多粘菌素E发酵工艺研究

多粘菌素E发酵工艺研究 20 化学与装帑 ChemicalEngineering&Equiplent 2010年第ll期 2010年l1月 多粘菌素E发酵工艺研究 赖滨霞 (古田福兴医药有限公司,福建古田352251) 摘要:本文研究了温度,溶氧,生物素,磷酸盐及PH对多粘菌素E发酵的影响.结果表明在控制 培养温度34”C,溶氧40%以上的条件下.采ffJ~l”料和自动控制PH工艺,可明显提高发酵效价,从 480000u/ml提高到650000u/ml. 关键词:多粘菌素E;发酵 多粘菌素E是由多粘类芽胞杆菌(Bacilluspolymgxa)产 生的,由多种氨基酸和脂肪酸组成的一种碱性多肽类抗生 素,对革兰氏阴性杆菌有强烈的杀菌作用.由于多粘菌素E 具有较好抗菌谱和高效,低毒,残留少的特性,可用于饲料 添加剂.促进禽畜生长和提高饲料利用率,并且可以防止饲 料在大规模生产中常出现的由大肠埃希氏菌和沙门氏菌污 染引起的疾病. 抗生素发酵水平的提高,除了依靠菌种选育外,更多情 况下是依赖于培养基和培养条件的优化.本文作者通过研究 多粘菌素E发酵培养基和培养条件,找到一条适合该菌种, 发酵水平提高25.6%的生产工艺. l材料和方法 I.I菌种,本厂保存菌种,多粘类芽孢杆菌. 1.2培养基 种子培养基(%)葡萄糖2.0,蛋白胨1.5,氯化钠O.2, 碳酸钙0.4,泡敌O.o4.发酵培养基(%)玉米淀粉8.0, 葡萄糖1.0,蛋白胨1.0,氯化钠0.1,(NH4)2SO41.0, KH2PO4O.01,碳酸钙0.4,MgSO4O.04,泡敌O.04,生 物素5ugrL. 1.3培养条件 (1)发酵摇瓶培养条件培养温度为34?,装量250mi 三角瓶25ml,,摇床220r/min,接种量2%,培养时间48小 时. (2)10L自动发酵罐培养条件:培养温度为34?,通 气l:l(vvm),搅拌转速350r/min,接种量2%,培养时 间48小时. (3)60m3发酵罐培养条件:培养温度为34”C,通气l: O.7(vvm),罐压O.03Mpa搅拌转速130r/min,接种量2%, 培养时间48小时. 1.4补料控制 采用分批补料工艺,依据发酵液中还原糖的含量和补料 糖的浓度,采用每隔4小时一次葡萄糖,控制还原糖在1.0 以上. 1.5PH控制 当发酵过程PH在低于6.0时,自动补入氨水,控制PH 在6.0左右. 1.6分析方法 (1)总糖,还原糖的测定斐林试剂法: (2)氨基氮的测定甲醛法; (3)菌丝浓度的测定取发酵液10ml于离心沉淀管中, 在3500r/min,测沉淀物在发酵液中的比例即得菌丝浓度; (4)发酵效价的测定生物效价测定法; (5)PH的测定用PH电极在线测定: (6)溶氧的测定用溶氧电极在线测定. 2结果与讨论 2.1温度对多粘菌素E发酵产量的影响 在10L发酵罐中研究了温度分别为32?,34?,36 ?对多粘菌素E发酵的影响,结果见(表1).结果表明培 养温度34?对多粘菌素E发酵最有利,其发酵效价比32? 培养提高30%,而在36?培养时,发酵效价仅提高l8%. 表1培养温度对多粘菌素E合成的影响 2.2溶氧对多粘菌素E的生物合成的影响 在IOL发酵罐中,控制通气量1:Ivvm,搅拌搅拌转 速350r/min,培养温34”C的条件下,发酵过程的溶氧变化 赖滨霞:多粘菌素E发酵工艺研究21 如图l . 