N注入诱变选育井冈霉素A高产菌的研究

N注入诱变选育井冈霉素A高产菌的研究 . . 工业微生物 第卷第期 坐: 竺笙竺旦 旦堕堡生塑竺墅 :./..?... 注入诱变选育井冈霉素高产菌的研究 丁 王 王 郑之明, 贡国鸿, 汪维云 艳’。, 丽, 鹏, 赵根海, .中科院离子束生物工程学重点实验室,安徽合肥;.安徽农业大学生命科学 学院,安徽合肥 摘要:以一株井冈霉素生产茵株吸水链霉茵井冈变种 .. ,剂量 /氮离子注入诱变,摇瓶筛 为出发茵株,经能量 选得到一株高产茵株,其有效成分井冈霉素?含量比出发菌株提高了%。高产 菌株具有良好的遗传稳定性。通过正交优化发酵培养基后,井冈霉素含 量由 / 提高到 /,增加了%。通过菌种选育扣发酵优化,发酵液中?含量较最初提升了 约%,具有显著的增产效果。 关键词:井冈霉素;注入;诱变;优化 离子注入菌体细胞能引起染色体的畸变,导致 井冈霉素,又称有效霉素 ,是年由上海农药所在我国井 链碱基的损伤、断裂,从而使遗传物质在基因水平或 冈山地区土壤中发现的吸水链霉菌井冈变种代谢产 分子水平上发生改变或缺失,大幅提高变异频率。 生?的一种氨基糖苷类农用抗生素,其有效成分为 所以,离子束诱变是一种将物理诱变和化学诱变特 井冈霉素?,对防治水稻纹枯病具有特效, 性集于一身的综合诱变。本研究探讨氮离 亦可用于水稻稻瘟病,小麦纹枯病的防治旧。另 子注人在井冈霉素高产菌株诱变育种中的作用效 外,?也是生产临床上治疗糖尿病药物伏格列 果;在获得高产菌株的基础上,对其发酵培养基进行 波糖和阿卡波糖的重要前 优化,全面提升其生产能力。 体,其产量的提高和特异合成中间体的积累将显著 材料与方法 降低生产成本或简化生产工艺旧。我国是井冈霉 .材料 素的生产大国,对井冈霉素生产的技术开发和工艺 改进从未间断,在井冈霉素菌种选育方面,利用诸如 出发菌株:吸水链霉菌井冈变种 与复合诱变 、与亚硝酸复合诱变【】 . 由江苏 绿丰农化提供。 等,均获得了良好的应用效果。然而,同一品系若多 次反复使用相同手段进行诱变处理,易发生“钝化” 平板/斜面培养基:天门冬氨酸.%、 现象,导致诱变效果下降,使得大幅提升现有工业生 .%、 %、琼脂。%。 产菌株的生产能力变得越来越难,选择敏感有效的 发酵培养基:大米粉%,淀粉.%,黄豆粉 诱变选育技术是获得高产菌株的关键。 %,酵母粉%, .%, .%, 离子注入细胞修饰技术始于世纪年代, .%,玉米粉%,水。 是集物理和化学效应为一体的一种综合诱变方法, .方法 在微生物高产菌株选育方面取得了显著的效果。 ..孢子悬液制备 基金项目:中国科学院合肥物质科学研究院院长基金青年火花课皿;国家目标导向课。 作者简介:丁艳一,女,安徽芜湖人,生物化学与分子生物学硕士研究生,研究方向:离子束生物工程。电话::: .。 通讯作者:电话:,;:.;..。 一? 万方数据第期 丁艳等:注入诱变选育井冈霉素高产茵的研究 第卷 用无菌水从成熟孢子斜面上洗下孢子,经灭菌 漏斗三层纱布过滤至装有玻璃珠的灭菌三角瓶中, 振荡约 ,使孢子分散,制成单孢子悬液备用。 .. 注入诱变 吸取. 制备好的孢子悬液,均匀涂布于无 菌培养皿上,以无菌风吹干,制成菌斑,于注人机靶 室进行离子注人如图,采用脉冲式注人方式。 注入完成后,将菌斑用无菌水洗脱,稀释涂平板,选 单菌落转接斜面培养,接摇瓶发酵。 .非中心吸水型正面;.非中心吸水型反面 .中心吸水型正面;.中心吸水型反面 图吸水链霉菌井冈变种单茵落形态 表发酵培养基优化的因素水平袁 .. 含量检测 按照井冈霉素水剂国家/, 采用高效液相色谱法测定。标准品购买自 .气源;.等离子体发生;.离子柬;.大靶室; 上海农药所,浓度为. /;试样经倍稀 .可旋转载物盘;.小靶室;.系列真空泵 释,使用反相色谱柱,柱温?,流速 图 离子束注入装置示意图 /, 紫外检测,以外标法峰面积定量。 ..初筛和复筛 计算得到.的含量一。 据文献报道,形态为中心吸水状的单菌落,其发 结果与分析 酵生产抗生素水平比其它形态的高哺】,单菌落形态 如图所示。初筛选取诱变平板上中心吸水型的单 .氮离子注入最佳诱变剂量的确定 菌落进行摇瓶发酵。 在氮离子束注人能量为 条件下,设定注 复筛时将平板上筛选的单菌落接种斜面,培养 入剂量×.× /、、、、、 后接入 摇瓶,装液量为 ,?