_谷氨酰基转肽酶产生菌发酵培养基的优化及酶促反应研究

_谷氨酰基转肽酶产生菌发酵培养基的优化及酶促反应研究 γ- 谷氨酰基转肽酶产生菌发 酵 培养基的优化及酶促反应研究 王小力，张亚丽 (安徽农业大学 茶与食品科技学院，安徽合肥 23003)6 摘要:通过对枯草芽孢杆菌产 - 谷氨酰基转肽酶的发酵培养基进行优化分析， 在35 ?温度条件下培养时得γ 到 其最适发酵培养基组成是以葡萄糖为碳源、以酵母膏为氮源、发酵液初 pH始 值为 7.5、装液量为 60 mL/250mL ， 并且探讨了 γ- 谷氨酰基转肽酶的部分酶促反应条件。 关键词:γ- 谷氨酰基转肽酶;发酵条件;酶促反应中图分类号:Q555 文献标志码:A - 谷氨酰基转肽酶 (GGT 或者 - GTP) 稳定的枯草芽孢杆菌产生 - 谷氨酰基转肽酶，γγγ 属 通1[]于转胺酶，又称 γ- 谷氨酰基转移酶，是生物体 过单因素优化发酵培养基，从而提高枯草芽孢 杆菌的发酵能力，进一步提高酶的产量和酶活力，内谷胱甘肽代谢途径中的关键酶之一，也是催化转 为酶的工业化生产提供方法和数据参考。移 L - - 谷氨酰基的特异性酶，在生物体内氨基 γ 酸转运过程中起着重要的作用，因此它是反映生物 1 材料与方法 体代谢的重要指标之一。同时，人们还可以利用此 1.1 菌种 酶合成很有价值的药物，对各种肝胆疾病均有很好 的临床效果。另外，2002 年 Suzuki 等研究证实， 枯草芽孢杆菌 (Bacus subts) 由本实验室 illili细菌中 GGT 可以将 - L 谷氨酰胺上 -谷氨酰基 γ 保存，是经过诱变选育筛选出来的产 -谷氨酰γ转移到乙胺的受体上，催化合成 L- 茶氨酸。而 L- 基 转肽酶性能稳定的菌株。茶氨酸 Theanine) (L- 是一种不参与蛋白质组成的 1.2 培养基 特殊氨基酸，是天然茶叶中的重要风味物质之一， 斜面培养基 (g/L):葡萄糖 20、牛肉膏 5、蛋 [2]。 白胨 10、氯化钠 5、琼脂 20，pH 值为 7.0; 可作为添加剂广泛应用于食品和医药行业 - 谷氨酰转肽酶广泛存在于各 种 生 物 γ种子培养基 (g/L):葡萄糖 20、牛肉膏 5、蛋 [3~4]体 内，且在不同生物体内的分布不同。原核白胨 10、氯化钠 5，pH 值为 7.0; 摇瓶发酵培养基 (g/L):葡萄糖 20、 玉米粉 生物 中，酶能溶解于水，且主要存在于细胞浆液 γ- 谷氨酰转肽酶在不同菌10、 酵母膏 15、 MgSO?7HO 0.5、 KHPO1，pH 4224 中或分 泌到细胞外; 值为 7.0。 属的细胞 中，分布的位置不同，如在大肠杆菌[5]，而对于有些枯草1.3 试剂 中，酶主要存 在于周质空间[6]，这就简化了γ- 谷氨酰 - 对硝基苯胺 (γ- Glutamyl- p- 芽孢杆菌，则可 以分泌到细胞外 ni- troa nilide)、对硝基苯胺 (p- nit roanilide) 等。 酶的分离与纯化的 过程。 1.4 仪器与设备 振荡培养箱、高压蒸汽灭菌锅、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 是饲用微生 pH 电子天平、态制剂常用的菌种之一，对促进营养消化吸收、提 值测定仪、无菌操作台、721 型分光光度计等。 高饲料转化率、防病和促进生长有很重要的作用。 1.5 方法 发酵培养基的营养组成是影响枯草芽孢杆菌发酵的 重要因素，其中碳、氮源是其细胞和代谢产物的重 要营养物质。 菌种活化是将保存的菌种转接到斜面培养基， 在 37 ?下培养 24 h，备用。 酶的最适反应温度的确定是将反应温度分别设环刮下菌种，将其转入到种子培养基，37 ?、140 r/min 摇床振荡 24 h，以 5,的接种量转接于发酵 为 20 ? 、 25 ? 、 30 ? 、 35 ? 、 40 ? 、 45 ? 、 培养基 (50 发酵液 / 250 mL mL 三角瓶) 中，在50?和 60 ?，按上述方法测酶活。 30 ?下 140 r/min 摇床培养 24 h。 