一氧化氮与细胞凋亡研究进展

一氧化氮与细胞凋亡研究进展 摘要:一氧化氮作为细胞内生物信使或细胞毒性分子，对不同细胞的调亡 影响不同。一氧化氮以氧化应激、损伤DNA和增强达P53、损害线粒体 和能量代谢、抑制NF-κB、激活Caspase家族酶系而促使细胞调亡;另一方 面，一氧化氮以上调细胞内CGMP浓度、诱生保护性应激蛋白、抑制细胞 色素C的释放、影响NF-κB和BCL-2而抑制细胞调亡。阐述一氧化氮启动 细胞调亡和抑制细胞调亡的复杂机制。 关键词:一氧化氮 调亡 机制 ADVANCE IN NITRIC OXIDE AND CELL APOPTOSIS ABSTRACT:As a messenger or toxic effector molecule，NO has different effects on apoptosis of different cells。NO induces apoptosis by oxidative stress; damageing DNA and increasing protein P53;injuring mitochondrion and metabolism;surpressing NF-κappaB;activating caspase activity。On the other hand，NO inhibits apoptosis by upgrating CGMP;inducing cytoprotective stress protrins;inhibiting cytochrome C release;effecting on NF-κappaB and BCL-2; et al。This review focuses on the complex molecular mechanism of NO triggering and inhibiting apoptosis。 KEY WORDS:nitric oxide apoptosis mechanism 一氧化氮(NO)是作为一种内源性的血管舒张因子，由血管内皮细胞 释放，具有凋节血管张力的作用而被发现的。然而，至目前为止已了解到 一氧化氮在许多生理和病理过程中，发挥着重要的作用。这种泛肽信号分子调节多种细胞的凋亡。细胞是否进行凋亡取决于促凋亡因子和抗凋亡因子之间的平衡与否，大量研究显示一氧化氮具有促进细胞凋亡和抗细胞凋亡的双重特性，其促进凋亡和抗凋亡的作用很大程度上依赖于量的多少和所作用的细胞。在哺乳动物细胞内，NO作为一种细胞内生物信使或细胞毒性效应分子介导细胞凋亡，依其浓度和细胞内氧化还原状态启动细胞凋亡或细胞生存信号。有学者提出，来源于具有组织活性的内皮和神经元型一氧化氮合酶的NO，通常对组织细胞产生一种生理性的保护作用，而来源于诱导型一氧化氮合酶的高剂量的NO ，更似乎促进细胞的死亡，参与机体的病理生理过程。 机体内三种一氧化氮合酶，即eNOS、nNOS、与iNOS均能催化L-精氨酸末胍基氮氧化生成一氧化氮。人体编码nNOS、iNOS和eNOS的基因分别称为NOS1、NOS2和NOS3，相应定位于12、17和7号染色体，过去一直主为eNOS、nNOS是结构性酶，现在认识到eNOS、nNOS也可诱导性表达，而iNOS在多种类型细胞的生理条件下，也可作为结构性酶存在。由eNOS、nNOS和iNOS催化合成短暂的小量NO，在许多生理性自稳态过程中发挥作用，如传递神经递质信息、调节血压、聚集血小板、血红蛋白的亚硝基化等作用;相反，在酯多糖或细胞因子、氧化应激作用下，多种细胞内的iNOS催化合成持续大量的NO，高水平的NO与感染、炎性和自身免疫过程有关，对机体有利或者有害。 在与一氧化氮有关的细胞凋亡的研究中，各种不同的经典NO供体被 使用，依据其合成来源和释放NO的代谢过程而划分为许多NO供体类型。目前大量使用的诸如snp、azide和hydroxylamine都是通过复杂的代谢过程而产生细胞内NO，azide和hydroxylamine产生NO是钙依赖型，而胞膜结合蛋白则是snp产生NO的途径。其它类型的NO供体如S-nitrosothiols能 +自发地在胞内和胞外产生NO。但无论何种NO供体产生的NO，都能使NO转换成自由基，从而减少蛋白内的半胱氨酸和巯基，以修饰酶的活性，这可能构成了NO对细胞产生作用的一个重要因素。大量的diazeniumdiolaters 被研究者所利用，如spermine(SPER/NO)、diethylamine(DEA/NO)和diethylenetriamine(DETA/NO)等，各种物质依赖其与亲合体结合的性质而具备不同的NO释放率。虽然没有严格意义上的NO供体，sydronimines仍然广泛地在与NO有关的研究中使用。这些化合物，如SIN-1能产生同等量 2---的NO和O，它们能快速地形成ONOO，故也称为ONOO供体。至于Oxatriazle-5-Imin产生的GEA3162在结构上和Molsidomine非常相似，为 -SIN-1的前体物质。