淋球菌染色体mtrR基因突变对淋球菌多重耐药性的影响.docx.doc

淋球菌染色体mtrR基因突变对淋球菌多重耐药性的影响.docx.doc 淋球菌染色体mtrR基因突淋球菌多重耐性的影响变变变变变变变变变变变变变 淋球菌染色体mtrR基因突淋球菌多重耐性的影响变变变变变变变变变变变变变 中皮科志变变变变变变 1999年第3期第32卷著 变 作者:潘　廖万清　李志变变变变变变变变变变 变位:200003上海,第二医大学征医院皮科变变变变变变变变变变变 变变变:奈瑟氏球菌,淋病基因,mtrR微生物敏感性变变 【摘要】目的　淋球菌的染色体耐机理行了一定的探索。方法　聚合反及变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变Sanger双脱氧变变 止法,定淋球菌变变变变变mtrR基因的碱基序列,并做相淋球菌的敏。果　具有青霉变变变变变变变变变变变变变变变变变 素耐性的淋球菌毫无例外都有变变变变变变变变变变变变mtrR基因的碱基突,而耐壮霉素的淋球菌在变变变变变变变变变变变变变变变变变mtrR基因上有两个位 点突。　淋球菌染色体上变变变变变变变变变变变变mtrR基因的突会引起淋球菌多重耐性的生,变变变变变变变变变变变变变变变变 增加淋球菌脂溶性胞毒因子如脂溶性抗生素、去脂肪酸的抗性。变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变 Effect of mtrR Gene Mutation on Multiple Antibiotic Resistance of Neisseria GonorrhoeaePAN Weihua, LIAO Wanqing, LI Zhigang. Department of Dermatology, Changzheng Hospital, Shanghai 200003【Abstract】 Objective To investigate the mechanism of multiple antibiotic resistance of Neisseria gonorrhoeae chromosome.Methods The mtrR gene sequence of Neisseria gonorrhoeae was examined by polymerase chain reaction and Sanger′ s method, the drug susceptibility testing of relevant strains was done.Results Among 37 stains resistant to penicillin, 21 were resistant to tetracycline, erythromycin and Triton X? 100 simultaneouely; one of them was resistant to spectinomycin as well; 5 strains were resistant to erythromycin only. All penicillin? resistant strains had a single base mutation in mtrR gene, and spectinomycin? resistant strain mutated in two position of mtrR gene.Conclusion The missense and null mutations in the mtrR gene of Neisseria gonorrhoeae resulted in the emergence of multiple antibiotic resistance. 【Key words】 Neisseria gonorrhoeae genes,mtrR Microbial sensitivity tests 淋球菌生耐性的主要原因,是其胞膜外蛋白即变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变mtrCDE蛋白合物合成量的增多,变变变变变变变变变变 变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变致抗淋球菌胞毒因子被排出胞外。除由粒介生β?内胺外,淋球菌主要由变变变变变变变变变变变 染色体控制通膜蛋白机制及膜通透性改生耐性,变变变变变变变变变变变变变变变变变变变mtrR基因控制着mtrCDE蛋白的合成,因此我变 从mtrR基因着手研究mtrCDE蛋白合成量增多的原因。 材料和方法 一、菌株 WHO变准株A、B、C、D、E株及床分离株共变变变变变变46株。准株由上海市性病防治中心变变变变变变变变变变变变变 及中国和医科大学皮病研究所送,床株由我院患者及上海市性病防治中心患者变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变1992, 1993分离所得。均用片酸度定量法定变变变变变变变变变变PPNG变性菌株。 