负载人miR-29a复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

负载人miR-29a复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定 负载人miR-29a复制缺陷型腺病毒的包装 及鉴定 西南国防医药2011年10月第2l卷第10期'1045? ? 论着? 负载人miR一29a复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定 高军,范亚川,王军,熊晓峰,吴友良,刘志鹏,陈陵,李学成 [摘要】目的包装负载人miR一29a前体全长cDNA(pre—miR-29a)的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-miR29a).方法 将pre.miR一29a全基因合成后,插入腺病毒穿梭质粒pDC315,与腺病毒包装质粒pBHGloxDehaE1,3Cre共转染人胚肾293 细胞(HEK293),包装重组慢病毒Ad—miR29a,扩增,收集并纯化.对纯化后的Ad-miR29a进行滴度测定,感染性鉴定及PCR 鉴定.结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×10pfu/ml.PCR鉴定Ad-miR29a 可扩增出pre—miR一29a特异片段,而对照Ad-LacZ不能扩增出pre—miR一29a特异片段.Ad—miR29a感染人胃癌SGC一 7901细胞后,可明显提高miR一29a的表达丰度.结论成功包装了负载miR一29a的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究 microRNAs在肿瘤发生发展中的作用,以及miR-29a在肿瘤治疗中的价值奠定了基础. [关键词]微小RNAs;hsa-miR一29a;人胚肾293细胞;复制缺陷型腺病毒载体 中图分类号R735文献标识码A 文章编号1004—0188(2011)10-1045—04doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2011.10.001 Packageandidentificationofreplication?deficientadenoviruscarryinghsa-miR-29a GaoJun.FanYachuan,WangJun,XiongXiaofeng2,WuYouliang, LiuZhipeng,ChenLing,LiXuecheng21.Pharmaceutical PreparationSection,2.DepartmentofGastroenterology,Hospital324ofPLA,Chongqing,40002O,China [Abstract]ObjectiveToconstructthereplication— deficientrecombinantadenovirus(Ad-miR29a)carryingwholecDNAof Ad.miR29a(pre.miR一29a.MethodsThepre.miR一29asequencewasinsertedintomuhi —clonesiteofpDC315insense directionandidentifiedbyendonucleasedigestionandDNAsequenceanalysis.TherecombinantplasmidpDC315一miR29awas transfectedintoHEK293celltogetherwithplasmidpBHGlox(dehaE1,3)containingadenoviralgenome,thenthereplication?deficient recombinantadenovirusexpressionvectorofpre.miR一29a(Ad— miR29a)wasobtained,andidentifiedbyinfectingtestandPCR amplification.ResultsRecombinantAd.miR29ashowedgoodinfectivitv.Afterpurificationandconcentration,itstiterreached5×10 pfu/m1.Thepre.miR一 29aspecial~agmentcouldbeamplifiedbyPCRfromAd.miR29ainsteadofcontrolAd— LacZ.Conclusion Ad.miR29aiSsuccessfullyconstructed.ItprovidesanexperimentalbasistofurtherstudytheroleofmicroRNAsintheoccurrence anddevelopmentoftumorsandthevalueofmiR一29ainoncotherapy. [Keywords]microRNAs;hsa—miR.29a;HEK293;replication.deficientadenoviralvector microRNAs(miRNA)是一种小分子非编码RNA, 是最大的一类基因表达转录后调控因子,在细胞增 殖,分化和凋亡等多种生理过程中发挥着重要的作 用.