有关GEA3162产生的是ONOO还是NO，目前还不是很明确的问题。 本综述旨在阐述目前我们对NO介导细胞凋亡机制的认识，着重阐述NO在细胞凋亡和抗凋亡过程中潜在的分子机制和调节机制。至于NO的生化特性，各种不同的NO供体的理化特性，不作具体陈述。由于NO作用于不同细胞的调节机制之间本身存在许多异同点，故本文只从总体上作一概括性总述。 1、 一氧化氮促进细胞凋亡的分子机制 自从L-arginine-NOx通路在巨噬细胞的凋亡中被证实后，NO介导的细胞毒性的重要性开始得到广泛认可。Albina等首先证实了NO具有诱导细胞凋亡的能力，自那以后，多种细胞被证明能在NO或过氧化亚硝酸盐的作用下发生凋亡，主要有细胞包括巨噬细胞、胰岛细胞、胸腺细胞和特定的神经元细胞等，大体的凋亡机制有如下几种: 1、1 氧化应激 氧化应激是T细胞发生凋亡的重要因素。细胞内氧化和抗氧化之间的平衡与否决定细胞的生存或死亡，氧化应激是细胞损害的因素之一。NO 2--与O作用生成O，HO及NO与O形成过氧化亚硝酸阴离子ONOO，2222 -ONOO被认为是促进细胞凋亡的介质之一。高浓度的NO与中性粒细胞 产 2--生的大量的O迅速结合形成ONOO，相类似于 SIN-1化合物产生的 --ONOO，能促发中性粒细胞的凋亡，单核细胞在ONOO的作用下也加速发 -生凋亡，其主要机制是ONOO作用于线粒体，破坏线粒体结构的完整性，诱导线粒体膜通道开放，致使线粒体去极化和肿胀，释放内容物。线粒体 -膜通道的开放可释放出细胞色素C，引起Caspase的激活。ONOO还被证实可以可逆或不可逆地抑制一些线粒体呼吸链的中间反应，从而促使线粒体肿胀、去极化、钙释放和渗透性改变。 1、2 NO损伤DNA，增强表达P53，导致细胞抑制或凋亡 - NO与过氧化亚硝酸根离子(ONOO)可引起DNA分子中单链断裂，导致核结合蛋白多聚聚合酶(Poly“ADP-Ribose-Polyrnerase、PARP)激活，PARP是与DNA喊基切除修复的关键酶，激活的PARP所催化的反 +应消耗NAD，使糖氧化分解、电子传递、ATP形成的反应减慢，细胞内 -ATP的生成减少，DNA修复失败，引起DNA的片段化。NO和ONOO除了能直接损伤DNA外，还可上调肿瘤抑制蛋白P53，实验显示在NO处理的巨噬细胞，其P53肿瘤抑制蛋白明显增加，可能是导致巨噬细胞凋亡的因素之一。P53肿瘤抑制蛋白的作用机制为上调促凋亡蛋白BAX和细胞周期素依赖性蛋白激酶P21，使损伤细胞停止于G1期，促使其凋亡以及下调抗凋亡蛋白BCL-2，BCL-2基因是细胞凋亡的重要抑制基因，过高表达可防止或降低各种刺激如射线、自由基、化疗药物、细胞因子等引起的细胞凋亡，BCL-2能通过抑制活性氧自由基对脂质过氧化作用而发挥其抗凋亡之活性。 1、3 NO作用于线粒体和能量代谢 Albinaetal等认为，就如低血糖和糖酵解过程受抑及TCA循环受抑一样，能量代谢受抑是细胞凋亡的一个潜在因素。NO作用于线粒体是其促进细胞死亡的主要方式，扩散进入线粒体内的NO以及线粒体本身合成的NO参与机体的能量代谢，降低ATP的生成和促进ATP的消耗，最终导致能量枯竭而死亡。有学者认为NO抑制线粒体的呼吸是通过两个不同的途径:低剂量的NO能可逆性地抑制细胞色素氧化酶，而高剂量的NO则交替性地抑制呼吸链中的复合物，可逆性地抑制复合物?，不可逆性地抑制复合物?，但这种说法尚有争议。我们知道，NO对线粒体呼吸的抑制可增强 -其本身的反应性氧自由基的产生，而活性氧自由基又可形成ONOO，产生 -ONOO所介导的细胞凋亡路途径。总的说来，NO对线粒体的影响有如下方 -面:?NO可逆性地使酸激酶的巯基亚硝基化，ONOO能不可逆地氧化其巯基导致CK失活，干扰线粒体内高能磷酸键的转移，影响ATP的生成;? NO能同细胞色素氧化酶可逆结合，抑制电子传递，促使线粒体钙释放，能通 -过与细胞色素氧化酶竞争性结合而抑制酶的活性;? ONOO能抑制三羧酸循环中的关键酶?，同时抑制线粒体电子传递链中的NADH-泛醌还原酶和琥珀酸-泛醌还原酶，阻止ATP的生成;? NO使3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GADPH)亚硝基化，抑制糖酵解，阻断细胞内能量的生成导致细胞死亡。 1、4 NO抑制NF-κB的活化而促进凋亡 NF-κB与各种基因的转录调控、炎症反应、免疫反应、细胞增生、转化和凋亡相关，它具有抗凋亡的活性。正常情况下，在大多数细胞中NF-κB与抑制性蛋白(IκB)结合成复合物位于胞质中，IκB可被磷酸化，再经泛素化修饰后被蛋白酶降解，使NF-κB从复合物中释放出来，进入胞核，与特定基因的κB序列结合，启动相关基因的转录。有关实验表明，高浓度的NO能抑制巨噬细胞株和人类巨噬细胞、单核细胞及中性粒细胞的NF-κB的活性，在离体的NF-KB蛋白及人体呼吸道细胞的研究中，NO可通过S-亚硝基化转录因子的P50亚单位而抑制NF-KB的DNA;在血管平滑肌细胞的研究中，NO抑制NF-KB的活性是CGMP非依赖性的，通过1-κB的磷酸化和蛋白酶体的降解而实现的。