【doc】水牛胎儿卵泡细胞和卵母细胞凋亡的特征

【doc】水牛胎儿卵泡细胞和卵母细胞凋亡的特征 水牛胎儿卵泡细胞和卵母细胞凋亡的特征 畜牧兽医,2006,37(1),23,27 ActaVeterinariaetZootechnicaSinica 水牛JL泡细胞和卵母细胞凋亡的特征 何宝祥,郑喜邦,杜玉兰,李彩萍,李恭贺,余四九 (1.广西大学动物科学技术学院,南宁530005;2.甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070) 摘要:选择5月龄胎儿水牛的卵巢,采用石蜡切片,HE染色的光镜观察和DNA末端 原位标记技术(TUNEI)进 行了研究.结果明:5月龄胎儿卵巢上分布着大量的凋亡细胞;在皮质部存在的大 量腔前卵泡中,均匀分布有单 个凋亡的卵泡细胞和卵母细胞,凋亡细胞的主要组织学变化是细胞缩小,核浓 缩;DNA末端标记变化主要显示出 上述结果提示:水牛卵泡细胞和卵母细胞凋亡在胎儿时期已经存在,TUNEL阳性. 细胞凋亡是启动水牛腔前卵泡 闭锁的潜在机理. 关键词:水牛胎儿;卵巢;细胞凋亡;卵母细胞;卵泡细胞 中图分类号:$852.21文献标识码:A文章编号:0366—6964(2006)01-0023—05 TheApoptoticCharacteristicsofFollicularCellsand OocytesinBuffaloFetalOvary HEBaoxiang,ZHENGXibang,DUYu—lan,LICai—ping,LIGong—he,YUSi-jiu (1.CollegeofAnimalScienticandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530005,China ; 2.CollegeofAnimalMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China) Abstract:Inordertounderstandiftheapoptosisoffollicularcellsandoocytesexistsinthebuffa lo fetalsovary,andifdoes,whatistheapoptoticcharacteristics,ovarieswaschosenfromafive montholdfetalbuffalo,theapoptoticcharacteristicsoffollicularcellsandooeyteswasstudiedby paraffinsection,HEstaining,lightmicroscopeandterminaldeoxynucleotidyltransferase— media— teddUTPnickendlabeling(TUNEL)technology.Theresultswereshownthatlargenumberof apoptoticcellsexisteddiffusedlyon5一month— oldfetalovary.Manyapoptoticfollicularcellsand someapoptoticoocytesweredistributedsolelyandevenlyamongalotofpreantrumfolliclesof ovarycortex.Themainchangesofapoptosiswerecellshrinkage,nuclearcondensedinhistology, DNAterminallabelingappearedTUNELpositive.Theseresultssuggestedthattheapoptosisof ovarianfollicularceilsandoocyteswasalreadyexistedinbuffalofetalovary,andtheapoptosis wasthepotentialmechanismofarosingpreantrumfollicleatresia. Keywords:buffalofetal;ovary;apoptosis;oocyte;follicularcells 近年来在动物卵巢卵泡闭锁的研究中,已经有 不少资料发现在卵泡闭锁中存在着卵泡细胞凋 亡r1],有人认为卵泡颗粒细胞凋亡是动物卵泡闭 锁的基础[3"].