【WORD格式论文原稿】牛蒡子水提物中牛蒡苷和牛蒡苷元在大鼠体内的代谢

【WORD格式原稿】牛蒡子水提物中牛蒡苷和牛蒡苷元在大鼠体内的代谢 免费查阅标准与论文: 牛蒡子水提物中牛蒡苷和牛蒡苷元在大鼠体内的代谢 和排泄研究 12322，张建奎 ，姜泓 ，刘丽 ，康廷国 袁媛 1. 辽宁省中医药研究院， 辽宁沈阳 (110034); 2. 辽宁中医药大学， 辽宁沈阳 (110032); 中国医科大学公共卫生学院， 辽宁沈阳 (110004)3. E-mail: yuanyuan20030330@yahoo.com.cn 摘要:目的:对牛蒡子水提物中牛蒡苷和牛蒡苷元在大鼠体内的代谢和排泄物进行了研究， 获得药物在大鼠体内的代谢和排泄情况。方法:建立一种高效液相色谱方法，同时测定了牛 蒡苷和牛蒡苷元在大鼠排泄物中的含量。结果:尿液排泄为牛蒡苷和牛蒡苷元的主要排泄途 径。结论:该方法准确、可靠。 关键词:牛蒡子;代谢;排泄 中图分类号:R282 牛蒡子为常用中药。《中华人民共和国药典》2005 年版收载为菊科植物牛蒡 Arctium [1]lappa L.的干燥成熟果实。从该药材中提取得到的化学物质主要有木脂素类成分、萜类成 [2-4]分和挥发油类成分等。查阅相关文献，尚未发现对其代谢和排泄的研究，本文建立了一 [5-6]种高效液相色谱方法，同时测定了牛蒡苷和牛蒡苷元在大鼠排泄物中的含量。 1 仪器与试药 1.1 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪;DZTW 调温电热套;XS105 电子天平;XW-80A 微型旋 涡混合仪;Anke-18C-C 高速台式离心机 1.2 试药 5所用试剂均为分析纯和色谱纯。 牛蒡苷购自中国药品生物制品检定所，批号为 819-9401;牛蒡苷元购自上海融禾医药 科技有限公司，批号为 070928 牛蒡子药材购于辽宁省中医药研究院药局，经辽宁中医药大学康廷国教授鉴定为菊科植 物牛蒡 Arctium lappa L.的干燥成熟果实。 健康昆明种大鼠，体重 400g，由沈阳医学院动物实验中心提供，合格证号:XCXK (辽)-2003-0016 2 实验方法 2.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS 柱(4.6mm×200mm，5μm);流动相:甲醇:0.5%磷酸水(48: 52);流速:0.8ml/min;检测波长:280nm;柱温:28?;进样量:20μl 2.2 灌胃样品制备 称取牛蒡子药材 78g，第一次加入 10 倍量的水回流提取 1h，第二次加入 8 倍量的水回 本课题得到教育部博士点基金课题(20060162001)的资助 -1- 免费查阅标准与论文: 流提取 1h，两次滤液合并，浓缩成 0.624g/ml 的药液(按牛蒡子药材量计算)，于 4?冰箱保存备用。 2.3 给药与样品采集 健康昆明种大鼠 3 只，给药前禁食 16 小时，自由饮水，灌胃给予牛蒡子水提物，剂量 为临床等效剂量的 16 倍，分别于 3h、6h、24h 取大鼠的尿液，于 3h、24h 取大鼠的粪便。 2.4 代谢和排泄样品的预处理 取尿液，粪便液(用生理盐水研磨)以 13900r/min 高速离心 10min，取上清液 100μl， 加入高氯酸 80μl，充分涡旋混合 3min，再以 13900r/min 高速离心 10min，取上清液，再一 次以 13900r/min 转速离心 10min，取上清液 50μl，注入高效液相色谱仪分析，色谱图。 2.5 对照品溶液制备 精密称取减压干燥至恒重的牛蒡苷对照品 1.65mg，置于 5ml 容量瓶中，加甲醇适量， 振摇使溶解，加甲醇至刻度制成浓度为 0.33mg/mL 的牛蒡苷标准溶液贮备液。 精密称取减压干燥至恒重的牛蒡苷元对照品 1.44mg，置于 10ml 容量瓶中，加甲醇适量， 振摇使溶解，加甲醇至刻度制成浓度为 0.144mg/mL 的牛蒡苷元标准溶液贮备液。 2.6 分析方法确证 方法的专属性 取大鼠空白尿、粪便匀浆液，按“组织样品的预处理”项下的方法操作，获得 空白尿、粪 便匀浆液样品色谱图 1-1(A)、(B);将一定浓度的牛蒡苷及牛蒡苷元对照品溶液加入到空白 尿、分辨匀浆液中，依同法操作，得色谱图 1-2(A)、(B);同法操作得到大鼠给药后的尿、 粪便匀浆液样品色谱图 1-3(A)、(B)。结果明，空白血清中的内源性物质和代谢物不干扰 牛蒡苷和牛蒡苷元的测定。 