二、主要变变 变变变变变变变变序盒自美国Promega公司,TaqDNA聚合由旦大学所提供,同位素变变变变变变变变变变变变变变变γ32P,ATP变变自北京 变变变变变生物工程公司,丙胺和NN′,甲双丙胺自美国变变变变变变变变变变变Sigma公司,低熔点胶自变变Sigma公司。 三、主要器和变变变变变 网址,www.jxdyf.com 第 1 页～共 3 页 0.2mm10跑道泳板及高泳自美国变变变变变变变变变变变变变Bio?RAD公司,480型及9600型DNA变变变变变变增自美国P?E公司。 四、方法 1.变变变变变变变变变变变变变变变变变变变敏用淋球菌快速定量敏法。另配200,6400μg/mL各度梯度的变变变变变TritonX?100溶液,分变变TritonX?100变各菌株的MIC变变变变变变。保存果待用。 2.mtrR基因增所用引物参照变变变变变变变变Wubin等的序列变变变变变,由本校生化教研室合成。上游引物:变变5′?dATACATACACGATTGCACGG?3′,下游引物变5′?TTTGTGTCATTTTGATGCCG?3′。使用引物期变变变变变变变增物变变变630bP。反体变变变变变200μL,反体系变变变pH变8.0,引物各0.25μmol/L;1UTaqDNA聚合变;模板5μL。反变条件变93?变变性3min,93?变性30s,62?退火60s,共35个循变,72?延伸5min变束。(以TBE作整个变变变变变变变变的冲液)。 3.DNA序列的变变:DNA变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变增物化后,按盒明引物及行序反。序反体22μL,反变变变条件:94?变性20s;60?退火30s;70?延伸40s;共30个循。反止后变变变变变变变变变变变变变管中加入止液每3μL。凝胶灌制完待干后各跑道的变变变变变变变变4个梳孔内按变变变变A、C、G、T变变变变序分加入3μL变变变增物,接高泳行泳。变变变变变变变变变变变持2000,2300V,温度50?,功率120W,每变变泳2h左右,上、下游各跑2变变变变变变变变泳。泳束后用0.3mmWhatman变变将凝胶取下,取Saran包装膜放于胶上,根据膜胶同位素含量放入XRC,?型X射变暗匣放射自影变变24,72h变片。 变1正常mtrR序列(1)箭变变变45号氨基酸GGC 变2正常mtrR序列(2)箭变变变105号氨基酸CAC 变3箭变变变45号氨基酸突点变变GGC?GAC 变4箭变变变105号氨基酸突点变变CAC?UAC 变果 46株淋球菌得变变MIC,TritonX?100变各菌株的MIC变:25株菌MIC?3200μg/mL,21株菌MIC?6400μg/mL。46株淋球菌均行了变变变mtrR基因的序列,准株的变变变变变变变mtrR基因序列变变1,2。敏变变变得其中有37株淋球菌青霉素耐变变变变变变(MIC?1μg/mL),变37株菌中有21株同耐四素变变变变变(MIC?1μg/mL)、霉素变变变(MIC?1μg/mL)及TritonX?100(MIC?6400μg/mL),37株中有5株淋球菌耐霉素。有变变变变变变变1株淋球菌在耐青霉素、霉素、四素、变变变变变变变变TritonX?100的同变变变变变变变变变尚壮霉素耐(MIC?64μg/mL),所有菌株均三敏变变变变变变感。 全部37株耐淋球菌均有变变变变变变变变mtrR基因的突,第变变变45号氨基酸由甘氨酸突成了变变变变变变变变天冬氨酸(GGC?GAC),变变3,有壮霉素耐性的变变变变变变变变变变变变变变那株菌除了有第45号氨基酸的突外变变,变有第105号氨基酸的突,变由变变变变变变变变变变氨酸突成了酪氨酸(CAC?UAC),变变4。两突均碱基突,整个变变变变变变变变变变变变变mtrR基因的其它位点定。变变9株敏感菌无mtrR基因的突。变变 变变 淋球菌生多重耐性的基本原因变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变之一,就是菌能把物有效地排出胞外,而外排程是由胞膜上脂蛋白在变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变ATP变变变变变变变变变变变变变催化下通外作用完成的。脂蛋白的多变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变达与床菌耐直接有,其基因即mtr基因系。淋球菌变变变变变变变变变变变变能抗便中的脂及变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变胆的毒性而生存于特定的粘膜表面,就是因其基因中有mtr系变 (multipletransterableresistancesystem)的存在。mtr基因系由变变mtrR基因和mtrCDE基因成变变,mtrR基因控制mtrCDE的表达。mtrR变变1个含210个氨基酸的蛋白,蛋白作变变变变变变变变变变变变变阻遏物合于mtrRCDE基因上而影响它的。