微量的miRNA即可通过靶蛋白而产生明显的调 控功能].近年来有关miRNA与多种癌症的关系已 经得到证实,并且成为当前研究的热点.越来越多的 研究发现,部分miRNA在癌症中起着癌基因和抑癌 基因的作用,而且某些miRNA与诊断和预后有关,具 有一定的临床意义和良好的应用前景".研究趋 势表明,基于miRNA层面的肿瘤基因治疗正在成为 肿瘤治疗的一个新的方向J.Xiong等近期发现, miR一29a可显着抑制HCC细胞在裸鼠形成肿瘤的能 力,促进肝细胞癌凋亡.表明miR.29a在HCC凋亡 基金项目:重庆市自然科学基金资助项目(CSTC2008BB5274: CSTC2009BB5314;CSTC2010BB5158) 作者单位:400020重庆,解放军324医院药剂科(高军, 吴友良),消化内科(范亚JII,王军,熊晓峰,刘志鹏,陈陵, 李学成) 通讯作者:陈陵,E—mail:lingcong_o08@126.corn;李学成,E— mail:1ixuecheng1967@sohu.com 调控和分子病因中的重要作用,提示miR一29a在癌 症的预后判断和治疗中潜在的作用.笔者在前期工 作中亦发现,miR一29a在患者血清中的表达水平 可作为胃癌早期诊断及预后判断的miRNA指标.腺 病毒载体系统作为哺乳动物细胞表达载体,在重组疫 苗和基因治疗载体研究中备受关注,被广泛应用于基 因治疗的研究中.笔者成功包装负载miR一29a前体 (pre-miR.29a)cDNA的腺病毒表达载体并验证了 其效果,为进一步研究miRNA在肿瘤发生发展中的 作用,以及hTERT调控相关miR一29a在肿瘤治疗中 的价值奠定了基础. 1材料与方法 1.1材料大肠杆菌DH5一,腺病毒穿梭质粒 pDC315及包装质粒pBHGloxDehaE1,3Cre,本室保 存;转化有腺病毒El区基因的包装细胞HEK293, 本室保存;负载有p一半乳糖苷酶(B-ga1)基因 LacZ的复制缺陷型腺病毒(Ad—LacZ),本室保存; 1kbplusLadderMarker,DL2000Marker(TAKARA公 ? l046?西南国防医药2011年10月第2l卷第lO期 司);质粒DNA小量快速抽提试剂盒(Omega公司); DOTAP脂质体转染试剂(Roche公司);PCR试剂盒 (上二海欣百诺公司);酵母提取物及胰蛋白胨(上海 生);低溶点琼脂糖(西班牙进口);氨苄青霉素 (华北制药厂);EcoRI与BamHI内切酶 (TAKARA公司);高糖DMEM1X培养液及标准胎 牛血清(HyClone公司);premiR一29a的RT及 Rea1.timePCR引物套装(广州锐博公司);腺病毒 鉴定用PCR引物(上海生工合成). 1.2方法 1.2.1pDC315一miR29a质粒构建于NCBI网站 奁到pre—miR一29a序列(64bp),向上下游各延伸 100bp,并在5'端设计EcoRI酶切位点,在3'端设 计BamHI酶切位点,委托上海生工分别合成正,反 向单链DNA;腺病毒载体质粒pDC315经EcoRI和 BamHI双酶切后,试剂盒回收,CIP去磷酸化;将合 成的正,反向pre—miR一29a片段退火互补结合,用 T4DNA连接酶与pDC315片段连接,产物转化大肠 杆菌DH5.d,青霉素筛选阳性克隆,重组质粒常规 酶切电泳鉴定及测序鉴定. 1.2.2Ad.miR29a重组腺病毒的包装及鉴定参 照DOTAP使用说明书,将腺病毒重组载体质粒 pDC315.miR29a和腺病毒包装质粒 pBHGloxDeltaEl,3Cre共转染HEK293细胞;通过同 源重组包装腺病毒.7,10d后可出现空斑,挑选 l0个空斑溶液,冻融离心后,上清液再次感染 HEK293,扩增腺病毒.吸取病毒上清200l于EP 管内,沸水煮10min后取5l进行PCR鉴定,用 Ad—LacZ作阴性对照.正向引物:5一 CCCAACGGTCACCAATAC一3反向引物:5一 AACCCTCACGACC1rI?TG.3退火温度55,扩增 片段长度为159bp,来源于pre-miR?29a序列.反 应条件为94?90S,之后9430S,55oC30S,72 ?60s,反应3O个循环,最后72?延伸5min,4? 保存.电泳后出现miR-29a基因特异性扩增条带 为阳性判断标准.PCR鉴定正确的腺病毒,感染 HEK293细胞.