A B Fig.1-1 HPLC Chromatogram of blank Urine、Dung sample A:Urine;B:Dung A B Fig.1-2 HPLC Chromatogram of Arctiin and Arctigenin in Urine、Dung -2- 免费查阅标准与论文: A:Urine;B:Dung A B Fig.1-3 HPLC Chromatogram of Arctiin and Arctigenin in Urine、Dung after oral administration of drug A:Urine;B:Dung 标准曲线 取空白大鼠尿、粪便匀浆上层液，分别加入适量牛蒡苷和牛蒡苷元标准溶液，使得空白 大鼠尿匀浆液中牛蒡苷和牛蒡苷元的浓度分别为 0.032、0.054、0.070、0.081、0.090mg/ml 和 0.028、0.035、0.041、0.044、0.047mg/ml;空白大鼠粪便匀浆液中牛蒡苷和牛蒡苷元的 浓度分别为 0.032、0.054、0.070、0.081、0.090mg/ml 和 0.028、0.035、0.041、0.044、0.047mg/ml; 按“代谢和排泄样品的预处理”项下依法操作，分别以测定牛蒡苷和牛蒡苷元对浓度作线性回 归，制作牛蒡苷和牛蒡苷元尿、粪便匀浆的标准曲线。 Tab.1-1 Standard curves of Arctiin in mice Standard curves Coefficient Urine C=61584.813A+2219.818 r=0.983 Dung C=52043.623A-244.715 r=0.991 Tab.1-2 Standard curves of Arctigenin in mice Standard curves Coefficient Urine C=127185.751A-964.746 r=0.993 Dung C=87761.829A-272.858 r=0.998 方法的精密度 取空白大鼠尿、粪便匀浆上层液 80μl，向其中加入牛蒡苷和牛蒡苷元对照品标准贮备液， 制成尿中牛蒡苷和牛蒡苷元低、中、高 3 个浓度(牛蒡苷的浓度为 19.53、22.73、26.19μg/ml 和牛蒡苷元的浓度为 12.78、19.83、22.86μg/ml);制成粪便中牛蒡苷和牛蒡苷元低、中、高 3 个浓度(牛蒡苷的浓度为 19.53、34.92、48.53μg/ml 和牛蒡苷元的浓度为 12.78、19.05、 21.18μg/ml)的质量控制(QC)样品分析，每一浓度进行 5 样本分析，计算 QC 样品的测得 浓度与配制浓度对照，求得组织样品测定方法的精密度，结果均符合规定。提取回收率 取空白大鼠尿、粪便匀浆上层液 80μl，向其中加入牛蒡苷和牛蒡苷元对照品标准贮备液， 制成尿中牛蒡苷和牛蒡苷元低、中、高 3 个浓度(牛蒡苷的浓度为 19.53、22.73、26.19μg/ml 和牛蒡苷元的浓度为 12.78、19.83、22.86μg/ml);制成粪便中牛蒡苷和牛蒡苷元低、中、高 3 个浓度(牛蒡苷的浓度为 19.53、34.92、48.53μg/ml 和牛蒡苷元的浓度为 12.78、19.05、 21.18μg/ml)的质量控制(QC)样品分析，每一浓度进行 5 样本分析，进样 50μl，通过测得 -3- 免费查阅标准与论文: 的峰面积与相同浓度的标准溶液的峰面积比值计算提取回收率。经测定，牛蒡苷在尿中低、中、高 3 个浓度的提取回收率分别为 103.2%、90.5%、85.9%;牛蒡苷元在尿组织中低、中、 高 3 个浓度的提取回收率分别为 102.4%、88.1%、82.5%。同法制得牛蒡苷在粪便中低、中、 高 3 个浓度的回收率分别为 109.2%、108.3%、98.0%;牛蒡苷元在粪便中低、中、高 3 个浓 度的回收率分别为 109.2%、101.0%、97.4%。 样品稳定性 取空白大鼠尿、粪便匀浆上层液 80μl，向其中加入牛蒡苷和牛蒡苷元对照品标准贮备液， 制成尿中牛蒡苷和牛蒡苷元低、中、高 3 个浓度牛蒡苷的浓度为 19.5、22.7、26.2μg/ml 和 牛蒡苷元的浓度为 12.8、19.8、22.9μg/ml);制成粪便中牛蒡苷和牛蒡苷元低、中、高 3 个 浓度(牛蒡苷的浓度为 19.5、34.9、48.5μg/ml 和牛蒡苷元的浓度为 12.8、19.1、21.2μg/ml) 的质量控制(QC)样品分析，每一浓度进行 5 样本分析，进样 50μl，样品经处理后室温下 1h 是稳定的，在-20?冰箱中 12h 是稳定的，其 RE%分别为 3.2%、9.3%、14.1%和 2.4%、 11.6%、13.7%与 8.4%、3.3%、2.0%和 8.4%、1.0%、2.6%。 2.7 牛蒡子水提物中牛蒡苷及牛蒡苷元在大鼠体内的代谢和排泄 大鼠灌胃给予牛蒡子水提物后,不同时间点尿和粪便中牛蒡苷和牛蒡苷元的色谱图分别 见图 1-4、1-5;含量见图 1-6、1-7。 