角膜滴用TATaFGFHis蛋白对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的治疗(可编辑)

角膜滴用TATaFGFHis蛋白对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的治疗(可编辑) 角膜滴用TATaFGFHis蛋白对大鼠视网膜缺血再灌注损 伤的治疗 温州医学院 硕士学位论文 角膜滴用TAT-aFGF-His蛋白对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的治 疗 姓名:林海环 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:李校?;林绍强 20080501温州医学院硕士学位论文 角膜滴用 蛋白对大鼠 视网膜缺血再灌注损伤的治疗 目的 第一部分 观察由的反式激活蛋白转导域 ,?携带的人酸性成纤维细胞生长 因子 ,和组氨酸的融合蛋白??通过角膜滴入 给药进入视网膜组织的情况。并构建融合蛋白?作为对照蛋白。 .第二部分 眼角膜滴用融合蛋白?对大鼠实验性视网膜缺血再灌注 ,损伤的治疗作用,并探讨其作用机 理。 .第一部分 扩增基因片段,利用蹦和的同尾酶特性,用 和聊双酶切扩增产物并与 和勰双酶切处理的质粒相 连,转化至大肠杆菌 ,氨卞青霉素筛选阳性克隆。抽提经测序鉴 定序列 正确的重组质粒,转化至大肠杆菌,利用氨卞抗性筛选出转化子。 分别用诱导表达融合蛋白?和,离子交换及肝 素亲和两步层析法分离纯化蛋白。 健康大鼠只随机分为生理盐水组组、州组和 ?组,每组只,组滴入生理盐水,组滴入腿 ,?组滴入心.。大鼠给药后分别于 、 、 、 、 和 处死,每时间点只,双眼给药。用 抗体,采用免疫组化法检测和?在角膜和 视网膜组织的分布情况。 .第二部分 健康大鼠只随机分为生理盐水治疗组简称组、?治疗 组简称组、?治疗组简称组。各组大鼠均采用前房灌 注加压形成. 高眼压,维持 建立模型。再灌注开始后及 .每隔 ,组滴入生理盐水,组滴入腿,组滴入腿 ??进行治疗。各组大鼠分别于再灌注,, 处死,每时间点 只,每组右眼为实验眼,左眼为正常对照眼。动物造模前及处死前 行视网膜 温州医学院硕士学位论文 点图检测, 波和波波幅。光学显微镜下观察视网膜组织 病理学变化旺染色,记录视网膜内层厚度和视网膜神经节细胞 数目的变化。采用原位凋亡检测法检测视网膜神经节细胞层 和内核层的细胞凋亡情况。 结果 .第一部分 正确构建表达质粒载体?。经诱导后,融合蛋白 ?和?的表达量分别占菌体总蛋白的%和%,均为可 溶性表达。经两步层析纯化后,获得了纯度大于%的??和 卜蛋白。免疫组化结果表明,组、?组在角膜和视网膜组织 、 、 、 、 均未见到染色阳性细胞。?组在 、 的角膜和视网膜组织均能见到阳性细胞,主要分布在角膜上皮 细胞 层和视网膜节细胞层。 时有微量进入视网膜组织, 时??大部分被清 时?在视网膜的分布达到高峰, 除。 .第二部分 ?检查:与组相比,组 波和波波幅在,, 均无明显差异 ,组 .。与和组比较,再灌注 波波幅.?. 脚明显高于组.?.肌和组.?.?.和 .;再灌注, ,组 波波幅.?.肌和. ?.肌明显高于组.?.脚和.?.肌和组 .?.岫和.?.脚.。 ?视网膜组织病理学变化:损伤早期,水肿增厚,和均可见核 固缩细胞,晚期数耳减少,萎缩变薄。与组相比,组在再灌注 ,厚度有差异.,而其余各时间点,数目和厚度均 无差异.。与和组比较,再灌注,组水肿更严重 .,而数目均多于前两组,但只与组有统计学差异.; 再灌注,组与前两组相比,厚度均无差异.,而数目 明显多于前两组.;再灌注,组厚度大于前两组., 且数目均多于前两组.。 ?视网膜组织细胞凋亡:正常大鼠视网膜染色阴性,、、组视网膜 和均可见大量棕黄色阳性细胞,并随再灌注时间的增加而减少。 与 组相比,组在再灌注各时间点的阳性细胞数均无显著差异.。与 和组比较,再灌注,组的阳性细胞与组有差异.,但温州医学院硕 士学位论文 与组无显著差异.;再灌注,组和的阳性细胞数明 显少于前两组.;再灌注,组的阳性细胞明显少于前两组 .。 结论 .角膜滴用 ?蛋白不能进入视网膜组织,蛋白转导域能有效 携带?穿透眼球血眼屏障进入眼底到达视网膜组织。 .成功构建视网膜缺血再灌注模型。 .??蛋白能够改善损伤的组织病理学变化,抑制细胞凋亡,对 视网膜细胞功能恢复有作用。 .?