单侧输尿管结扎对大鼠肾间质P13K／AKT表达的影响

单侧输尿管结扎对大鼠肾间质P13K／AKT表达的影响 单侧输尿管结扎对大鼠肾间质P13K,AKT 表达的影响 2OO6年12月 第26卷第12期 基础医学与临床 Basic&ClinicalMedicine December2006 Vo1.26No.12 文章编号:1001—6325(2006)12-1345-05研Je, 单侧输尿管结扎对大鼠肾间质PI3K/AKT表达的影响 彭红霞,陈明h,张超,欧三桃,刘斌 (1.泸州医学院附属医院肾内科肾功能保护研究室,四川泸州646O00;2.赣州市人民医院肾内科,江西赣州341000) 摘要:目的探讨P~K/AKT信号通路是否参与肾间质纤维化的发病过程.方法将30只sD大鼠随机分为假手术 组,UUO模型组,模型组行左侧输尿管结扎术.术后5,10和15d分别处死各组中的5只大鼠,取左肾行HE和Masson 染色,并用免疫组化方法检测肾小管-间质中TGF-131,AKT1,磷酸化AKT1的表达.结果模型组大鼠肾小管.间质细 胞增多,肾小管基底膜增厚皱缩,纤维化明显,随时间进展而加重.不同时间的UUO模型组肾组织AKT1,磷酸化 AKT1,TGF-131表达显着高于假手术组(P<0.01);于第10天模型组AKT1表达达高峰,于第15天磷酸化AKT1, TGF-131表达达高峰;UUO大鼠肾组织第5天和第15天TGF-131的表达与AKT1活性呈正相关,第10天和第15天梗 阻肾的AKT1活性与肾小管-间质纤维化指数呈正相关(均P<0.05).结论AKT1,磷酸化AKT1在大鼠梗阻性肾病 模型肾小管-间质中表达及AKT1活性明显增加,提示PBK/AKT信号通路可能参 与肾小管.间质纤维化的过程. 关键词:PI3K/AKT信号通路;TGF.131;肾小管.间质纤维化 中图分类号:R692文献标识码:A ChangesofPI3K/AKTexpressioninrenaltubulointerstitialfibrasis ofunilateralostructionrats PENGHong—xia,CHENMingh , ZHANGChao,OUSan—tao,LIUBin (1.DepartmentofNephrology,theAff'diatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou6460OO; 2.GanzhouPeople'SHospital,Ganzhou341000,China) Abstract:ObjectiveToobservetheeffectofPI3K/AKTsignalpassagewayonrenaltubulointerstitialfibrogenesis ofUUOrats.MethodsThirtySpragueDawleyratsweredividedintotwogroups,thesham— operatedgroupandthe UUOmodelgroup.Themodelgroup'SleftureterWasdissociatedtobeobstructed.Thesham—operatedgroupwas dissociatedleftureteronlywithoutobstruction.FiveratsofeachgroupwerekiHedrespective lyat5,10,15 daysaftersurgery.HistologicalchangesofrenaltubularinterstitiumWasobservedbyHEandMassonstaining.Im. munohistochemistrywasperformedonleftrenaltubularinterstitiumforAKT1,phospho— AKT1,TGF—B1inrenal tubulointemfitumateachtimepoint.ResultsAKT1.phospho.AKT1andTGF一 131werefaintlystainedinthesham. operatedkidneys.ImmunostainingofAKT1,phospho—AKT1andTGF一 131inrenaltubulointerstitiumincreased progressivelystartingfrom5to15daysafterUUO(VSsham— operatedgroup,P<0.01).theactivityofAKT1is positivecorrel~ionwithexpressionofTGF— B1earlyandlaterafterUUO(P<0.05)andisalsopositivelycorrelated tofibrosisindexofrenaltubulointerstitiumfrom10to15daysafterUUO(P<0.05).Conclu sionAfterUUO. 