的区带中, , 区带也是最为明显的,SD SPA GE B 1 D 3 其次为, , , , 等区带, 其余区带比较细小. 不同等电点的蛋白质相比, 所显示的主要 B 2 B 3 C 3 C 4 C 6 区带基本相同, 即, , , , , , , 等区带在 6 类不同等电点的蛋白质中都普遍存 A 1 B 1 B 2 B 3 C 3 C 4 C 6 D 3 ( )在, 而且除区带外, 其余区带的含量一般无明显的规律性差异 见图 2 和表 2. 不同等电点 D 3 蛋白质的主要差异是, 区带在不同等电点的蛋白质中差异比较明显. 由图 2 表 2 可见, 等电 D 3 点较低的蛋白质含量较低, 反之则较高; = 5. 4 的蛋白质的, , 区带很明显, 而其他等p IA 2 A 3 A 4 5. 电点的蛋白质的, , 区带几乎未见显出; = 的蛋白质的 两区域的蛋白质含 4 , A 2 A 3 A 4 p IB C 量有所降低. 图 2 不同等电点的花生蛋白的 2图 SD SPA GE 1 p I= 4. 3 2 p I= 4. 5 3 p I= 5. 1 4 = 5. 45 = 6. 56 = 6. 7p I p I p I 表 2 不同等电点的花生蛋白主要区带的蛋白质的百分含量 等电点A 1 B 1 B 2 B 3 C 3 C 4 C 6 D 3 4. 3 6. 9 21. 5 6. 1 3. 3 9. 4 18. 6 12. 7 4. 3 4. 5 10. 5 22. 6 6. 5 3. 6 10. 0 16. 6 12. 7 5. 4 5. 1 13. 2 24. 1 6. 6 4. 0 11. 1 15. 9 9. 4 7. 1 5. 4 19. 1 12. 0 3. 6 2. 9 7. 2 7. 8 5. 8 9. 8 6. 5 9. 3 19. 6 7. 6 4. 9 10. 5 12. 7 9. 8 17. 3 6. 7 8. 3 22. 4 8. 1 4. 8 8. 6 12. 8 7. 4 27. 2 2. 3 花生蛋白乳状液经不同饱和度硫酸铵分离的结果 花生蛋白乳状液经 40% , 70% 和 100% 硫酸铵饱和度溶液分离后, 分别用 2分SD SPA GE 析, 结果如图 3, 4 和表 3 所示. 结果表明, 花生蛋白经 40% 硫酸铵饱和度溶液分离后, 2 SD S () 可显出 18 条区带 , 不明显, 在图 3 右图未画出, 所显出的区带在凝胶柱上的分 PA GE C 5 D 5 布情况, 也可明显分为个区域, 其电泳图谱与蛋白乳状液直接进行 2图 , , , 4 A B C D SD SPA GE 谱基本相同, 不同的是, 40% 饱和度分离的蛋白质, 区带的蛋白质含量很低; 经 70% 饱和度 D 3 分离的蛋白质 2所显出的电泳图谱与 40% 饱和度的基本相同, 区带在凝胶柱上的SD SPA GE 分布情况大体上也可分为个区域, 不同的是, , 区域的蛋白质含量比 40% 饱和 , , , 4 A B C D B C 度的有所下降, 区带的蛋白质含量有所上升; 经饱和硫酸铵分离的蛋白质 2图谱 D 3 SD SPA GE 和 70% 饱和度的图谱也大体相同, 不同的是, 区带的蛋白质含量明显上升占 40. 6% ; 而D 3 40% 和 70% 饱和度的只分别占 8. 9% 和 10. 4% , , 区域的蛋白质含量也明显降低, 区带 B C A 2 较为明显 1 图 3 经不同饱和度的硫酸铵分离的花生蛋白的 2图 SD SPA GE 表 3经硫酸铵分级分离的花生蛋白 - 图的每个区域的蛋白质百分含量 SD SPA GE 硫酸铵饱和度A B C D 40% 26. 6 34. 3 25. 8 8. 9 70% 29. 4 26. 9 14. 4 10. 4 100% 24. 8 16. 4 10. 0 40. 6 乳状液 25. 5 25. 6 26. 7 20. 4 3 讨论 ) 1花生蛋白乳状液的 2结果可显出 18 条区带, 它们在凝胶柱上的分布情况, 可 SD SPA GE 图 4 经硫酸铵分级分离的花生蛋白 2图的光密度扫描曲线 SD SPA GE 自然地分为个区域. 在这 18 条区带中, 主要区带有, , , , , , , , , , , 4 A B C D A 1 A 2 A 3 A 4 B 1 B 2 B 3 C 3 , , 等; 乳状液经等电聚焦后, 进行 2结果等电点为 5. 4 的蛋白质图谱和乳状 , C 4 C 6 D 3 SD SPA GE 液直接进行 2图谱基本一致, 即也可分为个区域, 所分出的主要区带也 , , , 4 SD SPA GE A B C D 相同, 各区带相应的显现程度也基本一致; 乳状液经 40% 饱和度硫酸铵溶液分离后, 进行 2图谱中除区带明显降低外, 其余与乳状液的图谱几乎没有差异. 由以上可以看 , SD SPA GE D 3 出, 花生蛋白乳状液的 2所分离出的 18 条区带中的每一条区带, 主要是一种蛋白质 SD SPA GE 亚基或肽链. ) 2从乳状液直接进行 2、等电聚焦后将不同等电点的蛋白质进行 2、 SD SPA GESD SPA GE硫酸铵分级分离后进行 2结果均共同显出, , , , , , , 等 8 条区带. , SD SPA GE A 1 B 1 B 2 B 3 C 3 C 4 C 6 D 3 可见这 8 条区带的蛋白质亚基或肽链是构成花生蛋白的主要组分. 