对损伤的治疗可能通过抑制细胞凋亡和保护神经节细胞的 途径。 .为角膜滴用蛋白治疗视网膜缺血再灌注损伤提供理论依据。 关键词酸性成纤维生长因子; 蛋白转导域; 视网膜缺血再灌注; 凋亡 视网膜电图; 温州医学院硕士学位论文 ? ?.,?. ?弱. . , ?. . ,? . . .也矾. . . : 烈,? ; ,, , , , .. . 温州医学院硕士学位论文 ,? ? /. . . ? , ’, . .. ,, ? .丑。 月 . ., %%. 够.,’’ , , .眦? , ., , . : ? 口. 人 ..:.州.:.‖ 温州医学院硕士学位论文..?. ; , ..? .士.? .:.‖ ...? .. ... .. ? :四, , ; . . . . , . ,., .; , 口., .; , 口., 口.. :? ,.诵 ,, 口. . ,,.,.; , ., , 伊.. . ’ ., . . . 温州医学院硕士学位论文 .? . . ?瓜. . ?. :; ; 诹; ; 温州医学院硕士学位论文 缩略词表温州医学院硕士学位论文 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的 研究成果。据我所知,除文中已经注明引用的内容外,本论文不包 含其他个 人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体,均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名:硅丞连写、日期:型窆:圣: 关于学位论文使用授权声明 本人完全了解温州医学院有关保留、使用学位论文的规定,学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将 学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权 将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标和摘要汇 编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 日期:迦筮:圣: 导师签名: 学位论文作者签名:幸荦炀温州医学院硕士学位论文 .上.一 刖 舌 视网膜缺血再灌注 ?,损伤是一种较 为常见的临床疾病。如视网膜中央动脉阻塞、视网膜静脉阻塞, 缺血性视神经病 变、糖尿病视网膜病变等,均可造成不同程度的视网膜缺血,在血液再通后,视 功能反而下降,视网膜损伤加重剖。目前认为损伤的发病机理包括缺血缺 氧引起能量缺乏、钙离子超载、自由基大量产生、兴奋性谷氨酸过量释放、各种 神经营养因子的缺乏及由此而启动了调控细胞凋亡的基因,使视网膜神经细胞因 凋亡致死,从而引起视功能的损害。由于眼球是一个相对封闭的球体,存在血 一眼屏障 以保持眼内外环境的稳定性,保证视网膜感 光功能的安全。受血一眼屏障、血浆蛋白结合等因素影响,局部滴眼给药以及全 身给药进入视网膜组织的药量很少,难以达到有效的治疗浓度。目前,临床治疗 视网膜缺血再灌注损伤,通常采用球结膜注射方法,然而该方法操作难度大,容 易损伤眼球内组织,给病人造成痛苦。因此,寻找防治损伤的有效药物并改 进给药方式具有重要的临床实践意义。酸性成纤维生长因子 ,是一种重 要的神经营养因子,其受体广泛存在于神经元、星形细胞、内皮细胞、成纤维细 胞及软骨细胞等多种细胞。通过与其相应的受体结合发挥调节基因表达、 促进细胞增生分化及营养神经细胞等多种生理作用。此外,的神经营养作 用还表现在促进中枢和周围神经损伤后修复再生方面酗。 蛋白是人类免疫缺陷病毒的反式激活因子,年,和 发现蛋白能够跨膜递送进入细胞。年等证实 蛋白中有一个富含碱性氨基酸、带有正电荷的多肽片段蛋白中位氨 基酸与蛋白转导功能密切相关,并称之为蛋白转导域 , 年用变形的?一半乳 糖苷酶经腹腔注射后 能够进入到包括大脑在内的各种组织内,证实 可以携带外源蛋白突破血脑屏障嘲。最新的实验结果表明? 蛋白腹腔注射后 后便能到达大脑内海马等组织叫。 本研究根据基因构建阴性对照蛋白蛋白,在大肠杆 菌表达系统中表达。应用组氨酸亲和层析法纯化融合蛋白。运用免疫组化方法, 观察眼角膜滴用进入大鼠眼球内的情况。采用视网膜缺血再灌注 损伤模型,探讨眼角膜滴用?对视网膜功能、视网膜组织病理 学改变以及视网膜细胞凋亡的影响,以评价??局部滴眼给药治疗 损伤的可行性。 