就卵巢卵泡细胞凋亡的相关研究在 小鼠,大鼠,鸡,人类以及多种动物都有报道L5叫, 然而关于水牛卵泡颗粒细胞凋亡的形态学变化目前 在国内外尚未见报道,水牛胎儿卵巢中是否存在卵 泡细胞和卵母细胞凋亡,如果存在细胞凋亡,它们又 有何生物形态学特征?应用现代分子生物学技术 (DNA原位末端标记)与组织学技术(显微结构观 察),结合检查了水牛卵泡颗粒细胞凋亡的特征,为 水牛腔前卵泡发育和闭锁机理研究提供科学资料. 收稿日期:20050328 基金项目:广西科学基金项目(桂基科0144009);广西"新世纪十百千人才"专 项资金(2001210) 作者简介:何宝祥(1958一).男.甘肃秦安人.博士,教授,主要从事临床兽医学动物生 殖生理研究 *通讯作者:余四九,Email:sjyu@163.corn 24畜牧兽医 1材料与方法 试验:选取水牛胎儿的卵巢组织,制作组织 切片,HE染色,进行水牛卵泡细胞凋亡的组织学观 察.同时取相邻组织,应用细胞凋亡原位检测技术 (TUNEI)检查水牛卵巢卵泡细胞所发生的凋亡及 其特征. 1.1供试水牛及卵巢的获取 在南宁市某屠宰场,在I临床检疫确认健康的待 宰本地母水牛中,经I临床初步观察与检查,结合直肠 检查,妊娠诊断,选取妊娠5,6月龄母水牛3头,在 屠宰后选取雌性胎儿l头在被选母牛屠宰后,立 即解剖胎儿,摘取胎儿卵巢,放置在事先准备好的盛 有Bouin'S固定液的试剂瓶内,待做组织学检查. 1.2光镜组织切片制作与检查 按照常规石蜡组织切片制作要求,取材,Bouin'S 固定液固定12,24h,水洗,脱水,透明,石蜡包埋, 连续切片(6"m),苏木精,伊红(hematoxylinande— osin,HE)染色,封片,最后在光学显微镜下观察卵 巢卵泡细胞和卵母细胞的凋亡情况. 凋亡细胞类型的判定:参考有关凋亡资 料卜引,对凋亡细胞进行观察,描述并拍照. 1.3DNA原位末端标记(Insituend-labelingof DNA) 仪器:染色缸,湿盒,恒温水浴,恒温箱,光学 微镜,天平. 试剂:细胞凋亡原位检测试剂盒(InSitucell deathdetectionKit,POD)购白德国Roche公司, 蛋白酶K购自Sigma公司,二氨基联苯(DAB)购自 晶美生物公司. 除上述盒式试剂外,(1)磷酸盐缓冲液(pH7.4的 PBS);(2)蛋白酶K的10×储存液(215g/2mI)(3) 2过氧化氢的磷酸盐缓冲液;(4)0.05(w/v)二氨 基联苯(DAB)溶液(新鲜配制)(5)70%,80,90, 95,100的乙醇,二甲苯,甘油等.被检材料取与 HE染色相邻的部分石蜡切片,TUNEL检查按照细 胞凋亡原位检测试剂盒的描述进行. 2结果 2.1胎牛卵巢细胞凋亡的HE染色与TUNEL特 征 2+1.1100倍以下的特征在石蜡包埋,HE染色 的胎牛卵巢组织切片上,在放大4O倍镜下可见水牛 37卷 胎儿卵巢的卵泡主要分布在皮质部,见图1.卵巢 皮质部和髓质部弥漫性分布着HE着色较深的与正 常细胞着色明显不同的细胞,即细胞核呈紫黑色的 异常细胞,根据染色特征及参考资料判断为凋亡细 胞.在低倍镜下观察,这种凋亡细胞在部分区域较 多,如靠近髓质部的皮质区和髓质部的部分区域,但 未见到整片细胞的凋亡.在放大100倍镜下观察, 胎儿卵巢的卵泡类型都是腔前卵泡,位于皮质区,凋 亡细胞的种类主要包括卵泡细胞,问质细胞和少量卵 母细胞,髓质区凋亡细胞为其它细胞,见图1,图3. 