酶的 pH 值稳定性试验是将 0.5 mL 酶液的 pH 粗酶液的制备是将发酵液在 4 000 r/min 的冷冻 值分别调整为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、 10 min，得到的上清液即为粗酶液。 离心机中离心 8.5、9.0 、9.5、10.0 (pH 值为 5.0~6.5 用 0.1 mo/L lGGT 催化 谷氨酰 - 酶活测定是将 -对硝基 γ[7]乙酸缓冲液调整， pH 值 为 7.5~10.0 用 0.1 mol/L 410 nm 处有吸光值，酶 苯胺的产物对硝基苯胺在s 36 5 hTri调整)，在 ?下放置 ，取出立即放置冰 活性由生成产物的量反映。反应体系为 0.5 mo/L l 浴，调 pH 值到 7.5 ，按上述方法测定酶活。Tris- HCl (pH 值为 7.6) 缓冲液 4 mL 、 酶液 0.5 酶促反应的最适 pH 值试验是将反应液 pH 值 mL、3.5 μmol/mL 底物 0.5 mL，37 ?反应 20 mn， i 加入 3 mL 的 1.5 mol/L 乙酸终止反应，过滤后在 分 别 调 整 为 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 410 nm 处测吸光值。 酶活单位 (U) 定义为在上述反应条件下， 每 8.5、9.0 (pH 值为 5.0~6.5 用 0.1 mol/L 乙酸缓冲液 1 min 生成 1 μmol 的对硝基苯胺为 1 个酶活单位。 调整，pH 值为 7.5~9.0 用 0.1 mol/L Tris 调整)，按 1.6 发酵条件对产酶的影响 上述方法测定酶活。 1.6.1 单一碳源对产酶的影响 对微生物来讲，不同金 属离子对酶活 性 的 影 响 是 在 0.1 mol/L Tris- HCl 缓冲液中分别加入浓度为 0.01 mol/L 的 碳源对其生长速度以及产2+2+2+2+ 2+Ca、Mn、Mg、Zn和 Cu，以不加金属离子为对 物的合成具有重要的意义，枯草芽孢杆菌对不同碳 源的利用情况不同，不同碳源下合成 γ- GGT 酶照，在最适反应温度条件下按上述方法测定酶活性。的 产量不同，从而也会影响到酶活力。所以本实 验分 别以蔗糖、麦芽糖、乳糖替代发酵培养基中 2 结果与分析 GTP -的酶活。γ的葡萄 糖，摇瓶培养后测定1.6.2 单一氮源对产酶的影响2.1 发酵培养基对产酶的影响 为了测定不同氮源对枯草芽孢杆 菌 合 成 2.1.1 单一碳源对菌体发酵产酶的影响 γ- GGT 的影响，而氮源又分为无机氮源和有机 1。 单一碳源对菌体产酶的影响见图氮 源，所以分别以硫酸铵、硝酸铵、酵母膏、4 蛋白 胨、牛肉膏、玉米粉作为单一氮源，摇瓶 1-3 发酵培 养，测定酶活。L m1.6.3 初始 pH 值对酶活的影响 ?U2 发酵液中不同 pH 值也会影响到 - GGT 的活 γ 性，但在发酵过程中 pH 值是难以控制的，只能控 酶活 / 1 制发酵液的初始 pH 值。所以在上述条件优化的基 0 础上，采用不同的发酵初始 pH 值进行摇瓶培养。 葡萄糖蔗糖麦芽糖乳糖pH 值分别为 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5，然后 单一碳源 图 1 单一碳源对菌体产酶的影响 测定其酶活。 由图 1 可知，枯草芽孢杆菌利用不同碳源所产 1.6.4 摇瓶装液量对发酵产酶的影响 摇瓶装液量不 - GGT 的活性不同，其活性高低为葡萄糖, γ 同也会对枯草芽孢杆菌的生长有蔗 糖,麦芽糖,乳糖。分析其原因可能是相对于 GGT 一定的影响，从而影响 -酶的活性，所以γ 二糖 或者多糖来说，枯草芽孢杆菌更易利用单糖用 生长提供能量，从而产生更多的 γ- 250 mL 三角瓶分别装入发酵培养基 40 mL、 50 为自身 。 GGT，得到较 高的酶活当培养基的碳源为葡mL、 60 mL、 80 mL、 100 mL和 120 mL，各接入 ， 所 产 - GGT 的酶活力为最高 3.6 γ5%种子液，按前述条件培养 24 h，测定酶活。 萄糖时 U/mL，碳源为蔗糖时 的酶活力仅次于葡萄糖，乳1.7 γ- GGT 的酶学性 质糖作为碳源时酶活力很 低，因此不适合作为发酵 培养基的单一碳源。