温州医学院硕士学位论文 第一部分 弟一鄙万 眼角膜滴用 蛋白进入视网膜组织的检测 材料与方法 材料 .菌种、质粒、动物 大肠杆菌:公司 大肠杆菌:公司 原核表达载体一:公司 质粒??。争埘:暨南大学医药生物技术研究开发中心 大鼠清洁级,雄性,~:温州医学院实验动物中心 .分子生物学试剂 聚合酶:公司 聚合酶:公司 一连接酶:公司 限制性内切酶 、聊、勰:公司,:公司 :杭州昊天生物公司 质粒小量抽提试剂盒:上海生工 胶回收试剂盒:上海生工 产物纯化试剂盒:上海生工 引物合成:上海生工 .蛋白表达纯化试剂 :公司 公司 :广东环凯微生物科技公司 凝胶:公司 ?亲和凝胶:公司 :宝生物工程大连有限公司 丙烯酰胺,,’一亚甲双丙烯酰胺:公司 ,,考马斯亮蓝:公司 甘氨酸:上海伯奥生物科技有限公司 温州医学院硕士学位论文 试剂盒:上海申能博彩公司 美国进口透析袋:北京经科宏达公司 .动物实验试剂 抗体:公司 兔抗人 试剂盒:武汉博士德公司 抗体稀释液:武汉博士德公司 多聚赖氨酸:福建迈新公司 试剂盒:武汉博士德公司 水合氯醛:国药集团化学试剂公司 .常用溶液及缓冲液配置 ..大肠杆菌培养相关溶液液体培养基: 的去离子水中加入 ,. 和. ,搅拌溶解后,高压灭菌,?保存。 固体培养基含有 /卡那霉素抗性: 的去离子水中加入 ,. ,. 和. 的琼脂粉,高压灭菌。稍 冷却后无菌操作的条件下,加入浓度为,摇匀后 /卡那霉素 倒入培养皿中。培养基完全冷却凝结后置于?冰箱中保存。 /卡那霉素: 卡那霉素粉末溶于 的灭菌超纯水中,过滤除 菌后?保存。工作浓度为 /。 %甘油: %甘油丙三醇溶于 的超纯水中,高压灭菌。 . 。: 去离子水中含有. 无水,高压灭菌。 ,.:. 溶于 灭菌水中,除菌过滤,?保存。 。 工作浓度为. ..蛋白电泳相关溶液 %过硫酸胺: 的去离子水中含有. 过硫酸胺,保存,有效期为 一周。 %:称取 固体,加到 去离子水中,并加热溶解,使用浓 。 调节至.,加去离子水定容至 . . 去离子水中加入. 碱,用浓盐酸调 。 节值至.,加去离子水定容至 . .: 去离子水中加入. 碱,用浓盐酸调 节值至.,加去离子水定容至 。 . %丙烯酰胺溶液: 去离子水中加入丙烯酰胺 和甲叉双丙烯酰胺 . 。?热溶,滤纸过滤,冷却后保存。温州医学院硕士学位论文 考马斯亮蓝染色液: 去离子水中含有甲醇 、冰醋酸 和 . 考马斯亮蓝 ,搅拌溶解后即可。 脱色液:冰醋酸 ,甲醇 和去离子水 ,混匀后即得。 聚丙烯酰胺蛋白电泳缓冲液: 去离子水中含有. 碱、 甘氨酸 和 ,?热溶。工作浓度为 一聚丙烯胺蛋白 电泳缓冲液。 . :缓冲液中含有? ,%/ ,.%/溴酚蓝,%/甘油,%/巯基乙醇。 ..蛋白纯化相关溶液?:称取.,加入 去离子水,并 加热溶解,用. 。 的滤膜过滤除去杂质,加去离子水定容至 ?、 高压灭菌,室温保存。 ?:称取.,加入 去离子水, 。?、 并加热溶解,过滤除去杂质,加去离子水定容至 高压灭菌,室温保存。 :用 。?。溶液调节 ?溶液,用计 测试值至.,所得溶液即为 。工作浓度为删。 . :称取氯化钠. ,加入 ,并加热溶解,过 定容至 滤除去杂质,加 ,?保存。 .:称取氯化钠. 删,并加热溶解, ,加入 过滤除去杂质,加 定容至 ,保存。 .:称取氯化钠. 训,并加热溶解, ,加入 过滤除去杂质,加 定容至 ,?保存。 ..动物实验相关溶液 %水合氯醛:称取 水合氯醛,加入 去离子水,并加热溶解,加 。 去离子水定容至 . :的超纯水中加入 ,? ,? . 。 。用浓盐酸调节值至.,加水定容至 %多聚甲醛: 的. 中加入 多聚甲醛,置于?的水浴锅 中搅拌至完全溶解,过滤后置中保存。 ?×多克隆抗体:用抗体稀释液:稀释。 显色液:临用前将试剂盒中支溶液各取一滴,加水 混匀后立即使 用。 .主要仪器设备 冷冻离心机:公司 温州医学院硕士学位论文 台式离心机:上海安亭仪器厂 电热恒温培养箱一:上海森信实验仪器公司 全温度震荡培养箱呷 :大仓市实验设备厂 计:上海精科公司 超纯水机:公司 恒流泵一:上海沪西分析仪器厂 记录仪:重庆川仪四厂 蛋白电泳仪:北京市六一仪器厂 恒压恒流电泳仪一:北京市六一仪器厂 分光光度计:公司 溶剂过滤器:上海嘉鹏科技公司 超声波细胞破碎机 宁波新芝生物公司 冷冻干燥机?:北京博医康技术公司 方法 . 扩增. 片段 ..质粒的抽提 接种含模板质粒??。埘 的大肠杆菌于 培养基中, ?培养过夜。 