莲房原花青素对人口腔表皮样癌（KB）细胞生长及形态的影响

莲房原花青素对人口腔表皮样癌（KB）细胞生长及形态的影响 莲房原花青素对人口腔表皮样癌(KB)细 胞生长及形态的影响 ? 384?现代121腔医学杂志2005年第19卷第4期JModemStomatol,July2005,Vol19,No.4 莲房原花青素对人口腔表皮样癌(KB) 细胞生长及形态的影响 杜晓芬谢笔钧张玲珍仲人前 【摘要】目的观察体外应用莲房原花青素(LsPc)对人口腔表皮样癌(KB)细胞生长的抑制作用及形态学上 的影响.方法采用体外细胞培养技术,噻唑蓝显色(M1vr)法观察LSPC对KB细胞生长的抑制作用;倒置显微 镜,HE染色法,透射电镜研究用药前后细胞形态的变化.结果LSPC对KB细胞有很好的抑制作用,在一定浓度 范围内呈剂量效应关系且只有较小的细胞毒性,细胞形态发生明显的变化.结论LSPC可抑制KB细胞生长且 使KB细胞形态发生明显的变化. 【关键词】莲房原花青素(LSPC)口腔表皮样癌(KB)细胞小鼠成纤维细胞(L929)MTT法 EffectsofproanthocyanidinsfromseedpodofthelotusOilKBcellgrowthandmorphorlogyD UXiaofen,XIEBOun, ZI-L~xlGLinzken,eta1.CollegeofFoodScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalU niversity,Wuhan430o70 【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectsofproanthocyanidinsfroms~podofthelotusonthegrowthand morphorlogyofhumannasopharyngealepidermoidcarcinomacell(KBcel1).MethodsM1v rassaywasusedtostudythe effectsofLsPConKBcellB.SwellastheircytotoxicitytoL929cellandupside—downmicroscopy,HEstaining, transmissionelectronmicroscopywereusedtostudytheeffectsofU?onthemorphologyofKBcel1.ResultsLSPCcan inhibittheproliferationofKBcellsignificantlyanditseffectsweredose—dependentandtime—dependenttosomedegree. Furthermore,LSPChadlesscytotoxicitythanMTX.ThemorphologyofKBcellwaschanged deeplyafterLSPCWas used.ConclusionLSPCcouldinhibitheproliferationandcharthemorphologyofKBcel1. 【Keywords】Proanthocyanidinsfroms~podofthelotus(LSPC)KBcellL929cellMTTassay 中图分类号:R739.8文献标识码:A 原花青素(Proanthocyanidins)属于缩合单宁 (Conden~dtannin),广泛地分布于植物界,许多食 品(各种水果,豆类,巧克力等)和饮料(水果汁,葡萄 酒,啤酒,茶等)中都含量丰富_1J.作为药用植物莲 科(NelumbomuciferaGaertn)的成熟花托(又名莲 房,Seedp~loftheLotus,简称LS),民间常常将其制 成莲房炭,作为止血药用.最近本研究室发现在莲 房中原花青素含量丰富,其结构,组成与葡萄籽原花 青素极为相似,可成为提取原花青素的另一重要资 源[2l. 恶性肿瘤是危害人类生命和健康的一种严重疾 病_3'4J.据报道原花青素在体外实验中,对乳腺癌 细胞MCF一7,肺癌细胞CRL一1739有不同程度的 抑制作用_5J,对人VI腔鳞癌细胞HSC一2及涎腺癌 细胞HSG也有不同程度的毒性_6J.本研究探讨莲 房原花青素在体外对人口腔表皮样癌(KB)细胞生 长及形态影响. 