收稿日期:2005—09—19修回日期:2006—05—30 基金项目:I~JII省教育厅2004.年重点资助课题(2000128,2004049) 通讯作者(correspondin~author):chenming6699@yahoo.COrn.ca 现通讯地址:江西省赣州市人民医院肾内科(341000) 1346基础医学与临床Basic&ClinicalMedicine2006.26(12) Increasingofproteinexpressionofphospho— AKT1andAKT1inrenaltubulointerstitium,andenhancingofactivity ofAKT1concernedwithTGF— IB1inducedrenaltubulointerstitialfibrosis,Thus,PDK/AKTsignalpassagewaymay playrolesinrenaltubulointerstitialfibrogenesisinunilateralureteralobstructionrats. Keywords:PDK/AKTsignalpassageway;renaltubulointerstitialfibrosis;TGF-[B1 肾小管一间质纤维化是各种肾脏疾病进展至终 末期肾衰竭的共同通路,是基质蛋白合成增加,降解 减少,单核细胞浸润以及致纤维化细胞因子表达上 调等多种因素综合作用的结果. 细胞生物学实验发现磷脂酰肌醇3激酶/蛋白 激酶B(phosphoinositide3一kinase/proteinkinaseB, PDK/PKB)被证明为反转录病毒AKT一8的癌基因 蹁码的蛋白产物,故又称为AKT信号通路,参 与了调控TGF—IB1致肾纤维化过程?,但PI3K/ AKT信号通路在在体实验中调控纤维化的作用鲜 有报道.为此,我们以单侧输尿管梗阻(unilateral ureteralubstruction,uuo)大鼠为研究对象,通过 动态观察大鼠梗阻肾组织的病理改变以及肾小管一 间质中磷酸化AKT1,AKT1,TGF—IB1的表达情况, 以探讨PDK/AKT信号通路是否参与了肾小管一间 质纤维化过程. 1材料与方法 1.1主要试剂 小鼠抗大鼠磷酸化AKT1单克隆抗体(CellSig- nalingTechnology公司),兔抗大鼠AKT1和TGF—IB1 多克隆抗体(武汉博士德公司),PowerVision.M二步 法,SP免疫组化检测试剂盒(北京中山生物公司). 1.2动物分组及模型复制 SD大鼠30只,6—8周龄,体重130—160g(泸 州医学院动物实验中心提供),适应性饲养1周后 随机分为假手术组和模型组,每组15只.参照文 献对模型组大鼠行左侧输尿管完全梗阻术,假 手术组仅游离输尿管但不结扎.于术后5,10和 15d每组各处死5只大鼠,取左肾,常规固定,制片, 染色. 1.3病理学检查 左肾组织常规做HE,Masson染色.4OO倍光镜 下,随机选择10个不含肾小球的视野,观察肾小管一 间质的病理变化.肾小管一间质病变由3个参数判 定:?肾小管上皮细胞水肿,变性,坏死,小管扩张; ?炎细胞浸润;?小管间质纤维化程度.每个参 数按0—3分评定:0,正常;1分,轻度受损,病变范 围<15%;2分,中度受损,病变范围15%一50%;3 分,重度受损,病变范围I>50%. 1.4免疫组化检测AKT1,磷酸化AKT1,TGF-阻 表达 采用SP法检测肾组织中的磷酸化AKT1,Pow— erVisionTM-步法检测肾组织中的AKT1和TGF—IB1. 石蜡切片经常规脱蜡,水化,3%HO灭活内源 性过氧化酶,高压煮沸法进行修复抗原,血清封闭 后依次加入相应的一抗(AKT11:100,磷酸化 AKT11:50,TGF—IB11:50),二抗及辣根过氧化酶 标记的链霉卵白素(即SP复合物,P0werVision瑚 二步法没有此步骤).DAB显色,苏木精复染.在 高倍镜(×400)下,每例切片随机选20个不含 肾小球和肾血管的肾小管一间质视野,AKT1和磷酸 化AKT1以细胞质及(或)胞核内出现棕褐色颗粒 为阳性信号,TGF—IB1以细胞质内出现棕褐色颗粒 为阳性信号,计数每个视野阳性及总的肾小管细胞 数,折算成每200个总肾小管细胞数中的阳性细胞 数.