取 培养菌液,, ,离心 ,弃上清,采用质粒小 量抽提试剂盒抽提质粒。 取 抽提的质粒,%琼脂糖电泳检测。 .. 引物的与合成 :’?匹丛?,.从从一’ :’叁鱼?堡一’ 其中,下划线部分为 酶切位点,下划线部分为蹦酶切位点, 引物由上海生物工程技术公司合成。 扩增反应 的引物母液: 装的引物用灭菌后的超纯水配成 的母液保存。 工作浓度为 反应体系如下:. 住.?螂 温州医学院硕士学位论文 肛弘 肛 .肛 总体积 弘 反应混合物,经?变性 进入循环,循环温度及时间为?, ;?, ;?, 。 ,共个循环,然后?延伸 取 扩增产物,用.%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。 采用上海生工的胶回收试剂盒进行回收,并用.%的琼脂糖电 泳检测。 . ??重组质粒的构建 ..表达载体的抽提 接种含的大肠杆菌,?培养过夜,同方法..。 所抽提的质粒?冰箱中保存备用。 .. 产物和表达载体一的双酶切 用和占明双酶切产物? 片段。 用 和双酶切表达载体,其中聊?和/的粘性末端 一致。 ?水浴反应 ,反应体系如下: 体系一:肛 × 肛 扯 磨儿 肛 斗 总体积 体系二: 肛 ?。 × 肛 弘 总体积 酶切完毕后,采用上海生工的产物纯化试剂盒进行回收。并用 温州医学院硕士学位论文 .的琼脂糖电泳检测。 ..连接反应 将产物 片段的酶切回收产物和表达载体的酶切回 收产物于?连接. ,得到??重组质粒,反应体系如下: . “ 酶切回收产物 肛 酶切回收产物 弘 总体积 ..感受态大肠杆菌 和大肠杆菌的制备 本实验选用大肠杆菌 为重组质粒的克隆扩增菌株,选用大肠杆 菌 为表达菌株。制备感受态整个过程均须无菌操作,具体步骤为: 取肛复活甘油菌,接种于 新鲜培养液中按%的接种量, ?, ,过夜培养。 按%的转种量转种,。、 振荡培养. ?.,置冰上 ;。 各吸取 离 菌液分装到冰预冷的管中,?、 心 ,去尽上清,加. 预冷:,轻轻打匀重悬细胞。 ‘、? 离心 ,去尽上清,加. 预冷 , 。 轻轻打匀重悬细胞;冰浴 。、? , 离心 ,去尽上清,加. 预冷 重悬细胞。 冰浴,直接转化或加%甘油于?保存备用。 ..连接产物转化大肠杆菌 取肛感受态大肠杆菌 ,冰水中放置,加入弘方法..的连接 。 产物冰浴 ?准确热激 ,立刻冰浴 ;加入 新鲜培养基,、 。 振荡培养 取 在抗性?/的氨苄青霉素平板上涂布,培养箱过夜 培养。 并以未经酶切的质粒作为阳性对照,以未转化的感受态大肠杆菌 作为阴性对照。 .重组质粒的鉴定 ..菌落鉴定 温州医学院硕士学位论文 用无菌牙签随机挑取转化的个单菌落,分别在装有肛灭菌水的管 中搅拌一下。 沸水中煮 , ,吸取上清作为模板。反 离心 应体系如下: .弘× 肛 .弘 .枷 弘 . .肛 .肛 “ 总体积 反应条件同方法..,扩增后取肛扩增产物,用%的琼脂糖凝胶进 行电泳分析。 并以无模板的体系作为阴性对照,模板为质粒的体系作为 阴性对照。 ..序列分析 挑选个经菌落鉴定呈阳性的转化子,接种到 含弘/的氨 苄青霉素的培养基中,?、 /过夜培养,%甘油保种。 取甘油菌测序,序列测定由上海基康有限公司完成。 .重组质粒转化大肠杆菌 抽提鉴定正确的重组质粒,同方法..。 取重组质粒 转化感受态的大肠杆菌。 在抗性垤/的氨苄青霉素平板上筛选阳性转化子。 . ?州和在大肠杆菌中的表达 ..诱导表达 分别挑取?和的单克隆菌株,接种到含氨苄青霉素的 液体培养基中 上/过夜培养。 按的比例转接到新鲜液体培养基中,剧烈振荡培养至对数生长期 。?.一. 取 菌液作为诱导前样品,在剩余菌液中加入终浓度为. 的, 。 ?,诱导表达 ..表达产物聚丙烯酰胺凝胶?电泳分析 ...凝胶的配置 温州医学院硕士学位论文 按照北京六一仪器厂蛋白质电泳操作说明书安装好玻璃板。 配制%分离胶,迅速加至已安装好的两玻璃板的间隙中,流出 。 灌注积层胶所需空间梳子的齿长再加 加水至玻璃板的边缘,室温垂直放置。待分离胶完全聚合后,倾出 覆盖层液 体,并用滤纸吸净。 配制%的浓缩胶,在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶,并立即在浓缩 胶溶液 中插入干净的梳子,室温垂直放置。 ...全菌样品的制备 , 取诱导前和诱导后各时间点菌液各 ,离心 ,弃上清。 加入弘水和肛 ,振荡混匀。 × ?煮沸 ; 离心 ,备用。 ...上清和沉淀样品的制定 取诱导前和诱导后各时间点菌液各 ,?, ,弃 ,离心 上清。 