培养3,5d后观察细胞病变效应 (cytopathiceffect,CPE),即90%,100%的细胞肿 胀,变圆,10%,20%的细胞脱壁漂浮.用PBS代替 腺病毒作阴性对照. 1.2.3Ad.miR29a的纯化及滴度测定经鉴定正 确的Ad—miR29a感染HEK293细胞,出现CPE后 冻融细胞,收集重组腺病毒.加病毒液于无菌梯度 氯化铯(CsC1)溶液上层(0.5ml,比重1.5ml;3.0 ml,1.35g/ml;3.0ml,1.25g/m1),10?,150000g 离心1h后,在1.25g/ml和1.35g/mlCsC1溶液问 町见灰白色病毒带;将病毒带吸出,4?避光透析纯 化,纯化的病毒液采用倍比稀释法测定病毒滴度. 取100%出现CPE的最大稀释度,按下列公式计算 病毒滴度.设定公式中每个细胞感染10个病毒, 36,48h内导致细胞完全病变. pfu/m1:塑掣煎一U.Zml 1.2.4RT-PCR检测miR一29a表达丰度按 TRIzol试剂操作手册,提取细胞miRNA,使用 BeckmanDU800型紫外分光光度计测定RNA提取 液的A印吸光度值,计算浓度.按照RT逆转录试剂 盒说明书操作,反应条件为42?15min,85oC5S; 然后按照RT—PCR试剂盒说明书配25l反应体 系,预变性95?30S,PCR反应40个循环,条件为 95?5S,60?30S.采用2.?'法进行结果分析, 比较各组RQ值(RQ=2.九).以u6管家基凶做 为内参.?Ct=目的基因ct值一内参基因ct值, ??Ct=待测标本的Ct一空白组平均?ct. 1.3统计学方法采用SPSS12.0统计软件分析, 数据用?表示,组问的比较采用方差分析,检验 水准Ot:0.05(双侧). 2结果 2.1pDC315一miR29a腺病毒载体质粒的构建腺 病毒载体pDC315质粒经EcoRI和BamHI双酶 切后,形成3.91kb一条带;将pre—miR一29a片段 插入pDC315多克隆位点,用0RI和BamHI双 酶切鉴定,显示有3.91kb和0.27kb两条带,与理 论计算相符(图1).基因测序结果表明,全长pre— miR一29a序列正确插入到pDC315质粒多克隆位 点.提示成功构建负载人pre.miR一29acDNA的 腺病毒表达载体. l0000 8000 5OOO 2OOO 1600 l000 700 500 400 300 200 lOO 图1pDC315和pDC315一miR29a经EcoRI和BamHI双 酶切鉴定 M:1kbplusLadderMarker;1:pDC315一miR29a;2:pDC315 2.2病毒的鉴定及滴度测定腺病毒液煮沸后,产 西南国防医药2011年10月第21卷第l0期-1047? 物用pre.miR.29a特异引物进行PCR反应,结果发 现重组腺病毒可扩增出159bp的条带,而Ad-LacZ 则不能(图2),表明重组腺病毒成功构建.将重组腺 病毒扩增,梯度CsC1低温超速离心纯化浓缩后,得到 病毒液5rIll.采用倍比稀释法测定Ad—miR29a的滴 度可达5×10pfu/ml.重组腺病毒感染HEK293细 胞后2,3d即出现CPE效应(图3),而用PBS作对 照的HEK293细胞则生长良好(图4).表明经纯化 浓缩的腺病毒,具有较高的感染活性. 图2重组腺病毒Ad—miR29aPCR检测 M:DL2000Marker;1:Ad—miR29a;2:Ad-LacZ 图3感染病毒后出现CPE的HEK293细胞(×200) 图4未感染病毒的HEK293细胞(×200) 2.3miR一29a转染人胃癌SGC-7901细胞后miR一 29a表达丰度的改变与转染Ad—LacZ的阴性对 照组(7901-Ad-LacZ)相比,转染Ad.miR29a的 实验组(7901一Ad.miR29a)细胞内miR一29a表达 丰度明显上调(2.254-0.30VS0.95-4-0.17,P< 0.05);而阴性对照组与未转染腺病毒的空白组 (SGC一7901)无显着差异(0.95?0.17VS1.004- 0.04,P>0.05).表明重组腺病毒Ad-miR29a能 有效提高感染细胞内miR.29a表达丰度. 表1miR一29a在人胃癌SGC一7901细胞中 定量表达检测结果 细胞分组miR一29a表达相对定量(2一) SGC一7901 7901.Ad—LacZ 7901.Ad—mi1t29a 1.oo?0.04 O.95-t-O.17 2.25?0.30~ 注:与7901一Ad.LacZ比较,?P<0.05 3讨论 miRNA几乎参与了肿瘤发生和发展的每一步 过程,在肿瘤的诊断,预后及治疗方面均有很好的应 用前景一93.miR一29a是新近发现与肿瘤密切相关 的miRNA,高表达于正常组织,而低表达于神经纤 维瘤,肉瘤,脑肿瘤等多种实体瘤川.Park等??