变变变mtrCDE基因位于mtrR基因的下游,其的蛋白存在变变变变变变变变变变变变变变变于淋球菌的胞膜上,蛋白合物变变变变变变变变能在ATP变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变作用下通外机制把物出胞外,其合成量的增减直接决定了淋球菌的耐程度。由变变变变变变于mtrR基因变变变变变变变变阻遏蛋白,如果mtrR基因有突,将会变变变变变致阻遏蛋白阻遏作用减少或消失,使mtrR基因下游的mtrCDE基因变变变变放,变胞膜脂蛋白中表达受其控制的mtrCDE蛋白合物变变变变变变变变变变变表达增多。多的mtrCDE蛋白使外系功变变变变变变变强能增,变胞膜通透性降低,并增加多变变变抗菌因子的抵抗力。 本了淋球菌的变变变变变变变变变mtrR基因的DNA序列,将其果变变变变变变变变变变变变变变变与菌脂溶性因子包括脂溶性抗生素、去脂肪酸变变变变变变(TritonX,100)的敏感性行照,变变变变变变变变变变变变变变变变找国内淋球菌生染色体耐的主要原因。本的变变变变变变变变变变变46株菌株都有性,变变变变变变变变变变它中的70,来源于变变变变变变变变变变床患者,曾用青霉素、淋必治、强力霉素等。,在变变变变变变变变β,内胺性的淋球菌菌株中,具变变变变变变变变变变变变变变有青霉素耐性的菌株毫无例外都有变变变变变变变变变变变mtrR基因的变变变变异。在mtrR基因的变变变210个氨基酸中,第45号氨基酸由甘氨酸突成了变变变变变变变变天冬氨酸(GGC?GAC)是造成淋球菌青霉素、霉素、四素及去脂肪酸变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变TritonX?100抗性增高的主要原因。9株物敏感菌无变变变变变变mtrR基因的突,由变变变变变变变变变变变变于本本小,不能得出敏感菌都无mtrR基因突的,变变变变变变变变变变变变变变变变但在一定程度上我mtrR基因的突变变变变变变变与淋球菌多重耐性变变变变变变变密切相。mtrR基因突会致耐变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变但并不一定出多重耐,因37株耐株中有变变变变10株青变变变霉素耐。变变 唯一1株壮霉素耐的淋球菌除了有第变变变变变变变变变变变变变变变45号氨基酸的碱基突外,有第变变变变变变变变变变105号氨基酸的突,变变由变变变变变变变变变变氨酸突成了酪氨酸(CAC?UAC),因此第105号氨基酸的突变变变变可能使mtrR蛋白变mtrCDE基因的变变阻遏作用更小,淋球菌的耐性一变变变变变变变增。步强mtrR基因的变变变变变变变些点突致mtrCDE基因的变变变变变变阻遏放,mtrCDE蛋白表达量增多,淋球菌胞膜外蛋白作用增变变变变变变变变变变变变变变变变变,使抗生素等胞毒强 性因子在胞内度变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变降低,是淋球菌生多重耐性的主要原因。mtr系即多耐系控制变变变变变变变变变变变着淋球菌脂溶性因子的敏感性,通变变变变变变变变变变变变变mtrCDE蛋白合物变变变变变变变变变变变变变变变变形成的外系,拮抗那些变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变淋球菌胞膜表面的构各异的抗生素、脂肪酸和胆。 参考文献 1 Wubin P,Brian GS.Regulation of the permeability of the gonococcal cell envelope by the mtr system.Mol Microbiol, 1994,11:769, 775. 2 潘,廖万清,李志变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变变,淋球菌快速定量敏法的建立,第二医大学学,1998,19:387,388. 3 Judd RC,Strange JC,Pettit RK.Identification and characterization of a conserved outer? membrane of Neisseria gonorrhoeae.Mol Microbiol,1991,5:1091, 1096. 4 Alexander AN,Vladimir EB,Lan BC.Efflux? mediated multidrug resistance in bacillus subtilis:similarities and dissimilarities with the mammalian system.Biochemistry, 1991,88:4781, 4785. 5 Kayla EH,Wubin P,Brianb G,et al.Resistance of Neisseria gonorrhoeae to antimicrobial hydrophobic agents is modulated by the mtrRCDE efflux system.Microbiol, 1995,141:611, 622. (收稿:1998,06,29修回:1998,11,09) 网址,www.jxdyf.com 第 3 页～共 3 页