国家自然科学基金资助(编号:30270938) 作者单位:430070武汉,华中农业大学食品科技学院(杜晓芬, 谢笔钧);上海第二军医大学附属长征医院(张玲珍,仲人前) 材料和方法 人口腔表皮样癌KB细胞(中国科学院细胞 库),小鼠成纤维细胞L929(中国科学院细胞库);莲 房原花青素LSPC(本实验室制备,含量>98%),甲 氨蝶吟MTX(上海信谊药业有限);噻唑蓝MTT(上 海普飞生物技术有限公司).二氧化碳培养箱 (Galaxy,StephenClarkFabricationsLad,英国),酶 标仪(Glinibio128C),倒置显微镜(olympusck40日 本),JEM一1200透射电镜(美国). MTT法j:将KB细胞和L929以1×10s/ml 的密度接种于96孔板,每孔200tLL,待细胞长至 80%融合,换以培养基配制的浓度分别为50,100, 200,300,400,500,600,lO00Mg/mL的LSPC和浓度 分别为0.1,1,10,lOOMg/mL的MTX,每个浓度6个 平行,分别培养12,24小时后,每孔加入5mg/mL M不溶液20t~L,37?继续孵育4小时,小心吸弃孔 内培养基上清液,每孔加入150t~LDMSO,振荡 10min,使结晶物充分溶解,酶标仪上490nm波长处 测定各孔OD值. 现代口腔医学杂志2005年第19卷第4期 JModemStomato/,July2005,Vol19,No.4'385. 倒置显微镜观察细胞形态:待细胞在培养瓶中 长至80%融合度,设置空白组和三个LSPC剂量分 别为:200ttg/mL,300t~g/mL,400~g/mL用药组,6 小时后用倒置显微镜连续观察细胞形态的变化. HE染色[8】:在加盖玻片的培养皿中培养KB细 胞,待细胞长至80%融合度,设置空白组和三个含 LSPC组:200#g/mL,300ttg/mL,400ttg/mL,培养 24小时后,细胞按参考文献J进行染色. 4.透射电镜:待细胞在玻璃培养瓶中长至80% 融合度,细胞设置空白组和含300~g/mLLSPC浓度 组,培养24小时后,送至上海医科大学电子显微镜 室完成. 统计学处理:采用SAS统计学软件,对每个浓 度的6个标本进行单因素方差分析. 结果 LSPC对KB细胞增殖的影响:结果见表1,当 作用时间为12小时,MTX浓度在0.1,100~g/mL, LSPC浓度在300,1000t~g/mL1时,都显着的抑制 KB细胞的生长,而LSPC浓度在50,200~g/mL 时,对KB细胞的生长抑制作用不明显;当作用时间 延长至24小时,LSPC浓度在100,200~g/mL时显 着抑制KB细胞的生长,但LSPC浓度在50ttg/mL 时显着的促进KB细胞的生长.不同作用时间组之 间光密度值有明显的差异.MTX对KB细胞生长 的抑制作用显示出一个明显的浓度依赖效应和时间 依赖效应,而LSPC对KB细胞生长的抑制作用有 剂量范围. 表1不用浓度的LSPC和MTX对 KB细胞增殖的影响OD.?S 组别剂量(ttg/mL不同的作用时间 l2h24h 注:P<0.05,差异有显着性;**P<0.Ol,差异有极显着性 m法测定L929细胞毒性:结果见表2, MTX浓度中0.1,100ttg/mL时,均显着的抑制了 L929细胞的生长,且呈浓度依赖效应.LSPC浓度 在高剂量400,1000~g/mL时,显着的抑制了L929 细胞的生长,在低浓度100,300t~g/mL不影响其生 长,而在最低剂量50ttg/mL时又显着的抑制了L929 细胞的生长,提示LSPC对正常细胞的保护作用有 一 个最佳的剂量范围.故综合2.1和2.2的结果,选 出LSPC作用浓度为200,300,400~g/mL,作用时间 为24小时作后续研究. 表2不用浓度的pc和MTX对 L929细胞毒性OD.?S 注:.P<0.05,差异有显着性;**P<0.01,差异有极显着性 倒置显微镜观察细胞形态:KB细胞约需4小 时就开始贴壁,贴壁后细胞呈多角形开始爬壁生长, 仁多,折光性强,轮廓不清;待细胞铺满瓶底时,呈铺 路石状;细胞继续培养时,可复层生长,细胞呈圆形. 细胞长至80%融合度加LSPC后,6小时没明显变 化;12小时时,部分细胞开始变圆,细胞皱缩,折光 性强,少量漂浮,可见分裂相减少.24小时后,加 LSPC400yg/mL组,细胞分裂相更少,大量细胞漂 浮,贴壁不牢固. HE染色观察:见图1:A.正常培养KB细胞HE 染色:细胞形态呈圆形,三角形,核浆比例大;B.含 200~g/mLLSPC培养24小时后.细胞跟正常培养 基本一致,个别出现碎核;C.