研 究发现,miR一29可激活p53基因的表达,从而有可 能通过p53基因而发挥抑癌miRNA的作用.以上 研究提示miR一29a是一个有效的抑癌miRNA,其机 制及在肿瘤诊断与治疗中的应用价值有待进一步深 入研究.而能够有效地调控miRNA表达丰度,是 miRNA功能及机制研究的基础.但目前常用的 miRNA调控方式不如人意. 腺病毒载体具有高效传递和表达基因的能力 (尤其是在体外),在过去的15年里已经得到充分证 实.腺病毒载体由于宿主范围广泛和对人体的低致 病性,病毒颗粒比较稳定,基因组较少发生重排等优 点,已经成为最常用的病毒载体之一?引.腺病毒载 体优点主要有?引:(1)宿主范围广,对人致病性低; (2)腺病毒较稳定,病毒基因组重排频率低,外源基 因片段插入片段在病毒复制几个周期后仍可保持不 变,易于用重组DNA技术操作;(3)安全性好,腺病 毒几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中; (4)能同时表达多个基因.因此,采用腺病毒载体 系统调控miRNA在细胞内表达是安全,有效的?引. 我们采用分子生物学技术,成功包装负载pre.miR. 29a的重组腺病毒,感染性实验证明了重组腺病毒 具有良好的感染活力.RT—PCR结果证实,包装的 重组腺病毒Ad—miR29a可有效,稳定地提高感染细 胞内miR-29a的表达丰度.这一结果为研究miR 29a在肿瘤发生及发展过程中的作用,以及基于 miR-29a的肿瘤早期诊断及治疗奠定了基础. ? 1O48?西南国防医药2011年10月第2l卷第10期 【参考文献】 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] LiuN,OkamuraK,TylerDM,eta1.Theevolutionandfunctional diversificationofanimalmicmRNAgenes[J].CellRes,2008,18 (10):985—996. 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(收稿『]期:2011—03—30) 个案? 胸椎髓内脂肪瘤1例 高晓翔,陈雪,张成程 [关键词]胸椎;椎管内脂肪瘤 中图分类号R738.6文献标识码B 文章编号1004—0188(2011)10—1048—01 doi:10.3969/j.issn.1004—0188.2011.10.059 病例患者,男,40岁.双下肢疼痛,麻木伴活动受限5 个月余,我院以"T^一平面椎管内肿物性质待查"收入院.专 科阳性体征:脐上2横指水平以下深,浅感觉减退,双下肢肌 力?级,肌张力增高;双侧膝腱,跟腱反射亢进,双侧 Babinski征(+),余病理征未引出.MRI检查:一,硬膜外 梭形异常信号,短T,/长TWI高信号,脂肪抑制实验阳性; 压脂增强扫描病灶呈低信号且不强化,肿瘤边界较清楚,大 小约4.2cm×1.1cm×1.0cm,未侵犯椎体与周围组织,考 虑脂肪瘤伴胸髓受压,变性.CT上病灶呈低密度.行T一 面椎管内肿瘤切除+椎管减压术,术中见肿瘤位于脊髓 内,呈灰黄色,质地软,边界尚清楚,与脊髓粘连,血供少,大 部分切除后送病检.术后病理结果:(一椎管内)脂肪瘤. 术后患者双下肢疼痛,麻木症状消失,病理征消失,肌力逐渐 作者单位:661600云南开远,解放军59医院骨科(高晓翔),榆 验病理科(陈) 恢复. 讨论椎管内脂肪瘤较少见,女性多见,男:女约1:1.6, 病因尚不明确.有研究报道是错构瘤的一种…,肿瘤最多见 于胸段,其次为颈,腰段.腰骶段脂肪瘤常合并脊柱裂,脊髓 膨出等脊柱脊髓先天畸形,肿瘤可位于硬脊膜内外或脊髓内 外,多累及1,3个椎体,国内报道发生于脊髓内的脂肪瘤 最多可累及6个椎体.肿瘤生长缓慢,大多数患者均肿 瘤增大压迫脊髓,出现神经症状时就诊.诊断:影像学诊 断主要以MRI为主,脂肪抑制实验阳性更有诊断价值,但最 终诊断仍需病理学支持.手术切除是目前最好方法,硬膜外 脂肪瘤手术应力争全切,避免复发.对软脊膜下和软脊膜内 的脂肪瘤,在避免脊髓损伤的情况下,应尽可能多地切除,以 达到减压和缓解临床症状的效果. 【参考文献】 [1] [2] [3] lnajiH,KomoikeY,MotomuraK,eta1.Breast'conservingtl~atment afterneoadjuvantchemotherapyinlargebreastcancer[J].Breast Cancer,2OO2,9(1):20—23. 徐荣,徐庆武,车晓明,等.16例椎管内脂肪瘤的诊断及治疗 [J].中国神经精神疾病杂志,2003,1(29):38. 鲁成,王恒,仲文军,等.颈椎椎管内巨大脂肪瘤1例搬竹 [J].实用骨科杂志,2002,2(15):158. (收稿日期:2011—04—19) ??