培养 六个水平,存活率如图所示,剂量为时存活率 后进行含量测定。 低,而在剂量为时有所回升,之后随剂量增大而 ..发酵培养基优化方法 降低,而到时又有所回升。摇瓶考察诱变效果, 通过单因素实验分析,玉米粉、淀粉、大米粉和 确定最适剂量,结果如图。 :对.含量影响较为显著,选择以上 图中数据显示,诱变剂量为时,菌株的正 个因素进行优化,每个因素选取个水平,以. 突变率最高,当诱变剂量为时,菌株的正突变幅 含量为优化指标,按下表进行正交实验: 度最大,但与、剂量下的突变幅相差不大。综 合考虑,选择作为诱变最佳剂量。 一一 万方数据工业微生物 第卷 第期 如图所示,经过氮离子注入诱变,筛选得到高 产菌株,含量比原始菌株.提 高了约%,达到 ?/。 更,瓮. ? ?如鲫??如加?加 . / 图 注入剂量×.× / 对茵株存活率的影响 图 .高产突变茵株的筛选 .诱变菌株遗传稳定性 对高产菌株 进行遗传稳定性检测,经 次传代,摇瓶发酵检测,检测数据如图所示。 图不同剂量下的诱变效果 .诱变株的分离与筛选 总 将诱变后的菌斑用无菌水洗脱,稀释涂平板,分 吾 离出单菌落。初筛中心吸水型的单菌落转接斜面培 多 养,接摇瓶发酵复筛,检测组分含量图 % 。 号 ; . 宅. 图 突变株遗传稳定性由图可知,突变株发酵效价基本保持在 蚋 一 /一 /范围内波动,已达到稳 . ‘ . 定遗传。 墨患;。 暑. 客竺 葛 .发酵培养基的优化. 一 ? 一 :稳碡蓠 \ 。 根据吸水链霉菌井冈变种的发酵特性及前期实 验,选择对菌体有较大影响的个主要因素进行优化,每个因素选取个水平,进 行正交实验, 实验结果见表。 图 标品与发酵液图谱 万方数据第期 丁 艳等:注入诱变选育井冈霉素高产茵的研究 第卷 表正交试验结果 我们发现,高产菌株采用优化培养基发酵得 试验号 玉米粉 ,? 率为 淀粉 大米粉 含// /,同时原始菌株采用优化 。 。 。 。 ?抛 后培养基进行发酵培养,发酵液中含量也达 ? 。 ?暑/,比其在原始培养基中含量提高了约 。 踟 %,该实验结果进一步佐证了培养条件的优化在.拍 ;竺 井冈霉素发酵生产中具有明显的效果和重要的意 。 勉哪 义。 , ”啪。弘? 讨论 。 ?啪 。 凹 :宝 抗生素产生菌经相同诱变剂反复处理后,有可 狮 四 ;拿 埘 佗啪 能使突变位点饱和,影响诱变效果,产量难以持续提 巧佰季 “铋 善 虬粥 高。氮离子注入技术近年来在抗生素产生菌育种上 够蛳 娩仍 ; %? 射枷 得到广泛应用,并取得较好的效果【。本研究证 拂 拍懈 笛啪 瑚 笱笛鲫 勰 勰卿 ?鳓 明,氮离子注人诱变井冈霉素产生菌的方法可行且 ”蜘 ;乌 ”? 螂 有效,在 能量,×.× /剂量 儿, ? 骰差 啪 僦 蜘 ? 下诱变得到的突变株比出发菌株提高了约%。 经传代分析,菌株具备良好的遗传稳定性。 由上表可知,诸因素对.含量影响的大小 通过对发酵培养基的正交优化,得到高产菌株 顺序为:。玉米粉大米粉淀粉,由正交 的最优发酵培养基为大米粉%,淀粉 实验直观分析法?,对主要因素,根据的大小,选 .%,黄豆粉%,酵母粉%, .%, 取平均指标好的水平,得到发酵最优培养基. .%,玉米粉.%,有效提升 .%, 为大米粉%,淀粉.%,黄豆粉%,酵母 的含量 /,相对于出发培养基, 粉%, .%, .%, .%, ?含量提高了约%。 玉米粉.%,结合表中显示的?含量最高 本研究通过菌种选育和发酵优化,发酵液中 的培养基组合为第组配方 ,进行生产能 ?含量较最初结果提升了约%,具有显著的 力验证实验,所得结果如图所示。 增产效果,所得高产菌将为工业实际应用打下扎实 的基础。总 吕参考文献张茜茜,朱永强,刘华梅等.井冈霉素高产菌株的复合诱变 % 筛选.湖北农业科学,,:?.号 . , , 墨.,。:?. , , ,酣以.: 图不同培养基中.含量 .//.. ,,: 由图可知,经正交优化后,高产菌株采用最优 ?. 培养基能有效提升.的含量 /, 廖晓殉,陶科,侯太平.井冈霉素产生菌的诱变选育及发酵 相对于出发培养基,.含量提高了约%。综 条件优化.四川大学学报自然科学版,,: 合离子注入选育高产菌株和培养基优化研究结果, ?. 现生产能力大幅提升了约%。再进一步的验证, 牛莉娜,葛翠凤,葛绍荣.链霉素抗性筛选井冈霉素高产菌 万方数据