从硫酸铵分级分离的蛋白 质的 2结果看, 经 40% 饱和度的硫酸铵分离的蛋白质含量较高, 区带的蛋白亚基 SD SPA GE D 3 或肽链的含量较低; 而 70% 的饱和度和饱和硫酸铵溶液分离的蛋白质, , 两区域的蛋白质 B C 含量明显降低, 区带的蛋白亚基或肽链明显升高. 根据有关资料认为, 硫酸铵饱和度为 40% D 3 饱和度时, 所析出的组分为花生球蛋白, 高于 40% 饱和度时, 所析出的组分是伴花生球蛋 5 白. 以上说明, 花生蛋白 2所分离出的个区域的蛋白质亚基或肽链中,, , , 4 SD SPA GE A B C D , 两区域的蛋白亚基或肽链是构成花生球蛋白的主要组分, 而区带的蛋白亚基或肽链可 B C D 3 能是伴花生球蛋白的一种组分. , 区域主要有, , , , , 等 6 种主要蛋白亚基或B C B 1 B 2 B 3 C 3 C 4 C 6 肽链, 因此花生球蛋白主要由这 6 种亚基或肽链构成. 这一结果与有关报导大体上是一致6 1 的. 我们曾做过, 花生蛋白乳状液的醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦后将不同等电点的蛋白 质进行 结果均显出两条主要区带和一条次要区带. 说明花生蛋白具有两种天然状态的 , PA GE 蛋白主要组分和一种次要的天然组分. 因此, 花生蛋白的 2所显出的 6 种主要蛋白SD SPA GE 亚基或肽链是构成这 3 种天然组分的主要亚基或肽链. 至于这 3 种天然组分分别由哪些亚基或肽链构成, 以及这 3 种天然组分的分子量如何? 还有待于进一步的研究. 区域的, , A A 2 A 3 A 4 区带只在个别等电点的蛋白质中出现, 它们的等电点不受其它蛋白质影响, 而且在 70% 饱和 度和饱和硫酸铵溶液中容易分离析出. 因此, 这几条区带的蛋白亚基或肽链具有相应的独立 性. 它们的结构、性质和功能很值得研究. ) 3用 40% 饱和度的硫酸铵溶液分离花生蛋白质时, 可分离出部分区域的蛋白质. 再 , B C 用 70% 饱和度和饱和硫酸铵分离时, 仍可分离出区域的蛋白质. 这说明用某种饱和度的 , B C 硫酸铵分离花生蛋白时, 未能将某一种或某一类蛋白质完全分离出, 只分离出一部分. 这在应 用上是值得注意的. ) 4本研究所测定的亚基或肽链, 是花生蛋白的总体体现, 研究表明, 花生蛋白包含有多种 类蛋白质, 这些亚基或肽链是花生蛋白经 2分析处理过程中, 从多种类蛋白质中解 SD SPA GE 7 离出来的, 并未表明这些亚基或肽链是怎么组成花生蛋白质的. 据文献报导, 在蛋白质溶液 中加入 和巯基乙醇后, 巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原; 能使蛋白质的氢 SD S SD S 键、疏水键打开, 并结合到蛋白质分子上, 形成蛋白质2复合物; 由亚基或两条以上肽链组 SD S 成的蛋白质, 在 和巯基乙醇的作用下, 解离成亚基或单条肽链, 因此本研究所测定的是花 SD S 生蛋白质亚基或肽链的分子量. 本研究成功的关键在于应用 的提取缓冲液, 使具有最高等电点的花生蛋白质种类 8. 3 pH 完全呈乳液状态溶于提取液中, 而不乳化的淀粉、纤维素、半纤维素可藉离心而除去; 采用适当 (() ) 的离心速度 1 500 和一定时间 15 可使不乳化微粒沉淀, 而花生蛋白微粒仍存在 ƒrm in m in 离心液中, 并使乳脂球上浮除去, 再经过静置一昼夜, 在溶液中部取得较纯净的、完全脱脂的花 生蛋白乳状液进行测定. 如果含花生油脂, 则实验难于成功. 除了上述的对研究的花生蛋白质 的纯化工作外, 还有硫酸铵分级分离, 等电聚焦电泳等操作纯化过程, 更重要的是本研究是应 用电泳法, 除具有本研究的测定意义外, 电泳本身具有高度的纯化功能; 在被测定的蛋白质和 + + () 电泳液中虽然还会含有少量的无机盐 , 及小分子的有机物, 但不会影响测定结果, 又 K N a 因对吸附蛋白质的凝胶柱采用特定的固定液、染色液、脱色液和洗脱液处理, 这些操作均具有 纯化作用. 对本研究的可信性具有实际意义的佐证, 是从乳状液直接进行 2等电聚焦后 , SD SPA GE 将不同等电点的蛋白质进行 2硫酸铵分级分离后进行 2它们的结果, 均 , , SD SPA GE SD SPA GE 共同显出, , , , , , , 等 8 条区带, 不但证明了这 8 条区带的蛋白质亚基或肽 A 1 B 1 B 2 B 3 C 3 C 4 C 6 D 3 链是构成花生蛋白的主要成分, 而且有力地证明了本研究未曾受杂质的干扰和研究的可靠性. 参 考 文 献 () 韦一能, 陈元发. 花生蛋白质的主要种类和等电点的研究. 广西科学, 1995, 2 4: 1, 5 1 () 梅百根. 蛋白质的双向凝胶电泳. 植物生理学通讯, 1983, 5: 52, 54 2 袁玉荪. 生物化学实验. 北京: 高等教育出版社, 1979, 48, 68 3 () 刘广田, 刘明辉. 普通小麦胚乳谷蛋白亚基的遗传研究. 中国农业科学, 1988, 21 1: 5 086 4 , . : ? Jo hm so n P e t a lT h e g lo bu lin s o f th e g ro undnu t L e lec t rop ho re t ic exam ina t io n o f th e a rach in sy s2 5 , 395. , 1954, 5: 378temB io ch em B iop h yπs A c ta 6 , . . , 1979, 43: 2 583, 2 Yam ad s J e t a lIso la t io n and som e p rop e r t ie s o f a rach in subun it sA g r ic B io l C h em 568 7 张龙翔, 张庭芳等. 