Glockzin等证实了NO对巨噬细胞中的蛋白酶体有抑制作用，诸如此类的抑制作用可下调转录因子控制下的生存因子BCL-2家族成员的表达;在神经细胞凋亡的研究中，已证实外源性的NO能下凋BCL-2的表达，上调促凋亡蛋白BAX的表达而致细胞凋亡;Jones DR 等发现在非小细胞肺癌中，NO抑制NF-KB的活性而导致癌细胞凋亡是与增加了线粒体通透性所致的细胞色素C的释放和后序的CASPASE激活;PIANTADOSICA则证明低剂量的NO供体(GEA3162、SNAP、SIN-1，1-20UM)，对线粒体的膜通透性转换孔几乎没有影响，而高剂量的NO(20-100UM)则使线粒体膜通透性转换孔开放增强，释放细胞凋亡诱导因子，如凋亡蛋白活化因子-1(APAT-1)和细胞色素C。以上证据表明，NO介导细胞凋亡的机制可能部份是通过抑制NF-KB的活性而实现的。 1、5 NO作用于CASPASE促使细胞凋亡 细胞凋亡是CASPASE家族参与的复杂的过程，凋亡诱导因子作用于CASPASE酶原，使CASPASE活化而成有活性的CASPASE家族酶系。主要的CASPASE活化途径有:?胞外活化途径 细胞因子通过FAX途径诱导INOS MRNA的表达，而INOS MRNA表达后产生的NO又能刺激TNF相关的凋亡诱导配体MRNA和FAS MRNA的表达，调亡诱导配体MRNA表达后将死亡信号传递至胞内，激活CASPASE家族系统，导致细胞凋亡;?胞内活化途径 正常情况下，APAF-1和CYT-C位于线粒体内外膜之间，NO和其类似物改变线粒体膜的通透性，导致APAF-1和CYT-C释放到胞液中，CYT-C和APAF-1结合，APAF-1寡聚化后与CASPASE-9酶原结合，活化的CASPASE-9又活化CASPASE-3酶原，从而导致一系列CASPASE家族酶系的活化，由凋亡信号激活的CASPASE家族作用于ICAD，使CAD脱离出来而进入细胞核，发挥DNASE的活性，分解染色体DNA，从而导致细胞凋亡。 2、 一氧化氮抑制细胞凋亡的机制 2、1 上调细胞CGMP而抑制凋亡 血红蛋白鸟苷酸环化酶是NO作用的分子位点之一，NO通过与血红素相互作用而激活鸟苷酸环化酶，使CTP产生CGMP，提高胞内CGMP浓度，降低胞内钙离子浓度，而胞内钙离子浓度是细胞凋亡的一个关键因素之一。其潜在的机制是CGMP依赖性的蛋白激酶的激活和CASPASE家族酶活性的抑制，CASPASE家族酶系活性抑制后限制了BCL-2的降解，这在GENARO。AM的实验中可得到证实。NO能使脾细胞胞内的BCL-2水平升高，细胞抗凋亡能力增强，从而保护细胞免受死亡。 2、2 NO诱导细胞产生保护性应激蛋白 NO在胞内氧化减少细胞内谷胱廿肽的含量，导致细胞的抗氧化能力降低，产生氧化或亚硝基化应激，细胞的氧化应激或亚硝基化应激能诱导产生热休克蛋白HSP32和HSP70，HSP32和HSP70可保护因氧化应激或亚硝基化应激对细胞的促凋亡作用。潜在的NO介导的HSP表达而抑制凋亡的分子机制有两种可能的途径:? HSP直接抑制CASPASE家族蛋白酶的活性而阻滞了凋亡信号的传导通路;? HSPS促进线粒体伴侣蛋白摄入特定蛋白前体物质进入线粒体，调控线粒体的功能和线粒体膜的通透性，阻滞细胞色素C的释放，从而延缓细胞的凋亡。 2、3 NO抑制细胞色素C的释放 有关研究显示从线粒体释放的细胞色素C，是激活CASPASE家族酶原的关键因子之一。HAN-JUNG-CHAE等在成骨细胞(MG-C3)的研究中证实， NO能使细胞中的CAMP含量增加，CAMP的增加阻滞了细胞色素C从线粒体释放，从而使由细胞色素C激活的通过APAF-1介导的CASPASE家族酶原3、6、9的激活效应失败，以阻断成骨细胞的凋亡。 2、4 影响NF-KB和BCL-2 转录因子NF-KB参与调节细胞的凋亡，NF-KB受抑制，细胞凋亡将增加。有关报道显示，LPS延迟中性粒细胞的凋亡是通过激活NF-KB和后序的CASPASE-1依赖性的IL-1β的激活作用。CONNELY等报道，低剂量的NO能激活巨噬细胞中的NF-KB，后者的激活导致生存因子转录的上调，IEX-IL、凋亡蛋白抑制剂以及多种抗凋亡的BCL-2基因家族:包括NCL-1、BFLI/A1、BCL-XL和NR13等，这些生存因子和抗凋亡基因的表达增高，阻止了细胞的凋亡，NO激活NF-KB可能是通过CGMP依赖机制。NO能降低MAP KINAES-PHOSPHATASE-3的表达，后者的表达降低，下调了BCL-2的降解作用，保持胞内的BCL-2的水平，促进细胞的生存。这种NO影响NF-KB介导的转录调节对细胞的抗凋亡作用在炎症细胞尤其明显。 3、 结语 在多种细胞的财亡中，NO具有双重的影响。总的来说，在低浓度时NO具有延缓细胞凋亡的作用，而在高浓度时具有增强细胞凋亡的特性。细胞是否进行凋亡，取决于细胞内抗凋亡和凋亡因素之间的平衡与转换。大理研究证据表明，生理性浓度的NO作用于这种平衡的结果，是在多种水平的抑制凋亡通路上执行的，其最终使细胞免于凋亡而存活。