臼 , \./一 \//’ \/ \/一 \/ 图1发群过程溜最(D0)的变化图. 从图l结果可知,在多粘菌素E的发酵过程中,当培 养达到l5.2O小时时,发酵液中的溶氧达到最低值,说明这 段时间中菌体生长最快,好氧速率最快.通过改变通气量, 搅拌转速控制该段时间的溶氧水平进行发酵,以研究溶氧对 多粘菌素E发酵的影响,下面是控制不同溶氧的放罐发酵 效价,结果见(表2). 从表2结果可以发现,当溶氧低于30%时,明显对生 物合成有抑制作用,溶氧越低,发酵效价越低.溶氧高于 40%时,对多粘菌素E生物合成基本没有影响,说明只需 控制溶氧40%以上即可满足菌丝生长和产物合成的需要. 5O%虽然发酵水平略高一些,但搅拌及通气量增加较多.因 此,在发酵过程中可以溶氧40%以上来确定发酵罐的通气 量和搅拌功率. 表2溶氧对多粘菌素E发酵水平的影响 2.2生物素对多粘菌索E生物合成的影响 生物素是菌体生长过程所必须的微量生长素,对发酵也 有明显的影响.在10L发酵罐中,加不同的量进行考察, 结果如表3: 表3生物素对多粘菌素E生物合成的影响 表5不同PH对多粘菌素E发酵的影响 结果发现,不加生物素效价明显比育加生物素低,而后 二者不同加量结果接近,所以按加5ug,L为较佳. 2.4磷酸盐的影响 磷酸盐是菌体生长所必须的重要元素,能促进菌丝的生 长,但磷酸盐过量能抑制次级代谢产物的合成.因此,适当 的磷酸盐对多粘菌素E发酵足有利的.在培养基中加入不 同量的磷酸二氢钾在摇瓶中进行发酵,结果见表3. 表3结果表明,磷酸盐的浓度0.001-0.02%,对多枯菌 素E的生物合成不产生影响,当浓度为0.1%时,对多粘菌 素B合成产生明显的抑制作用.此结果在l0L发酵罐已得 到验证.但在培养基中适当加入磷睃盐,可延缓菌体衰老, 自溶,减少泡沫的产生,可以改善发酵液的质量,也何利十 提取,町选择0.01o6. 2.5PH对多粘菌素E合成的影响 在10L发酵罐中,当发酵到lO小时左右,溶氧在5O %附近时,进行PH控制,通入氨水,把PH分别控制在 PH5.6,6.0,6.4,6.8,发酵结果如表5: 结果表明,PH在5.6时水甲降低,高于6.4时发酵水 }l』】显下降,发酵过程应以控制PH6.0为好. 2.6原工艺与新工艺比较及60m发酵罐工业化生产 原工艺培养温度为32?.PH控制在5.7,溶解氧没有 控制,固定搅拌转和通气量,在大型发酵罐中平均水甲一般 在480000u/ml. 目前利用以L摇瓶及l0L发酵罐的发酵试验结果,逐 渐推广在60m的发酵罐进行多枯菌素E的工业化生产,培 养温度34.5i0.5?,控制溶氧50%,中间补料并自动控制 PH在6.0,发酵生产取得很好成果:全年月平均水平在 650000u/ml以上,高出小罐水平,并且突破原来的发酵平均 生产水平480000u/ml,提高丁35.4%,取得良好的经济效益. 参考文献 【1】熊宗贵主编.发酵工艺=原理.北京:中国医药科技出版 祉,1995:79 [2】邬行彦,熊宗贵,胡章助.抗生素生产工艺学.北京: 化学工业出版杜,第一版,371 【3J储炬等发酵过程原理.北京:化学工业出版社,2004: 66.67 【4】李友荣.T业发酵谢控学.北京:化学工业出版社,2002~215 o