故选 用葡萄糖作为该菌发酵 的最适碳源。2.1.2 单一氮源对发酵所产 γ- GT P 酶活的影响 所选的几种化合物 (含氮量 3%) 分别作为培 4 见图 2。 1 - 3 4 L m? U 2 13 - / L m ?酶活1 U2 / 0 酶活1 40 50 60 80 100 120 装液量 / mL 0 图 4 装液量对菌体产酶的影响 从图 4 40 中可以看出，当装液量在 mL~60 mL 时，酶活力相对较高，而且随着装液量的增加，酶 单一碳源 活力也在增加，此时起主导作用的是菌体数量，说 图 2 单一氮源对菌体产酶的影响 明在其他条件不变、氧气充足时，菌体数越多，酶 由图 2 可以看出，枯草芽孢杆菌所产 γ- 活力越高;当装液量在 60 mL~120 mL 时酶活力随 GGT 酶活力高低依次为酵母膏,玉米粉,蛋白胨,着装液量的增加而降低，此时起主导作用的是氧气 钠,牛肉膏,硫酸铵。当氮源为前 3 者时，酶硝酸 的含量，氧气含量有限会抑制菌体生长，从而降低均能达到 2.5 U/mL 以上，说明枯草芽孢杆菌活力 利用 有机氮源的能力要强于利用无机氮源的能力， 酶活力，这说明相对高的通氧量对菌体产酶有利。所以 酵母膏、玉米粉、蛋白胨均能产生相当活力其中以酵母膏最适合，达到 3.5 U/mL，而在由图可知，当 250 mL 三角瓶装入 60 mL 发酵液最 的酶， 适合菌体发酵产酶。 添加单 一无机氮源时，几乎不能合成此酶。因此， 2.2 γ- GGT 的部分酶促反应条件研究 选用酵 母膏为最佳氮源。 2.1.3 发酵液初始 pH 值对酶活的影响 2.2.1 酶的最适温度的确定 温度 pH 值主要是通过影响菌体细胞膜电荷、膜渗 5 。对酶活力的影响见图 透性以及营养物质离子化程度，从而影响菌体对养 分的吸收，进而影响菌体产生 γ- GGT 的能力及4 ?活性。pH 值过低或者过高都会影响菌体生长 ?其 ? 13 - ?L的活性，故本实验选用 pH 值在 6~8.5 范围 和酶 m ?? ?始 pH 值对菌体产酶的影响见图 3。 U内。初 2 ? / 酶活1 ? 0 20 30 50 60 40 4 温度 / ? 13 - L图 5 温度对酶活力的影响 m?U2 图 5 明，随温度的升高，酶活力先升高后降 / 低。在 20 ?~35 ?时，温度越高，反应活化能越 酶活1 大，酶与底物结合的机会越多，反应速度越快;而 温度高于 35 ?时，随温度升高，酶的变性失活就 0 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 会增加;当酶促反应温度为 35 ?时，酶活力为3.6 初始 pH 值 U/mL，比 20 ?时的 2.0 U/mL 升高了 1.6 U/mL;但 图 3 初始 pH 值对菌体产酶的影响 超过 35 ?时酶活开始迅速降低，当温度为 60 ? 如图 3 所示，发酵液初始 pH 值在此范围内 时，酶活力很低，为 0.6 U/mL，比最高值降低了 γ- GGT 酶活性随 pH 值升高而先升高后降低，3.0 U/mL，说明 γ- GGT 的酶促反应受温度影响酶活性差异不显著，说明该菌对 pH 值的适应但 35 ?。 明 显。由图可知，酶的最适反应温度为较好，当 pH 值为 7.5 时酶活力最好，因此确性比 2.2.2 酶的 pH 值稳定性试验 7.5 为发酵液的最适初始 pH 值。 定 4 4 ? ? 1??-3 13 -L ? L m ?m ? ?? U?2 U ?2 ?酶活1 / 酶活 / 1 ?0 2+2+2+2+ 2+ 对照Ca Mn Mg ZnCa 0 5 6 7 8 9 10 金属离子pH 值 图 8 不同金属离子对反应酶活力的影响 图 6 酶的 pH 值稳定性 3 结论由图 6 可知，随 pH 值升高，酶活力先升高后 降低。当 pH 值为 6~8 时，- GGT 具有相当的γ 本论文优化了产-谷氨酰基转肽酶的菌株γ2.9 pH 值低于 6 活力，均在 U/mL 以上;而在 酶 的或者 高于8 时，酶活力明显降低;当 pH 值为 10 发酵培养基，得到最适碳源为葡萄糖、最适氮源为 时，保 温20 min，酶活力基本丧失。