将收获的菌体重悬于冰预冷的中,超声破碎工作时间 、间歇时间, 离心?、 ,分别收集上清和沉淀。 , 。 取肛上清,加入等体积的× 沉淀加入弘灭菌水和肛 ,并吹打均匀。 。 ?,煮沸 离心 ,备用。 ... 电泳 待浓缩胶完全聚合之后,小心取出梳子,并固定于电泳槽上,内外 槽各加入 甘氨酸电泳缓冲液。 按预定的顺序加样每孔 ,连接好电源,按恒压方式进行电泳。 电泳条件:开始时恒压 ,当染料溴酚蓝前沿进入分离胶后,把电 压提高 到 ,继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部,关闭电源,停止电泳。 。 从电泳装置上卸下玻璃板,标记凝胶方向,考马斯亮蓝染色 将凝胶浸泡在脱色液,摇床上脱色至背景清晰。 . ?和的分离纯化 ..摇瓶发酵 将种子菌液按.%的接种量接种到含有氨苄青霉素的 的培养基中 。 . 摇瓶培养 / 再按%的转种量转种到三角瓶装液量为中,。、 。 摇瓶培养 温州医学院硕士学位论文 。 添加诱导剂,至终浓度为.洲,?, /,继续培养 离心?、 、 ,收获菌体。 ..菌体的超声破碎 将收获的菌体重悬于 冰预冷的中。 超声破碎工作时间 、间歇时间 ,离心?、 , ,收集上清液。 .. ?离子交换层析 。 打开、,检测器,设置检测波长为 ,灵敏度为.,预热 用. 的 溶液平衡离子交换层析柱,流速为 /。 基线平稳后,调整基线为。 调整流速为. /,上蛋白样。 用含. 的 /,至基线平稳。 溶液洗脱杂蛋白,调整流速为 用浓度为. 的 溶液洗脱目的蛋白,调整流速为. /。 收集洗脱峰。 用浓度为. 的 溶液洗脱杂蛋白,调整流速为 /,至基线 平稳。 的 用浓度为. 溶液洗脱杂蛋白,至基线平稳。 %分析洗脱目的蛋白。 ..肝素亲和层析 用. 的 溶液平衡肝素亲和层析柱,流 /。 速为 基线平稳后,调整基线为。 用. 的 溶液平衡肝素亲和层析柱,流速为 /。 基线平稳后,调整基线为。 调整流速为. /,上咧柱洗脱后的蛋白样。 的 用浓度为. 溶液洗脱杂蛋白,至基线平稳。 用浓度为. 的 溶液洗脱目的蛋白,调整流速为. /。 收集洗脱峰。 用浓度为. 的溶液洗脱杂蛋白,至基线平稳。 ?%分析洗脱目的蛋白。 ..目的蛋白的透析脱盐与冻干 用无菌生理盐水透析 ,换液次,以除去纯化中带入的盐。 蛋白透析后,经.胁滤膜过滤除菌。 蛋白置于冰箱,预冻过夜。 温州医学院硕士学位论文 放入冻干机中, 冻干,密封,放?冰箱保存。 . ? 蛋白眼局部给药穿膜活性 ..动物分组、给药 健康大鼠只随机分为生理盐水组组、?组和?? 、 、 、 、 组,每组只,根据给药后的时间不同分为 和 组,每组共只眼。 经生理盐水稀释,分别得到 /和. /的?卅和 ?蛋白溶液。 大鼠用%水合氯醛 /麻醉后,组滴入生理盐水,组滴 入垤?,?组滴入??。 ..载玻片防脱处理 将玻片在%盐酸中浸泡过夜,用清水冲洗 后,用无水酒精洗次, ?烘箱中烘干。 将充分洗净并干燥的玻片浸泡在多聚赖氨酸稀释液中:, 后取 。 出沥干,置于烘箱中烘干备用。 ..标本的采集及处理 根据各组时间点,采用颈椎脱臼处死动物,立即挖取眼球,以生理 盐水冲洗 。 血渍,浸泡于%多聚甲醛中性缓冲液中固定 以平行于视神经矢状轴且以其为平面切除眼两侧组织,小心取出 晶状体,流 。 水缓慢冲洗 置于脱水机中经%酒精、%酒精、%酒精、无水酒精脱水,二甲苯透 明, 浸蜡,石蜡包埋。 将包埋好的眼球标本,以平行于视神经矢状轴为平面进行切片。 每个标本不连续切片片,切片厚度为胁。 。 用已涂有多聚赖氨酸的载玻片粘片,?烘箱中烘. ..免疫组化法检测?和蛋白 石蜡切片经?二甲苯 ,二甲苯 ,%酒精 ,%酒精 , %酒精 ,自来水 脱蜡水化。 ,自然冷却。 枸橼酸盐缓冲液高压锅修复 。 蒸馏水洗后%双氧水处理 ,用洗三次,每次 加兔血清封闭液,?水浴 ,甩干勿冲洗。 加兔抗人标签单抗稀释浓度为:,?过夜。用洗三次,每 次 ,擦干组织周围液体。 , 加生物素化山羊抗兔,水浴 。用洗三次,每次 温州医学院硕士学位论文 擦干组织周围液体。 加复合剂,?水浴 。用洗三次,每次 ,擦干组织 周围液体。 棕色显色,显微镜下控制显色 ,自来水终止反应。 苏木素复染 ,自来水漂洗遍,盐酸酒精分化数秒钟,自来水漂洗, %氨水泛蓝,自来水漂洗。 酒精梯度脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。 。 