从相邻组织切片的TUNEI检查中(图2),可 清楚地看到水牛胎儿卵巢上存在着许多染为黑色的 TUNEI阳性细胞,它们弥漫性地,散在地分布在卵 巢各处,在皮质与髓质交界区较多.对照HE染色 的皮质卵泡区,TUNEI在该区也显示染色较淡,体 积较小而数量与HE浓染细胞相似的TUNEL阳 性细胞,确认它们主要是卵泡细胞.在卵巢皮质区 存在极少数染为黑而大的TUNEL阳性细胞,综合 放大1.0倍(图4)及更高倍数和HE染色结果,初 步判定它们是凋亡的卵母细胞,髓质部为非卵泡细 胞. 2.1.2400倍以上的特征在水牛胎儿卵巢上有 一 其HE染色特征有: 定比率的卵母细胞发生凋亡, 细胞核浓缩深染,体积缩小,卵母细胞内出现大的空 腔,与健康的卵母细胞形成明显的对比,见图5. 卵泡细胞凋亡的表现形式主要为:细胞核内的 染色质浓密,染色加深,明显呈黑色,高倍镜下(400 ×以上)见染色质呈丝网状分布在细胞核内,细胞核 浓缩,细胞质也浓缩,细胞体积缩小程度不一,随着 细胞体积的进一步缩小,细胞染色更浓黑,结构不 清,整个细胞一片黑色(图5,图7).进一步详细观 察,健康卵母细胞周围的卵泡细胞大多数健康,只有 少数卵泡细胞凋亡;而卵母细胞发生凋亡的卵泡,其 外周的卵泡细胞凋亡的数量不等,如图5.组织切 片放大1000倍时可更加清楚地看到卵泡细胞和卵 母细胞凋亡的变化,在一初级卵泡中卵母细胞和卵 泡细胞失去联系后发生凋亡的情况,见图7. TUNEL特征:在高倍镜下可清楚见到卵泡细 胞与卵母细胞凋亡的原位标记特征,卵泡细胞被浓 染成黑色,界限清晰,体积大小不等,与相邻组织的 HE染色下所判定的凋亡细胞的变化相一致.凋亡 的卵母细胞在原位被染成较凋亡GCs色淡的黑色, 黑色深浅程度不完全一致.有些卵母细胞呈淡黑色 1期何宝祥等:水牛胎儿卵泡细胞和卵母细胞凋亡的特征25 均匀一片,有些碎裂成块状且显示有不同形状的碎 片,而健康卵母细胞不着色(见图6). 油镜下观察单个卵泡发现(如图8),TUNEI 阳性的卵母细胞,其断裂DNA高度集中在卵母细 胞的一侧,而外围的卵泡细胞多已凋亡,原位标记显 示阳性,与HE染色结果相似.发生凋亡的卵泡细 胞体积缩小程度不同,有的体积略有缩小,损伤的 DNA成丝网状分布于细胞核内或整个细胞内部,有 的卵泡细胞显着缩小,已经浓缩成一个小黑点. 细致观察原位标记切片,有些卵泡在原位标记 后,整个卵泡外观呈云雾状,其凋亡的卵泡细胞着色 深,而有些卵泡呈TUNEI阴性,卵泡无色,而阳性 细胞清晰(见图4,6,8). 一图1,8示5月龄水牛Ilf~)L的卵巢细胞凋亡的特征 图1HE染色.C.皮质区,m.髓质区.被浓染的细胞为凋亡细胞.在皮,髓交界区凋亡细 胞较多40X 图2TUNEL.黑染的细胞为TUNEL阳性细胞,在皮,髓交界区及髓质分布较多;箭头 示凋亡的卵母细胞40X 图3HE染色.浓染的卵泡细胞和少量卵母细胞《箭头所示)弥漫分布于卵巢皮质部 100X 图4TUNEL.TUNEL阳性的卵泡细胞和少量卵母细胞l箭头所示)弥漫性地分布于 卵巢皮部100X 图5HE染色.黑箭头示凋亡的卵母细胞.蓝箭头示凋亡的卵泡细胞400X 图6TUNEI.凋亡卵泡细胞l箭头所示)着深黑色.凋亡的卵母细胞核l五角星所示) 着黑色,呈碎片状,健康的卵母 细胞《四角星所示)不着色400X 图7HE染色.初级卵泡中的细胞凋亡;粗箭头所指为卵母细胞凋亡形态,细蓝箭头 示卵泡颗粒细胞凋亡形态.细 黑箭头示卵泡膜细胞凋亡形态1000X 图8TUNEL.箭头示原始卵泡卵母细胞凋亡的特征.