阳性细胞染色程度按0—3分记算:0分,正 常;1分,浅棕黄色;3分,深褐色;介于二者之 间为2分;根据阳性细胞数及阳性细胞染色程度的 两个参数之积半定量AKT1,磷酸化AKT1和 TGF—IB1阳性表达程度. 1.5统计学分析 计数资料以?s表示,采用SPSS11.5统计软 件,进行单因素方差分析(ANOVA),组间比较采用 LSD方差分析;相关性分析采用pearson法. 2结果 2.1大鼠肾小管一间质病理学改变 HE和Masson染色结果显示,假手术组大鼠第 5,10和15天肾脏无病理改变.UUO组术后5d可 见梗阻肾小管扩张明显,上皮细胞空泡变性,肾间 质水肿,炎症细胞浸润,但间质纤维化不明显;第 陬n.jsi,sCliniIMeII…inI347 l()凡f墟内变加最可阿小营l啦细胞坏北 塌iIf匝越细咆搔.川I匝nJ』t噌 ,兀]匝纤维:fLixJl:铺J5nSl-的肾小管菱 端埘陷词J最针为___羟疗细眦摧较Ej,『硝 碱,p(丧1阿I) 表I实验大鼠肾小管一间质病理学改变评分 Table1llieI)athemaleloglealcha.ge~enal tuJ'ulmnIIIIUu皿inexperimenlalra" (r?n=51 ?0I?"1'Jitll—ha.i00'utp~I…I1tljLJLm5 2.2大鼠肾小管-间质AKTI,磷酸化AKT1,TGF. Bl的表达变化 手术_【几融小.J卸1胞均可b,L^KII磷 醺化KIIpi制表』,忤小球城无表丛 【IO术Jr,肾慢髓皿I'll4fl阿小营匀^K磷 酸化^KIII'Gb—pl丧丝,j{1}随小符掘fjJ范 r日们增加f肾纤缔f~i1<2菔呈f址斗『.岜辨Iit,ll 求R旃5足r世.抒【纵AKTI,晰舵化%KIITGF.13I 盎选均州if,增加P<()0i)(最2_刳2,4) 五3肾组织AICFI活性测定 fI磷腋化AKIIiq^I'IlI;f~ft;AKI1 钻粜小.在f}!J手幅lf微弱均ArI衍I+k-ll『】组 辑走H州第一-"7-哥螗.箭Io无F障.苇15天Il1规 帮二个高峰.日m岛t1]JcP<0c】I){盘3】 囝I实验j=鼠肾组织学碹变 FiglHL~tlipitthalogicch~gcsofkidney日0ff"h…fttruo J.洲(Il1):II,LLl】r_{ke15I】._lFj:I…l.nrl{?I) .fItli_】nf15I.Mn 表2实验大鼠肾小管-间质中AKrI,磷酸化AKI T2Theexpric?ofAK3I.phnsphu-AKTI.I'1;I?.IUilure?I h,…ul啪_n…lg(.n:5 ,"IGF-Ill的动态表达 tuliuloinler~tltiuln?eXli~Finlenlalra :兰.兰!!兰三?竺:!'? <0(11IImlll",irhIm,(0I)5?-I?}i…I !—— I —l?—— s —— 二—l?,—0zll10,i7?44…82}6185 :1)—i1??ll'" 竖兰兰l_生f…7…117?.?? 348挂删j巨#‰床r;…&(;iil…alMine200626fl2 表3实验大鼠肾小管-间质中AKrl活性 Ful}IL'3,KTIactivityin…altubtflointer~titium ofexperimentalrm{r?.n=5) l1(1_-i]11liftr{ilI1,__?…【1?……【{hi,IInfIfl-J 2.4AKT1活一眭与TGF—Bl的表达及肾小管-问质 纤维化指数的关系 在?-f1蛔求5可^K1PI=的第一卜 l白峰第10IH1删rGI"-l岫1岛第15 H』胤AKIIt=的铘向峰II5l5戈 ?B】的ikJ^KI'活'l.If.fH疋{i=63. P((1(/5fI64,<f)随蒋枉…f川M柏 l乇,AKI1一增JJll,忏小钎0IJ胚纤fli化川『雨. _l鹕10f?15几阻帕^KllI.小管一 间质纤维化指数II荚(-_062./<005) 3讨论 既往多从胞田于'细胞水下研究好小管-问 2006.26(12)基础医学与临床Basic&ClinicalMedicine1349 质纤维化的发病机制,然而细胞外信号必须通过细 胞内信号的改变才能发挥作用.PI3K/AKT是细胞 内重要的信号转导系统,目前对肾小管一间质纤维化 信号转导的研究表明,PI3K/AKT信号通路参与了 单核/巨噬细胞系的浸润,增生,细胞因子的表达和 活化等肾小管一间质纤维化过程.TGF一13是组织硬 化纤维化过程中公认的最强烈的促纤维化因 子.Runyan等…研究发现,在TGF一131作用于 肾小球系膜细胞5rain后可见AKT磷酸化且聚集于 胞膜上,给予PI3K抑制剂LY294002或AKT显性失 活突变体可减少TGF一13诱导的I型胶原(d1,) 表达.