[说明]小鼠组蛋白去乙酰化酶试剂盒说明书

[说明]小鼠组蛋白去乙酰化酶试剂盒 小鼠组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) ELISA 检测试剂盒 本试剂仅供研究使用 标本,血清或血浆 试验原理: HDAC试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知HDAC浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将HDAC和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中HDAC的浓度呈比例关系。 试剂盒及其配制 试剂盒成份(2-8?保存) 96孔配置 48孔配置 配制 96/48人份酶标板 1块板(96T) 半块板(48T) 即用型 塑料膜板盖 1块 半块 即用型 标准品:400pmol/L 1瓶(0.6ml) 1瓶(0.3ml) 按说明书进行稀稀 空白对照 1瓶(1.0ml) 1瓶(0.5ml) 即用型 标准品稀释缓冲液 1瓶(5ml) 1瓶(2.5ml) 即用型 生物素标记的抗HDAC抗体 1瓶(6ml) 1瓶(3.0ml) 即用型 亲和链酶素-HRP 1瓶(10ml) 1瓶(5.0ml) 即用型 洗涤缓冲液 1瓶(20ml) 1瓶(10ml) 按说明书进行稀释 底物A 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型 底物B 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型 终止液 1瓶(6.0ml) 1瓶(3.0ml) 即用型 标本稀释液 1瓶(12ml) 1瓶(6.0ml) 即用型 自备 1( 蒸馏水。 2( 加样器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。 3( 振荡器及磁力搅拌器等。 安全性 1( 避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。 2( 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。 3( 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。 操作注意事项 1( 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。 2( 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。 3( 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。 4( 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部 分的加样器。 5( 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。 6( 洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。 7( 底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避 免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。 8( 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。 9( 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。 样品收集、处理及保存方法 1、 血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液 后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 2、 血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。 3、 细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。 4、 组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液 5、 保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ?保存，避免反复冷冻。尽 可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要 在37?或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。 试剂的准备 1( 标准品:标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。 稀释比例按下表中进行: 400 pmol/L (6号标准品) 原倍浓度不用稀释直接加入50ul。 200 pmol/L (5号标准品) 100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液 100 pmol/L (4号标准品) 100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液 50 pmol/L (3号标准品) 100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液 25 pmol/L (2号标准品) 100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液 12.5 pmol/L (1号标准品) 100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液 0 pmol/L (空白对照) 原始浓度不用稀释直接加入50ul。 2( 洗涤缓冲液(50×)的稀释:蒸馏水50倍稀释。 操作步骤 1( 使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的 气泡，产生加样上的误差。 2( 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做 复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液 1:1稀释后加入50ul于反应孔内。 3( 加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入 50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37?温育1小时。 4( 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此 操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 5( 每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37?温育30分钟。 6( 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此 操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。 7( 每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37?温育10分钟。避免光照。 8( 取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。 9( 在450nm波长处测定各孔的OD值。 建议使用的实验 标准品浓度 (pmol/L) A 400 400 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 B 200 200 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 C 100 100 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 D 50 50 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 E 25 25 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 F 12.5 12.5 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 G 0 0 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 H 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 局限 6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。 试剂盒性能 1. 灵敏度:最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相 关系数R值为0.990。 2. 特异性:不与其它细胞因子反应。 3. 重复性:板内、板间变异系数均小于10%。 结果 判 断 与 分 析 1、仪器值:于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值 2、以吸光度OD值为纵坐标(Y)，相应的HDAC标准品浓度为横坐标(X)，做得相应的曲线，样品的HDAC含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。 3、检测值范围:0-400pmol/L 4、敏感度: 1.0 pmol/L , 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 药品名称: 通用名:大鼠组蛋白去乙酰化酶(HDAC)酶联免疫试剂盒 使用目的: 本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中组蛋白去乙酰化酶(HDAC)含 量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠组蛋白去乙酰化酶(HDAC)水平。用纯化 的大鼠组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中 依次加入组蛋白去乙酰化酶(HDAC)，再与HRP标记的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抗体 结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的组蛋白 去乙酰化酶(HDAC)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，通过标准曲线计算样品中大鼠组蛋白去乙酰化酶(HDAC)浓度。 试剂盒组成 1 20 倍浓缩洗涤液 30ml×1 瓶 7 终止液 6ml×1 瓶 2 酶标试剂 6ml×1 瓶 8 标准品(180nmol/L) 0.5ml×1 瓶 3 酶标包被板 12 孔×8 条 9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶 4 样品稀释液 6ml×1 瓶 10 说明书 1 份 5 显色剂A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 张 6 显色剂B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 个 标本要求 1(标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能 马上进行试验，可将标本放于-20?保存，但应避免反复冻融 2(不能检测含NaN3的样品，因 NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在第一、第二孔中分别加标 准品 100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀;然后从第一孔、第二 孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl， 混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第 六孔 中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀;混匀后从第五、第六孔中各 取 50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl，混 匀后从第七、第八孔中分别取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准 品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为120nmol/L，80nmol/L ，40nmol/L，20nmol/L， 10nmol/L)。 2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样 品最终稀释度为 5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育:用封板膜封板后置37?温育30 分钟。 4. 配液:将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用 5. 洗涤:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此 重复 5次，拍干。 6. 加酶:每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7. 温育:操作同 3。 8. 洗涤:操作同 5。 9. 显色:每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B50μl，轻轻震荡混匀，37?避光显色 15 分钟. 10. 终止:每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。 11. 测定:以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止 液后 15分钟以内进行。 计算 以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数， 即为样品的实际浓度。 注意事项 1(试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2(浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3(各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好 控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4(请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值 大于标准品孔第一孔的OD值)，请先用样品稀释液稀释一定倍数(n 倍)后再测定，计 算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。 5(封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6(底物请避光保存。 7(严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8(所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9(本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。 检测范围: 5nmol/L -150nmol/L 规格: 96 人份/盒 保存条件及有效期 1(试剂盒保存:;2-8?。 2(有效期:6个月