卵母细胞核染色质聚集于细胞 一侧1000X Fig.1,Fig.8Ovaryapoptoticcharacteristicsof5month-oldbuffalofetal Fig.1HE(hematoxylinandeosin)staining.C:cortex;M:medulla.Deep-stainingcellswereapoptotic.Therewere moredeep-stainingonesonboundaryareabetweencortexandmedulla40X Fig.2TUNEL.C:cortex:M:medulla.Dark-stainingcellswereTUNELpositive.ThereweremoreTUNELpositive cellsontheboundaryareabetweencortexandmedulla-arrowsdenotedapoptoticoocytes40X Fig.3HEstaining.Moredeep-stainingfollicularcellsandsonicoocytes(mTOWS)distributeddiffuselyonthecoPtex蝴100X Fig.4TUNEI.TUNELpositivefollicularcellsandoueytes(al[TOws)appearedincortex100X Fig.5HEstaining.Blackarrowdenotedapoptoticoueyte.bluearrowsdenotedapoptoticfollicularcell400X Fig.6TUNEL.Apoptoticfollicularcells(arrow)appearedd唧一 dark.apoptoticoueytenucleus(pen~de)appe dark.fragmentalshape,whilehealthyoueyte(star)WRSTUNELnegative400X Fig.7HEstaining.Apoptosisinprimaryfollicle,thickarrowdenotedtheoueyteapoptosis,thinbluearrowdenoted folliculargranulosacellapoptosis,thindarkarrowdenotedthecacella~ptosis1000X Fig.8TUNEL.Arrowdenotedapoptoticcharacteristicsofoocyte.Thechromatinofoocytew ascondensedandCOIl- gregatedononesideofthecell1000X (TUNEL)技术,首次发现5月龄水牛胎儿卵巢卵泡 3讨论内存在着广泛的细胞凋亡.从细胞的种类看,除了卵 3.1水牛胎儿卵巢卵泡细胞及卵母细胞凋亡的显微母细胞和卵泡细胞之外,还存在其它问质细胞的凋 结构特征亡.这些凋亡的细胞比较均匀而弥漫性地分布于卵 本研究应用HE染色和DNA原位末端标记巢的皮质部与髓质部,但在皮质与髓质的交界区域分 26畜牧兽医37卷 布较多.在水牛胎儿卵巢皮质层存在着大量腔前卵 泡(包括原始卵泡和少量的初级卵泡),但不存在有腔 卵泡.在这些腔前卵泡中,凋亡的卵泡细胞和卵母细 胞分布均匀. 凋亡的卵泡细胞和卵母细胞都发生皱缩,体积缩 小,细胞核染色质浓缩,TUNEI显示细胞核阳性. 卵母细胞的凋亡在4O,100倍镜下就表现为较大的 浓染点(位于腔前卵泡中央),以TUNEL检查最明 显.卵母细胞发生凋亡的相对少见. 有人在卵泡闭锁的形态学研究中,认为卵泡闭锁 发生的起因有两种类型:一种源于卵泡颗粒细胞[1纠; 另一种源于卵母细胞,首先观察到卵母细胞的瓦 解口;而源于卵泡颗粒细胞的闭锁中,可通过DNA电 泳观察到颗粒细胞DNA被激活的核酸内切酶切割成 180~200bp的裂解片段.卵母细胞凋亡驱动的卵泡 闭锁发生在卵泡生长的早期阶段,即原始卵泡,初级 卵泡和腔前卵泡,而颗粒细胞凋亡所引发的卵泡闭锁 发生在卵泡发育的后期阶段?】. 从本研究的HE染色和TUNEI检查来看,在5 月龄水牛胎儿卵巢卵泡细胞凋亡中见到的情况是: (1)在卵母细胞健康的卵泡中就已经有凋亡的卵泡细 胞存在;(2)在卵母细胞发生凋亡的卵泡,卵泡细胞同 样有凋亡.本研究未观察到卵母细胞凋亡的卵泡中 卵泡细胞都健康的情况.Chang等]在了放射诱导 的大鼠原始卵泡和初级卵泡的退化研究中,认为卵泡 退化存在三种情况:(1)健康的卵母细胞伴有1个及1 个以上的凋亡卵泡细胞;(2)凋亡的卵母细胞伴有健 康的卵泡细胞;(3)卵母细胞和卵泡细胞都发生凋亡. 