光镜下观察结果,视网膜和角膜部位各取个视野观察阳性细胞% 医学院硕士学位论文 结果 .目的基因’的合成 利用的方法,获得编码融合蛋白的基因片段。如图所示, 琼腊糖电泳结果表明在约 处扩增出特异条带,与预期大小一致。把目的 基因克隆入质粒得重组质粒?。 .重组质粒的菌落鉴定 重组质粒转染大肠杆苗 ,随机挑取的个重组质粒? 转化子单菌落,经鉴定株结果呈阳性,如图所示。经测序,第号质 粒 的序列完全正确测序图,得融合蛋白表达苗?。 .蛋白 和在大肠杆菌中的表达 ’ 经.加 ?诱导 后,离心后分别收集菌体 /??和/,并进行%的 电泳。图 的泳道在约 处有一条明显的表达带,与 ?卜的预期分子量一致;图 的泳道在约 处也有一条明显 的表达带,与?的预期分子量一致。经 .分析融合蛋白表达 量均占菌体总蛋白的%左右。 .??和蛋自纯化 摇瓶发酵的菌体经超声破碎仪破碎后,再经凸离子交换层析后, 收集洗脱 液,%电泳分析,得到纯度约%的目的蛋白。将含目的蛋白的洗脱 液再进行肝素亲和层析,. 的溶液洗脱,%?电泳结果显示, 融合蛋白纯度达到%以上见图 、。 .?蛋白服局部给药穿膜结果 石蜡切片的免疫组化结果显示,各时间点生理盐水组和?组的角 膜和视网膜中均染色阴性细胞,见图、。 组的角膜从 、 、 开始微弱阳性结果, 、都有明显的阳性结果, 开始减弱, 而到 大部分蛋白已被消除见图。口毋 ‰,?曾日啪?幽“率温州医学院顿?学位论文 . .. ???”一? 图 扩增?基因片段 图转化子菌落鉴定琼脂糖电泳圈 :一; :一: : 产物; :阴性对照 ;阴性对照 :阴性对照 :个转化予茁落产物.彻 . . .囊.鎏 .功 . 轴 . 砌 二蠹警图 ?诱导表达产物 和的电泳图 :?.诱导表达产物;:诱导表达产物 :;:诱导前样品 :诱导表达产物温州医学院硕?学位论女. . .胁 .图融合蛋白??和纯化产物电泳图 :??纯化产物;: 纯化产物 :;:超声破碎后的菌体沉淀; :超声破碎后的菌体上清: :硎离子交换层析洗脱下柬的目的蛋白; :肝素亲年?层析洗脱下来的目的蛋白:温州医学院硬士学位论 文 ,。.舞驾 ?一.?要盘 ?曩蔓毒删 。嘲 卜百而一: 图生理盐水组免疫组化结果× :角膜组织;:视网膜组 :基质层;:上皮层;:外核层; ;内核层;:神经节细胞层 一 ?? ’‘ 一: 一?、、一‘ ‘一’’ 、 “姗曼曩.遵 ???????? 卜?????. ?岬一 : 图 组免疫组化结果 .角膜组织;:视网膜组织 温州医学院碰士学位论文 曩 ??????? ???????一 :? ?‘。’‘?‘??‘。呻 ?,’??二 ,一 一 : 图 ?组免疫组化结果× .:角膜组织;:视网膜组织温??学院硕学位论文 搴‘写卑 ~’ ’一 一 一 .?一 .? 一 一 一 ?? 奄 麟 ?、 ???????一 蛳司 : : 图 ?组免疫组化结果 一.一 .:角膜组织:.:视网膜组织温州医学院砜士学位论文 “而事?“一.:翟 磊铡 碍闸 ?而一 腼 『 ,踊?啊 。:,..... .奄 : 肺: 图 ?组免疫组化结果× 角膜组织;:视网膜组织温州医学院硕士学位论文 第二部分 ..对视网膜缺血再灌注损伤的治疗作用 材料与方法 材料 .主要试剂 托吡卡胺滴眼液:江西科伦药业有限公司 .%盐酸丙美卡因滴眼液:公司 氧氟沙星滴眼液:江苏克胜药业有限公司 %羧甲基纤维素钠滴眼液:公司 水合氯醛:国药集团化学试剂公司 蛋白酶:北京中杉公司 多聚赖氨酸包被玻片:北京中杉公司 . 试剂盒:北京中杉公司 ?蛋白:第一部分实验获得, /生理盐水溶液 蛋白:第一部分实验获得,. /生理盐水溶液 .实验动物及分组 健康大鼠只温州医学院实验动物中心提供,雄性,体重 。外眼和检眼镜检查双眼屈光间质清晰,眼底无改变,饲养在明一 暗交替 光照、?的环境中,不限食水。随机分为生理盐水治疗组简称组、 治疗组简称组、?眦治疗组简称组。根据再灌注 , 的时间不同分为 , 组,每组只,每组右眼为实验眼,左眼为正常 对照眼。 .实验设备 电生理检测仪: ,德国 直接检眼镜:苏州医疗器械厂 眼科手术显微镜:苏州医疗器械厂 眼科手术器械:苏州六六医疗器械厂 图像分析系统: 方法 .动物模型的建立 大鼠腹腔注射%水合氯醛 /,行全身麻醉。温州医学院硕士学位论文 眼部滴入.%盐酸丙美卡因,行眼局部麻醉。 大鼠取俯卧位固定于台面上,用托吡卡胺滴入右眼散大瞳孔。 号头皮针与生理盐水瓶连接,并将号头皮针从右眼角膜缘刺入前房,避 免损及虹膜及晶状体,固定针头。 