因此，γ- pH 为值 酵母膏、最适初始 7.5、最适装液量为 60 GGT 在 pH 值为 6~8 范围内较为稳定。 mL/250 mL。同时，本实验对 - 谷氨酰基转肽γ2.2.3 pH 酶促反应的最适值的确定的酶促反应进行了研究。酶促反映最适温度为 酶 pH 值对酶活力的影响见图 7。 352+ 2+ ? 、 最适 pH 为 7.5、 子 Ca和 值金属离Mg对 2+2+ 2+ GGT 和 Zn-活性有激活作用，而 Cu、Mnγ4 对 酶活性有抑制作用。 ? ? ? ? 13 - 参考文献: ? ?L ?m ??U 2 ?1] [Jun H iratake， Makoto Inoue， Hideyuki Suzuki， et al. Identification of Catalytic nucleophile of escheric hiacoli 酶活 / 1 - glutamyltranspeptidase by Mechanism- based γ 0 affinity- label[J]. ICRAnnualReport，2000 (7):44- 45. 5 6 7 8 9 汤 . 茶氨酸的合成、药理及其在食品中的应用[J]. 茶 pH 值[2] 叶通报，2002，24 (4):19- 21. 图 7 pH 值对酶活力的影响Jaspers C J， PenninckxM J. G lutathione metabolism in [3] 由图 7 可知，随 pH 值的升高，- GGT 活γyeast Saccharom ycees re vcsae: evdence that gamma iii 力 先升高后降低。在 pH 值为 5.0~7.5 时，随 pH 值越 - glutamyltranspeptidase is a vacuolar enzyme[J]. Biochimie， 来越接近中性，酶活力升高;而当 pH 值大于 7.5 1984，66:71- 74. 时，随 pH 值越来越偏离中性，趋于碱性，酶活力 PayneG M，Payne JW . Gammag-l utamyltranspeptidase is [4] 迅速降低;当 pH 值为 7.5 时，酶活力达到最高。 not involved in the bulk up take of amino acids，peptides pH 值为 7.5。 因此，确定酶促反应的最适or gammag- lutamyl- amino acids in yeast( Saccharomyc es 2.2.4 金属离子对酶活性的影响 以不加金属离子为 cerevisia)e [J]. Biochem J，1984，218:147- 155. 对照，研究不同金属离子对Hideyuki Suzuk，i Hidehiko Kumagai， Tatsurokuro- 酶活性的影响。不同金属离子对反应酶活力的影响 [5] Tochikura. - Glu- tamyltranspeptidase from γ见图 8。当不加金属离子时，酶活力为 3.5 U/mL， Escherichia coli K- 12:Formation and Location[J]. Journal 2+ 2+ 加入 Ca或者 Mg时，酶活力均高于 3.5 U/mL， of Bacteri- ology，1986，168 (3):1 332-1 335. 2+ 2+ 说明 Ca和 Mg对 GGT 活性有激活作用;而当加 浅田芳宏. - Glutamyltranspeptidase 制备方法[P]. 日γ2+2+ 2+ 入 Mn、Zn和 Cu时，酶活力均低于对照的酶活 本 公开特许. 特开平 4- 281787，1992. 2+2+ 2+ 力，说明 Cu、Zn和 Cu对酶活性有抑制作用。 6] [Kimikazu I ，Kyoden Y，Katsum N，et a. Propertes of ili金属离子对 γ- GGT 活性的影响可能与其活性中心 - Gutamytranserase from Lentnus edodes J. γllfi[] 的结构有关。[7] Agrboil Chem，1975，39 (10):1 933-1 940.?