另有研究发现,PI3K/AKT信号通路也参与 了TGF一131对间充质细胞和成纤维细胞的促生存作 用,从而引起细胞间基质蛋白分泌增加J.由此表 明活化的PI3K/AKT参与了TGF一13的致纤维化作 用.但是,PI3K/AKT信号通路是否与梗阻肾模型 的肾间质纤维化有关,尚未见报道. 本实验中观察到,在假手术组肾小管一间质中 AKT1,磷酸化AKT1表达微弱;而在UUO组AKT1, 磷酸化AKT1均有高水平的表达,AKT1活性明显增 加,第1O天和第15天梗阻肾的AKT1活性与肾小 管一间质纤维化指数呈正相关.提示AKT信号通路 可能参与了UUO模型的肾间质纤维化发病过程. 参考文献: [1]BunyanCE,SchnaperHW,PonceletAC.Thephosphati. dylinositol3-kinase/AktpathwayenhancesSmad3?-stimula?- tedmesangialcellcollagenIexpressioninresponseto transforminggrowthfactor?betal[J].JBiolChem,2004, 279(4),2632—2639. [2]薛痕,樊均明,陈亮,等.大鼠肾间质纤维化动物模型的 实验研究[J].四川动物,2004,23(1):16—20. [3]安会江,朝克,商战平,等.实验性单侧输尿管梗阻的肾 脏形态学变化[J].基础医学与临床,1999,19(3):61— 64. [4]陶立坚,孙剑,金鸥,等.p27在单侧输尿管结扎大鼠肾小 管-问质纤维化模型中的表达[J].中南大学(医学 版),2004,29(1):58—60. [5]祝葆华,陈孝文,唐德棠,等.c-myc与Bcl-2在大鼠抗 Thy1.1系膜增生性肾炎肾小球内的表达[J].现代中西 医结合杂志,2001,10(6):1520—1522. 另外,本结果还提示梗阻肾磷酸化AKT1在肾小管 上皮细胞表达明显增加,而肾小球和间质细胞只见 微弱表达,与TGF一131的表达部位一致.梗阻肾肾 小管一间质中AKT1活性呈现双峰现象,AKT1的早 期活性的高低与TGF一131的表达量正相关;高表达 的TGF一131与AKT1的后期活性亦明显正相关.提 示在UUO组的发病过程中,AKT1的早期活性增加 可能介导了肾组织TGF一131的表达,参与了术后第 1O天的TGF一131高峰形成,而高表达的TGF一131又 可能是晚期AKT1持续活化的重要影响因素.由此 提示,PI3K/AKT信号通路可能通过加强TGF一13的 致纤维化作用而促进肾小管一间质纤维化的形成. TGF一131在肾小管间质纤维化过程中起着重要 作用,体内短期消除TGF一131活性能减轻动物模型 的肾小管间质纤维化,但是TGF—p1除了有促纤维 化效应外,还有抗增生和抗炎症的效应,例如 I基因敲除小鼠因完全阻断TGF一131的活性 而产生致死性炎症.本实验结果显示,PI3K/AKT 可能为TGF一131系统下游的信号介质,通过加强 TGF一13的致纤维化作用而促进肾小管一间质纤维化 的形成.抑制PI3K/AKT信号通路可望成为阻止或 延缓肾纤维化的一条较好途径. [6]杨敏,黄海长,李惊子,等.结缔组织生长因子增加 TGFB活化成肌纤维细胞的作用[J].基础医学与临床, 2005,25(1):25—29. [7]李明月,刘立忠,黄尚志,等.肝细胞生长因子抑制 MRC-5成纤维细胞所致的纤维化作用[J].基础医学与 临床,2002,22(5):422—427. [8]HorowitzJC,LeeDY,WaghrayM,eta/.Activationofthe pro-survivalphosphatidylinositol3-kinase/Aktpathwayby transforminggrowthfactor-betalinmesenchymalcellsis mediatedbyP38MAPK-dependentinductionofanauto- crinegrowthfactor[J].JBiolChem,2004,279(2),1359 — 1367. [9]WangWansheng,HuangXR,LiAG,eta1.SignMingmeeh. anismofTGF-betalinpreventionofrenalinflammation: roleofSmad7[J].JAmSocNephrol,2005,16(5):1371 — 1383.