确定抗体最佳滴度的简便方法

确定抗体最佳滴度的简便方法 i(}(7一. 痈痕. 临床与宴验病理学杂志JClinExpPathol1998Apt;14(2) 确定抗体最佳滴度的简便方法 曹世俭季敬军凸'...?_-._一??- ._?一 随着技术的进步,免疫组化方法日趋简单,一般 只需对一抗适当稀释,便可获得理想的染色结果.确 定抗体的最佳滴度通常采用实验的方法,近年 来我们运用着名数学家华罗庚教授早年致力于推广 举例介绍如 的优选法中的0.618法取得满意效果, 下. 1材料和方法 1.1抗体效价1:100,1:1000. 1.2免疫组化方法SP法,二抗及辣根酶标记的 链霉卵蛋白均为1:300,37?,30min. 1.3滴定方法 1.3.1根据给定的参考效价作一线段,示滴定范 围1:100~.1:1000. 1.3.2利用公式:(较大的数一较小的数)×0.618 +较小的数,求出这一线段的0.618(w),该数值即 为第1次实验浓度.(1?O一100)×0.618+100= 656 0 lO0656l000 1.3.3利用上述公式再求出其中较大线段(0,w) 的0.618,即原线段(0,1)O.618的0.618,即W一1 一 w.因为(O,w)这一线段较大的数是656,所以第 2次实验浓度:(656—100)×0.618+100=444. 01一WW1 l00444656l000 1.3.4分别用上述2种浓度各染l张切片(为便于 操作可取近似值)然后比较2张切片的染色效果1 :656优于l:444,即淘汰<l;444的实验点,于 是滴定范围便缩小在l444,1:l000之间.反 之,若1t444优于l:656,则淘汰>1:656的实验 点,实验范围缩小在l:100~1:656之间. 1.3.5确定第3次实验浓度:即求出444l000这 一 线段的0.618,此线段较大的数仍是1000,较小 的数是444,所以:(1000—444)×0.618+444= 788. 作者单位:北京天坛医院病理科100050 0北京市神经外科研究所神经病理室100050 作者简开,曹世俭,男,46岁,主管技师 . 01——WW1 444656788l000 按此浓度染第3张切片后与1656比较,1: 788好于1:656,淘汰<656的实验点,滴定范围进 一 步缩小在656,1000之间. 1.3.6计算第4张切片染色浓度,染色后与lt 788比较.(1000—656)×0.618+656=869. 01——WW1 656788869l000 l:788好于1:869,淘汰>869的实验点,最 佳浓度确定在1:656,1869之间. 1.3.7再计算出第5次实验浓度,此步同1.3.3, 求1656,l:788线段的0.618.(788—656)× 0.618+656—738. 01一WW1 656738788869 再次比较,1:738优于1t788,至此便可确定 该抗体最佳稀释浓度为1:738. 2结果 经过以上4次实验,比较,再实验,再比较,逐渐 缩小实验范围,一步步接近最佳,最终确定最佳 浓度为1;738. 3讨论 优选法是对生产和科学实验中提出的问,根据数学原理,通过尽可能少的实验次数,迅速求得最 佳方案的方法.0.618法即平面几何中的黄金分 割法是其中最简单最常用的方法之一,尤其适用于 解决抗体稀释这类单因素问题.其基本原理是: 0.618(W)把一条线段分成两部分,使其中一部分与 全长的比等于另一部分与这一部分的比.此外,这个 数有一特性,即1--W=W,W与1一w把区间(O, 1)分为如下形式: 01一WWl 无论去掉那一段[O,(1一w)]或(w,1)所余下 的一点其位置与原来两点之一(1一W或w)在(O, 1)中所处的位置是一样的. 厂 铭 坦 , 腹 ~'/3--Z0 ?200?临床与实骚病理学杂志JClinExpPathat1998Apr;l4(2) 免疫金一银染色和S—P染色结果 免疫金一银染色(IGSS)和链菌素亲生物蛋白一过 氧化酶连结法(s—P)系近年来发展起来的两种新的 免疫组化方法,两者均可用于石蜡切片,冰冻切片和 细胞涂片等,文献报道其敏感性优于PAP和ABC 等其它免疫组化方法".我们应用多种单克隆抗 体和多克隆抗体.比较IGSS和S-P法的敏感性.并 对IGSS染色中应注意的几个问题加以讨论. 1材料和方法 1.1组织标本手术切除的组织标本包括胰岛细 胞瘤,扁桃体组织,子宫平滑肌瘤,正常胎盘组织,正 常胃窦部粘膜和神经鞘瘤各1例.所有组织均为福 尔马林固定,石蜡包埋,连续切片厚4m. 1.2免疫试剂所甩的试剂包括单克隆抗体胰岛 素(insulin)(美国Biogenex公司产品).结蛋白 (desmin)(美国Sambio公司产品),B-cell(L26);多 克隆抗体胎盘碱性磷酸酶(PLAP),嗜铬素A(chro— mogrininA)和S-100蛋白(均为丹麦Dako公司产 品).所甩的免疫金染色药盒和S-P药盒均为美国 Zymed公司产品. 1.3染色方法IGSS步骤根据Zymed公司的说 明书进行,S—P染色步骤根据Shi.介绍的步骤进 行,详见表1.每一种一抗先以S-P法选出最佳稀释 浓度后,再同时进行系列稀释分别用于IGSS和S—P 染色中,按其着色有无及强弱程度划分为:阴性 作者单位.福建三明市三明钢铁厂医院365000 作者简介李莲花,女.36岁,技师 1—6f R'' (一);弱阳性(+),阳性细胞数<5}阳性(抖),阳 性细胞数为5,5O;强阳性(卅),阳性细胞数> 5O. 寰1IGs$和s-P集色步翼比较 2结果 6种不同类型的第一抗体分别应用于6种不同 的组织,IGSS和S-P染色结果见表2.从中可以发 现用于IGSS中的第一抗体(不管是单克隆或多克 隆),其最佳稀释浓度均为用于S—P染色中的4倍. 例如Insulin在S-P染色中为1t500而在IGss中 为1t2000,其它抗体的结果相同.在同样的稀释浓 度中.IGSS的染色强度明显强于S—P染色.即使阳 性细胞很少的组织切片,IGSS仍然可获得很好的染 色结果. 3讨论 IGSS首先由Holgate"于1983年提出,该方法 具有敏感性高,操作简便,显色对比度强,无毒性等 同—抗体用传统方法需经3次至少1o种不同 浓度的染色,且每次都要染数张切片,方可得出最佳 浓度在1:725~1:750之间.而0.618法的最大优 点在于每次只需染1,2张切片,既简化了操作又节 省了抗体,易于比较且精确度高,同时也减少了因一 次染多张切片而容易产生的人为因素的干扰. 滴定时不必局限于原给定的参考效价,适当扩 大实验范围可纠正原给范围不当的错误,找出更适 合本实验室的浓度,即使是即用型工作液仍有再稀 释的可能 优选法内容十分丰富,学习掌握这一方法有助 于解决实验室工作中遇到的各种单因素,双因素,多 因素及特殊性问题,甩优选法指导实验,可取得事半 功倍的效果. 关键词抗体滴度{优选法{免疫组织化学 中国图书分娄号R392?31 参考文献 1社科院语言所词典编辑室.现代汉语词典(管订末).北京,商务 出版社,1996I1519 —28收稿) (1997—05