处,此高度在眼内 缓慢升高生理盐水瓶使液面至与实验眼垂直距离 形成 的眼内压,此压力接近大鼠的体循环收缩压 . 。造成大鼠视网膜动脉血流中断。 眼内可见球结膜苍白,直接检眼镜下可见眼底血流中断,视网膜苍白。 维持 ,而后缓慢降低盐水瓶至动物眼水平,拔出针头,可见球结膜充 血,视网膜血液重新再灌注。 实验过程中维持动物体温在?左右,并间断用氧氟沙星滴眼液点 眼维持角 膜湿润和防止感染。 .给药方法 取由第一部分获得的?和蛋白溶液用生理盐水缓冲液 稀释到同样浓度.弘/。 缺血完毕再灌注开始后及以后每隔天的早上点组滴入弘生理盐 . 水,组滴入 ,组滴入 .腿, 同时各组左眼滴入同样体积的生理盐水作为对照。 .标本的采集及处理 根据各组时间点,采用颈椎脱臼法处死动物,立即摘除眼球,以生理盐水冲 。 洗血渍,浸泡于%多聚甲醛中性缓冲液中固定 以平行于视神经矢状轴且以其为平面切除眼两侧组织,小心取出晶状体,流 。 水缓慢冲洗 梯度酒精脱水;二甲苯透明;浸蜡;石蜡包埋。 将包埋好的眼球标本,以平行于视神经矢状轴且以其为平面进行切片,厚度 约胁。 捞取切到视神经的片子,烘干过夜。 . 检测 采用视觉电生理检测仪记录闪光视网膜电图,刺激器为 全野刺激器。 记录电极为自制?薛环状角膜电极,参考电极和接地电极分别为 不锈钢 。 自制针状电极,各电极自身阻抗均小于 实验前将大鼠暗适应 ,大鼠腹腔注射水合氯醛 /,行全身麻醉。 眼部滴入.%盐酸丙美卡因,行眼局部麻醉,托吡卡胺散瞳。温州医 学院硕士学位论文 记录电极置于右眼角巩膜缘,参考电极刺入右侧颊部皮下,接地 电极置于尾 部,所有操作均在微弱的红灯下暗室内进行。 再次暗适应 后,白光闪烁刺激次,光强度 /,通频带, 。 持续 检查后用氧氟沙星点眼,防止发生暴露性角膜炎。 波波幅指波波谷至波波峰之间的垂直距离,大小以微伏肌为 单位,结果用均数?差?表示。 .旺染色 石蜡切片常规脱蜡水化:石蜡切片置于染色缸中,?二甲苯 ,二 甲 。 苯 ,%酒精 ,%酒精 ,%酒精 ,自来水 苏木素染色 ,自来水漂洗遍,盐酸酒精分化数秒钟,自来水漂洗, %氨水泛蓝,自来水漂洗。 。 %伊红染色 。%酒精脱水 ,%酒精 ,无水酒精 二甲苯透明 ,中性树胶封片,光镜观察并摄影记录。 .视网膜厚度测量及神经节细胞计数 倍镜下观察视网膜瓶染色切片,从视神经乳头两侧约岫处开始各 取个视野,每个视野每间隔姗取个点,共取个点,利用图像分 析系统测量视网膜内层厚度指视网膜内届膜到外核层和外丛状 层交界之间 的距离。 每只实验眼共个数据,取其平均值即为视网膜内层厚度。 每个视野从距视神经胁处对 内的节细胞进行计数,即每张片子 对舳内的节细胞进行计数。 . 原位凋亡检测 石蜡切片常规脱蜡水化:石蜡切片置于染色缸中,?二甲苯 ,二 甲 。 苯 ,%酒精 ,%酒精 ,%酒精 ,自来水 用溶液冲洗次,每次 ,擦干组织周围液体。将切片置于湿盒中, 在样本区域上滴加“新鲜配置的蛋白酶工作液蛋白酶工作液的配 置: 蛋白酶 。 ?水浴 。冲洗次,每次 。擦干组织周围液体,滴加 。 反应混合液于样本区域上,?水浴 冲洗次,每次 ,擦干组织周围液体。 。 滴加 溶液,?水浴 冲洗次,每次 ,擦干组织周围液体。 滴加 工作液,直到显现浅棕色背景,冲洗。 温州医学院硕士学位论文 苏木素复染 ,自来水漂洗遍,盐酸酒精分化数秒钟,自来水漂洗, %氨水泛蓝,自来水漂洗。 酒精梯度脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。 .凋亡细胞计数 倍镜下观察染色切片,从视神经乳头两侧约 处开始各取 个视野,每个视野再分别从视网膜节细胞层和内核层选取姗的区 域进行阳性细胞计数劓。 分层计算每张切片个视野的平均阳性细胞密度,以此作为每张切 片 和的阳性细胞密度,单位/。 .统计学分析 采用 .软件进行统计分析,同一时间点组间进行单因素方差分析 .为差异有显著性意义。 检测和视网膜细胞凋亡结果采用 的 统计学方 法分析。 视网膜内层厚度和神经节细胞数目变化采用 的统计学方 法分析。温州医学院硕?学位论文 结果 .检测 . 波 ?.脚、治疗组. 再灌注,治疗组 ?.脚和?治疗组.?.帅波波幅较缺血 前均明显降低,组之间无统计学差异.。再灌注,组.. , ?和组 ?.肌波幅略有降低,二者之间无明显差异 而组.?.?波幅明显升高,较组和组均有显著差异. 脚波 和.。再灌注,组..帅和组. 幅快速升高,组.? 