本研究结果与上述(1)(3)点相同,而缺乏(2)的变化, 即凋亡的卵母细胞伴有健康的卵泡细胞.这是否由 于本试验只检查了l头水牛胎儿的卵巢,因样本数太 少所致,有待继续研究. 笔者在水牛腔前卵泡的体外培养中(另一试验), 发现凋亡的卵母细胞和健康的卵泡细胞组成的原始 卵泡,说明在体外培养的原始卵泡中存在着卵母细胞 首先发生凋亡的现象,见到了在水牛胎儿卵巢中未见 到的卵泡退化情况.水牛体内腔前卵泡是否也这样, 有待继续研究.可以肯定的是,腔前卵泡的卵母细胞 发生凋亡就意味着腔前卵泡的彻底退化闭锁. 3.2DNA原位末端标记与HE染色检查对细胞凋亡 的综合判定 DNA的原位末端标记(Insituendlabeling, ISEL)是分子生物学与形态学相结合的研究方法,能 对细胞群中单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染 色,能准确地反映细胞凋亡最典型的生物化学与形态 学特征_1.ISEL包括两种方法:末端脱氧核苷酸转 移酶介导的dUTP缺口末端标记(Terminaldeoxynu— cleotidyltransferase—mediateddUTPnickendlabe— ling)法.简称TUNEL法;DNA聚合酶I或Klenow大 片介导的原位缺口平移(Insitunicktranslation)法. 简称INST法.就敏感性而言,TUNEL要比INST 高.尽管TUNEL法具有许多优点,但它仍然不 能单独用于凋亡诊断,因为采用它不能鉴别细胞坏死 和细胞凋亡lLl.其原因是:只要是DNA发生断裂, TUNEI法就可检出. 在HE染色的显微结构观察中,可将细胞的凋亡 与坏死分开.凋亡细胞的形态表现为细胞体积缩小, 细胞核浓缩;坏死细胞体积变大,表现肿胀,细胞破 裂,细胞质外溢.但HE染色不能准确发映细胞 DNA发生的损伤. 应用HE染色检查和TUNEI检查, 本研究中, 综合判定水牛胎儿卵巢组织发生的卵泡细胞或卵母 细胞凋亡,互相印证,效果较理想.为进一步确认 HE染色认为凋亡的细胞是否可被TUNEI检查为 阳性,我们在另一试验中应用水牛有腔闭锁卵泡中颗 粒细胞发生的凋亡,在同一组织切片先后应用上述两 种方法得到了验证,验证了HE染色判定细胞凋亡的 准确性.本试验认为,这两种方法在细胞凋亡诊断中 只能相互补充,但不能互相替代. 4小结 4.1用石蜡切片,HE染色法与DNA原位末端标记 一 TUNEL法相结合,首次证实5月龄水牛胎儿卵巢 上广泛存在着卵泡细胞凋亡,也存在一定数量的卵母 细胞凋亡. 4.25月龄水牛胎儿卵巢中卵泡细胞凋亡的方式以 活细胞之间散在的单个细胞凋亡为主. 4.3细胞凋亡是启动卵泡闭锁的潜在机理. 参考文献: [1]TillyJI,KowalskiKI,JohnsonAL,eta1.Involvement ofapoptosisinovarianfollicularatresiaandpostovu[atory regression[J].Endocrinology,1991,129(5):2799, 28Ol_ [2]TillyJI.Apoptosisandovarianfunction[J].RevRepmd, 1996,1:162,172. 1期何宝祥等:水牛胎儿卵泡细胞和卵母细胞凋亡的特征27 I-3-] [4] Es] [6] [7] [8] PalumboA,YehJ.Apoptosisasabasicmechanisminthe ovariancycle:Follicularatresiaandlutealregression[J].J SacGynecolInvest,l995,2:565,571. 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