A B C Fig.1-4 Urine in different time after oral administration of drug A:3h urine;B:6h urine;C:24h urine -4- 免费查阅标准与论文: A B Fig.1-5 Dung in different time after oral administration of drug A:3h dung;B:24h dung 1500 Arctiin 1000 Concentration(μg/ml) Arctigenin 500 0 3h 6h 24h Time(h) Fig.1-6 The concentration of Arctiin and Arctigenin in urine in different time 20 Arctiin15 Arctigenin Concentration(μg/ml) 10 5 0 3h 24h Time(h) Fig.1-7 The concentration of Arctiin and Arctigenin in dung in different time 通过对尿和粪便的研究表明，牛蒡苷和牛蒡苷元在大鼠体内 24 小时基本可以代谢完全。 尿液排泄为牛蒡苷和牛蒡苷元的主要排泄途径。经给药尿液与空白尿液图谱比较，给药粪便 液与空白粪便液比较，发现牛蒡子水提物灌胃给予大鼠服用后在尿液中会生成多种其它成 分，在粪便液中也会产生几种其它成分，需进一步用液质色谱仪进行确定。 参考文献 [1] 中国药典. 一部[S].2005，58 [2] Matsumoto T，Hosono N，Yamaha H，et al. Antiproliferative AND apoptotic dffects of butyrolactone lignans from Arctium lappa on leukemic cells[J]. Planta Med，2006，72:276,278 [3] So Young Park，Seong Su Hong，Xiang Hua Han，et al. Lignans form Arctium lappa and their inhibition of LPS-induced nitric oxide Production Chem Pharm Bull，2007，55(l):150,152 [4] Liu SM，Chen KS. Isolation and purification of chlorogenic acid from Arctium lappa Petioles bypolyamide column chromatography/RP-HPLC /LC-ESI-MS[J].Pha- rm Anal，2003，23:140,143 [5] 牛蒡子苷在小鼠体内的分布状态及药代动力学研究. 时珍国医国药，2006，17(5):698-699 [6] 郑一敏，胥秀英，傅善权等.牛蒡子总木脂素代谢化学及其动态研究. 中国中药杂志，2005，30(16):1287-1288 -5- 免费查阅标准与论文: Study the Metabolism and Excretion of Arctiin and Arctigenin after Oral Administration of Water Extraction in rats 12322YUAN Yuan，ZHANG Jian-kui，JIANG Hong，LIU Li，KANG Ting-Guo 1. Liaoning Institute of TCM，Shenyang(110034); 2. Liaoning University of TCM， Shenyang(110032); . Public Health College of China Medical University，Shenyang (110004)3 Abstract Objective: To study the metabolism and excretion of Arctiin and Arctigenin after oral administration of water extraction in rats. Methods: To establish a HPLC method, in order to determining Arctiin and Arctigenin in rats. Results: The urinary excretion is the main drainage channel. Conclusion: This method is accurate and reliable. Key words: Arctium lappa;metabolism;excretion 作者简介: 袁媛，女，1980 年 6 月生人，博士，2009 年 7 月毕业于辽宁中医药大学，博士论文为 《牛蒡子质量控制方法及其水提物药代动力学和药效动力学研究》，在辽宁省中医药研究院 科研部工作，助理研究员。 -6-