波幅继续升高,此时组波波幅相接近 无明显差异.。见表 . 肼波 再灌注,组.?.?、组. 肌和组. ?.?波波幅较缺血前均明显降低,但组之间无统计学意义,组和 组较组波幅略高。再灌注,组.?.肘波幅基本无变化, 组.?.?波幅略有降低,组.?.肌波幅明显升高, 较组和组均有显著差异.。再灌注,组.?.脚和 组.. 波幅升高,组..脚波幅继续升高,较 组和组均有显著差异.。见表 .缺血再灌注损伤视网膜组织学变化 正常大鼠视网膜结构,可见三层细胞拔,从玻璃体腔向巩膜方向 依次为 神经节细胞层、内核层、外核层。神经节细胞层的细胞呈单层排 列,内核层和外 核层呈多层排列。视网膜神经细胞胞核较大,里圆形或椭圆型, 染色较浚,排列 整齐。内核层主要有双极细胞、水平细胞、无长突细胞及细胞的细胞核 组成,胞核较小,染色较深,厚度约为外核层的/。外核层由光感受器细胞核 组成,胞核较小,染色较深。视网膜内层厚度为视网膜内届膜到外棱层 和外丛状层交界之问的距离。见图 治疗组:再灌注后 ,视网膜组织水肿,其中以神经纤维层与内 网状层的水肿最明显,数目减少,内核层细胞排列紊乱,部分细胞固缩变 ,视网膜组织水肿已经减退,视网膜内层 形,外核层变化不明显;再灌注后 , 厚度接近正常,排列较稀疏,数目显著减少;再灌注后 数目基本不再减少,但细胞固缩变形,出现空泡。内核层细胞数目较少,外核层 变化不明显,神经纤维层明显变薄,视网膜组织萎缩。结果表明缺血再灌注模型温州学院硬?学位论文 建立成功,且生理盐水对损伤无保护作用。见图 治疗组:视网膜组织病理变化与组相似。与组相比,再 灌注后 ,视网膜厚度太于组,并有统计学差异.,数目也略 大于组,再灌注 组数目也略大于组,但均无统计学差异.。 见图、 州治疗组:视网膜病理变化与、组同期比较有以下几 个特点:?再灌注组视网膜组织水肿,厚度明显大于、组.和 ,与正常大鼠相比,数目减少,但多于、组,并只与组有统 计学差异.。?再灌注组视网膜内层厚度与、组相接近., 数目随时间的增加而减少,但均多于、组 。再灌注组 视网膜无明显萎缩现象,内层厚度大于与、组均有差异,和., 数目稍有减少,但仍多于、组.。见图、 .视网膜细胞凋亡 如图所示,正常大鼠视网膜组织未发现有棕黄色着色的阳性细 胞。治 疗组、治疗组、?治疗组,在再灌注后 、 、 的神经节细胞层和内棱层均可观察到阳性细胞。见图 .视网膜利嗡节细胞凋亡细胞数 组:再灌注后,中阳性细胞数目达到最高,到再灌注阳性细胞数 目有所减少,再灌注阳性细胞数目与相比基本不变。 组:再灌注后、、,中阳性细胞数目均差别不大。与组相比, 再灌注后阳性细胞数目明显少于组,而再灌注、与组差别不大。 组:同样在再灌注后,中阳性细胞数目最多。到再灌注阳性细胞 数目有所减少,再灌注阳性细胞数目与相比基本不变。与、组相 比, 备时间点阳性细胞数目均少于、组。再灌注后,组与、组比较均 有统 计学差异 和.,再灌注后,组与、组亦均有统计学差 异.和.。见圈 .视网膜内核层凋亡细胞数 组:再灌注后,中阳性细胞数目达到最高;到再灌注阳性细胞数 目有所减少,再灌注阳性细胞数目继续减少。 组:再灌注后、、,中阳性细胞数目的变化规律同组相似。 与组相比,再灌注后,阳性细胞数目少于组,而再灌注和阳性细 胞数目均与组差别不大。 组:在再灌注后,中阳性细胞数目虽多,到再灌注数量有所减少, 再灌注阳性细胞数与相比基本不变。与、组相比,各时间点阳性 细胞温卅医学院硕士学位论文 数目均少于,组。再灌注后,组与组之问有统计学差异.。 再灌注后,组与、组之问均有统计学差异 。见圈 表再灌注后不同时间点 波变化? .组别 缺血前 注:料表示 治疗组与船治疗组比较; 。 表示?治疗组与组比较 表再灌注后不同时间点 波变化? ,? 注:表示治疗组与治疗组比较 ; 表示 治疗组与?组比较。 图视网膜内层厚度变化 组:治疗;组:治疗;组;治疗: 表示组与组比较. ;表示组与组比较. 。 表示组与组比较.;表示组与组比较 ?表示组与组比较.;温州医学院硕?学位论文 图神经节细胞数目变化 组:治疗;组:咄治疗;组:??治疗; 表示组与组比较. ;料表示组与组比较. 表示组与组比较 ;表示组与组比较.。 圉神经节细胞层中阳性细胞数 组:治疗;组:治疗;组:?治疗; 十表示组与组比较 ;十表示组与组比较. 。 表示组与组比较 ;表示组与组比较温州医学院硕士学位论文 图内核层中阳性细胞数 组:治疗;组:治疗;组: 治疗; ;表示组与组比较. 表示组与纽比较. 表示组与组比较.。