主要的抑制凋亡的途径为上调细胞CGMP、诱生保护性应激蛋白、抑制线粒体释放细胞色 素C和影响NF-KB与BCL在胞内的水平等机制。在多种细胞中，高浓度的NO对细胞的影响超出了细胞的保护机制而破坏了这种平衡，使细胞趋向凋亡。其中最重要的是氧化应激状态下产生的ONOO-破坏DNA导致ARP的激活和ATP的消耗，同时也作用于线粒体的功能，抑抑制NF-KB的活性和直接影响CASPASE家族酶系的活性，其最终的结果是使细胞促凋亡因素被大大增强而导致细胞死亡。NO介导细胞凋亡是一个复杂的调控网络，NO生物学作用的广泛性和两面性使其作用机理更加复杂化，影响其对细胞凋亡取向结果的因素很多，主要有细胞类型、NO浓度和活性氧、NO产生的速度、细胞内氧化还原状态、对一系列酶的修饰等。本文既从总体上就NO对细胞凋亡的生物学特性作一略述，至于NO作用于不同细胞以及同一细胞在不同分化阶段的凋亡作用的异质性，目前仍然不甚明了，认识NO在不同细胞凋亡过程中的作用靶点和其作用机制，有助于阐明NO与细胞生物学，NO与相关疾病的病因学与治疗学的研究，为NO供体类药物的临床应用开辟新的研究领域。 参考文献 1. Palmer RM;Ferrige AG and Moncada. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor .[J]. Nature.1987. 327:524-526 2. Nicotera P,Brune and Bagetta G .Nitric oxide:inducer or suppressor of apoptosis?.[J].Trends Pharmacol. Sci.1997.18:189-190 3. Megson IL.Nitric oxide donor drugs.[J].Drugs Fut.2000. 25:701-715 4. Butler AR and Rhodes P .Chemistry;analysis;and biological roles of s-nitrosothiols. Anal.Biochem.1997.249:1-9 5. Maragos CM,morley D,Wink DA, Dunams TM, saavedra JE, Complexes of no with nucleophiles as agents for the controlled biological release of nitric oxide.Vasorelaxant effects.[J].Med.Chem.1991.34:3242-3247 6. Feelisch M;Ostrowski J and Noack E. On the mechanism of no release from sydnonimines.[J]Cardiovasc.Pharmacol.1989.14: s13-s22 7. Adrie C;Richter C;Bachelet M .Contrasting effects of NO and peroxynitrites on HSP70 expression,and apoptosis in human monocytes.[J].Am.PhysioL.Cell Physiol.2000.279:c452-c460 8. Yabuki M,Tsutsui K,Horton AA,et al.Caspase activation,and cytochrome C release during HL-60 cell apoptosis induced by a nitric oxide donor.[J].Free Radic.Res.2000.32:507-514 9. Borutaite V,Morkuniene R and Brown GC.Nitric oxide donors,nitrosothils,and mitochondrial respiration inhibitors induce caspase activation by different mechanisms.[J].Febs Lett.2000.467:155-159 10. O’neil S, O’neil AJ,Conroy E,et al. Altered caspase expression results in delayed neutrophil apoptosis in acute pancretitis.[J].Leukoc.Biol.2000.68:15-20 11. Ward C,Chilvers ER,Lawson MF,et al.NF-KappaB activation is a critical regulator of human granulocyte apoptosis in vitro.