含300,ug/mLLSPC培 养24小时后,细胞呈圆形,缩小,核边集;D.含 400t~g/mLLSPC培养24小时后细胞严重皱缩,细 胞核向膜边突出. 透射电镜观察见图2:正常培养KB细胞可见典 型上皮细胞结构,如桥粒,微绒毛,张力丝.用 300t~g/mLLSPC培养24小时后,可见细胞严重萎 缩,桥粒结构消失,胞内出现大量的空泡,染色质边 集,断裂,呈凋亡状. 珊f?L1学杂忐20o5毕第1q龆旃4}jJM川-:qh?l?ill一.J_ljy21~)5.v?J19,,4 H,l1?常情非KJ目}:抛.K30'i:'111II莘24.I,lI 讨论 适1乜镜懈 士l哥括:山坼越脚:,姑地E;I)怅.1l:K为絷也仆f~q-:111|色{煎麒靠拢 MTX是一种治疗恶性舯犍的常『{j药物,在化疗 中起着举足轻重的作用.大刹的MI'X的毒剐怍 用主要为各种黏膜炎,包括口崆毙.口腔溃疡,台管 炎,月1:周炎等.已雨'报道葡萄籽原纯青素对乳腺 癌细胞MCF一7,帅癌A427,嵘癌(RL—l739 有不同程度的抑制作刷I几albinoLf服原佗 青素的l』在50()rag/kgP.~l.无任何剐作用且耐曼 良好".而原花青素刘I1腔表皮样癣KB翔『胞的 作用未见报道 采用Mrr法测定莲房原花育紊LSP('列K[{ 细胞增殖的影n向,原理是活细胞『兑氧酶能将还愿 为不溶于水的黄色产物,JJu溶刑溶解后呈蕊色,蕊色 产物的量与活细胞数呈l比,只I酶标仪删OI)值 ()f)值可以反映活细胞数鞋.实验果表明MTx 与KB细胞共同作用24小时在O】,f【j0g/mI鄙 着的抑制K1细胞的生K,f=l=l对L929有着的毒 性作用;l'与KI细胞jt同作朋l:小时在?0 , lOtm/ml显着的抑制Kn胞的牛长,而小r 30()-g/m1.II,j作用:明显,,作Itj时ffi】诞J_乇至24小 时时,LSPC浓度在lo0,2001~R,/n11,时I且显苫的抑制 ?j细胞的长长,但50f~g/m11l寸若的促进K?细 胞的生【乇.i在10o一一3【l()J_Jg/n-I.刈I929没什幺毒 性放综台两者,选f】{最佳浓腰怍后续研究 桥结构可能是细胞fHj通i连接的,-种方j=l==, LS使KI{细胞挢粒结构消失,可能他别胞失去增 殖的信号,从丽抑制了细胞的增蟾胞1qU{现大量的 i泡,宅泡tpN1i~.食备种酶娄,起溶解细胞的作用; 染色质边集,断裂星细胞凋r的典型特征以上三 者的结粜都表}Ijj.IH挪制了细胞的生长,改 变丁KB缅施形态.. 参考文献 lkII?I曲t,11APr~nt]~nwanidinsandTarminIike 【,…l—iiil1]~…FhI1iiifllNli~riti,.mlxdl,.Agrk..2f~)0,80:l094 lIl 2琏计.嘲笔饬.蛳K.等莲肼吼fE青豢耐家兔lj?腑驶耵茸l纽 憎奋竹啊,k爨广J:埘究.jF,20f)I.l3l4j:舡64 3}:lfkt'hmH.Ricl6e1Jr.ai嘶aComm[uf L?nr『I~xl,tllllMl,I997.2【3:2I1224 4采,川.艇玮.州..?订袈前话呼化疗浩疗几腔坷枘晡 理疗牧仆析1?学院学搬2111~).28(4):6f)_62 5Ye.KIilI..1iunlW.Lfall'heLv【lItoxicefkx.f呻wl IHf3fiRrar~刊l_n帅tl1l州an1?ttTunctlkur~J.h?虹 …,cell~MLlie!'~lar1Il(lluIrI}?.19.I96:99一 JfJS, bH:'1'lk;1.EriK,3bBAY,,XSI1【lY.{kI8.etalJl1(mds r1I『rya川…lIir【,o3xit'ity{.ltHurrah 【,h-alrIlrIt'?1tFil?~L"n!PIInI1'Lm201~1.45(5;? ?r徒1硝强.1.l1..主编?}:胞j柞研,:lil:I~'li版公 .Iql,~9.1 d#扶褥.主{阜斗培眷岫姆J托J,泉:科学技术出版}t. 201)1.2 v潘钟,求殳嚣t刊蛙0}1蚊?薄"川旧衙门lm牺,僻出 .201}].1I,73(IN ?InIJ.I-1Sighltjf1HlFr,x~dicalmid《mrsm.d nI:『lyarfilJintx『r~luI:imI~rlar,Lt『1hLlt?nhealIhmddi 1v?rm(mlx?L?.跏1I48.I87j07 l本文鳊辑王植三)c收确l1聊2110402】跚 (修ill1聊2IM){一0510)