生化实验方法和技术. 北京: 人民教育出版社, 19811112, 118 STU D Y O N SU BU N IT COM PO S IT IO N A N D M O L ECU L A R W E IGH T O F P EA N U T PRO T E IN S 1) 2) 3) 3)W e i Y in en gChen Y uan fa Chen Quan b in Chen Guohan ( )1, , 541004, , ; D ep a r tm en t o f B io lo gyGuangx i N o rm a l U n ive r sityGu ilinPR C)2, , 541004, , ; D ep a r tm en t o f C h em ist ry and C h em ica l E ng inee r ingGuangx i N o rm a l U n ive r sityGu ilin PR C ) )3, , 541004, , Com p u te r and A na ly sis T e st ing C en t reGuangx i N o rm a l U n ive r sityGu ilin PR C A bstra c t A ll th e exp e r im en t re su lt s o f th e p ean u t p ro te in em u lsio n v ia iso e lec t ro fo cu sin g 2, th en SD SPA GE th e em u lsio n v ia p rec ip ita t io n b y amm o n ium su lfa te o f d iffe ren t sa tu ra t io n 22deg ree th en SD SPA GE an d th e SD SPA GE o f em u lsio n o b v io u sly show e igh teen st r ip . , , . , zo n e sT h ey co u ld b e d iv ided in to A B C an d D fo u r a rea s in ge l co lum nA m o n g th em , , , , , , , A 1 B 1 B 2 B 3 C 3 C 4 C 6 D 3 a re e igh t m a in st r ip zo n e s an d th ey co u ld b e o b se rved in th e , p ean u t p ro te in s o f d iffe ren t iso e lec t r ic po in t sth e p ro te in s p rec ip ita ted b y amm o n ium su lfa te . 4o f d iffe ren t sa tu ra t io n deg ree an d th e p ro te in s in em u lsio nT h e ir m o lecu la r w e igh t s a re 000, 28 000, 34 000, 38 000, 52 000, 54 000, 56 000, 78 000, . re sp ec t ive lyM ayb e th e p ro 2 te in su b u n it s o r p ep t ide ch a in s o f th e se e igh t st r ip zo n e s a re th e m a in com po n en t s o f p ean u t . , p ro te in sB ecau se A 1 zo n e is m u ch th in n e ran d th e d iffe ren ce o f D 3 zo n e s b e tw een th e p ro 2 te in o f d iffe ren t iso e lec t r ic po in t s an d th e p ro te in p rec ip ita ted b y amm o n ium su lfa te o f d iffe r2 en t sa tu ra t io n deg ree is m o re o b v io u s, th e p ro te in su b u n it s o r p ep t ide ch a in s o f B 1 , B 2 , B 3 , C 3 , C 4 an d C 6 six st r ip zo n e s a re th e m a in com po n en t s o f a rach in. M ayb e th e p ro te in su b u n it s .o f D 3 zo n e a re a com po n en t p a r t o f co a rach in ; ; 2; p ro te in su b u n it; m o lecu la r Key worde s p ean u t p ro te iniso e lec t ro fo cu sin gSD SPA GE w e igh t () 责任编辑 王龙杰