[J].Biol.Chem.1999.247:4309-4318 12. Connelly L,Palacios-Callender M,Ameixa C,et al.Biphasic regulation of NF-KappaB activity underlies the pro,and anti-inflammatory actions of nitric oxide.[J].Immunol.2001.166:3873-3881 13. Dimmrler S,Haendeler J,Sause A and Zeiher AM. Nitric oxide inhibits APO-1/FAS-mediated cell death.[J].Cell Growth Differ.1998.9:415-422 14. Torok NJ, Higuchi H, Bronk S and Gores GJ.Nitric oxide inhibits apoptosis downstream of cytochrcme C release by nitrosylating capase 9.[J].Cancer Res.2002.62:1648-1653 15. Piantodasi CA, Tatro LG and Whorton AR. Nitric oxide,differential effects of atp on mitochondrial permeability transition.[J].Nitric Oxide.2002.6:45-60 16. Katsuyama K, Shichiri M, Marumo F and Hirata Y .NO inhibits cytokine-induced inos expression,and NF-KappaB activation by interfering with phosphorylation,and degradation of lKappaB-alpha.[J]. Arterioscler. Thromb.vasc.biol.1998.18:1796-1802 17. Kalra D,Baumgarten G, Dibbs Z, et al. Nitric oxide provokes tumor necrosis factor-alpha expression in adult feline myocardium through a CGMP-dependent pathway.[J].Circulation 2000.102:1302-1307 18. Kim YM,Kim TH, Seol DW, et al. Nitric oxide suppression of apoptosis occurs in association with an inhibition of Bcl-2 cleavage and cytochrome C release.[J].Biol.Chem.1998. 273:31437-31441 19. Kim YM, De vera ME, Watkins SC, Billiard TR. Nitric oxide protects cultured rat hepatocytes from tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis by inducing heat shock protein 70 expression.[J].Biol Chem.1997.272:1402-1411 20. Hibbs JBJ,Taintor RR,Vavrin Z. Macrophage cytotoxicity:role for L-arginine deiminase and imino nitrogen oxidation to nitrite.[J].Science.1987.235: 473-476 21. Brune B, Zhou J, Von Knethen A. Nitric oxide,oxidative stress,and apoptosis. [J].Kidney,Int.Suppl. 2003.84:s22-s24 22. Boyd Cs, Cadenas E . Nitric oxide and cell signaling pathways in mitochondrial-dependent apoptosis.[J].Biol. Chem. 2002.383(3-4):411-423 23. Kotamrajiu S，Tampo Y，Kalivendi SV. Nitric oxide migtigates peroxide-induced iron-signaling,oxidative damage,and apoptosis in endothelial cell. [J].Arch Biochem.Biophys. 2004.mar.1.423(1):74-80