【doc】柯萨奇B1病毒VP1基因DNA免疫的研究

【doc】柯萨奇B1病毒VP1基因DNA免疫的研究 柯萨奇B1病毒VP1基因DNA免疫的研究 革2l卷第3期 20u2年5月 中国地方病学杂志 ChineseJotlrnaIofEndcmiotug:~ May.,2(…2 VuI2lNo3?161? [实验观察] 柯萨奇B1病毒VP1基因DNA免疫的研究 赵铁强,田野,钟照华,梁瑛娟.,韩福生.钟学宽,皮国华.,孟繁超 (1哈尔滨医科大学第一临床医学院心内科,黑龙江晴尔滨150001;2哈尔滨医科大学基础医学院,黑龙江哈尔滨 l50086{3,中国预防医学科学院病毒所渗断二摩.北京l01I1)52) [摘要]目的拘建柑萨奇Bl病毒(cVBI)的DNA疫苗,评价其免疫学性状将重鲥质粒pMDI8 TvPl巾的CVBIVI】基因亚克降至pCEP4簸体,构建真棱表达系统pCEIVP1作为DNA痤,经酶切, PCR和测序鉴定后转染至HeI细胞.用间接免疫荧光法榆测CVP,I抗原的体外表达.提纯制备pCEP.tVPl接 种BAlB./C小鼠,取m清?El,1SA法检测抗CVB1]gM和lgG,用释放 法测定cI,l反应.结果酶切I’CR 和测序让叫VP1DNA痤苗构建正确;转染pCEI4VP1的HeI丑细胞 巾可见到荧光标记,提示表达rVP1蛋白; 接种pCEP1VI1的小鼠可检测到抗CVBI的IgM和IgG.井能产生较 强的特异性CTI反应结论pCEP.t vPl町作为I)NA疫苗诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫府答 关键词]柯萨奇B1骗毒}I)NA疫苗;免疫应答 [中图分类号]R37323[文献标识码]A[文章编 号])04955(2002)03016l04 DNAimmunizationofVPIgeneofcoxsackievirasB1 ZH86,Chi,Ja;3Number2Diagnostec Lab,Virolr}gyInstitute.Chinese’ademiyo./PreventiveMedicI’rle,Beijing150052,(…na) Abstract.OblectiveToconstruclDNAwcineoCoxsackievirusB1(CVB1)ande%,~llutili1lologica1 eharacterislicsMethodspCEP.IVPlwasconstructedbysuhcloningtheVP1gcnefrompMD18-T—VP1into pCEP,tandconfirmedwllhrestrictionandysis.PCRandDNAsequencing.AacandidateDNAvaccine,peEP4 VP1w,lrfectdLnt0HfaIIf.ritTItTIun0f1’J()rcs? ctes1.BnLB/Cmiceve’ereinoculaledwithpCEP4 VP1andscrharvestedfrommiceve-creappliedforEIISAtodetect[gMandIg G.Crreleasemethodused 1oinvestigatspecificCTL.ResultsRestrictionanalysis,PCRandDNAsequencingshowedthatpCEP4一VP1 ?strucledr『1rrt1.FIuouesc~ncesignalscat]be? nonHeIa:ellstransfectedwilhpCEP4VP1?which suggestthatCVB1VPIantigencouldbeexpressedinvitro,Theino:ulatedmicecouldproduceCVB1specific IgM,lgGandCTLresponse.ConclusionspCEP,1VP1mayplayIDNAvaceiBctoinducehumoralandcyto logicif】l订1u1leresponseintTuce? Keywords:coxsackievirusB1;DNAvaccille;inli]luneresponse 柯萨奇B组病毒(c.xsackievusB.CVB)属于 小RNA病毒科的肠道病毒属,有6个血清型 CVB16.柯萨奇B1病毒(CVBt)与其它型别一样, 可引起多组织器官的损害.由于柯萨奇B组病毒型 别多,核酸具有感染性等原因,目前尚缺乏有效的疫 r收稿日期]2001l02s:L修订日期]20o20122 [基金项目]IN家自然科学基金资助项目(30C,7[i31);黑龙江省科学汁 蜘项目青年基皂资助项目(QC01C12 PI基因真核表达系统pCEP4VP1作为候选的 DNA疫苗,评价诱导小鼠免疫应答的效果,为柯萨 奇B组病毒的预防提供理论基础. ? ]62-巾地方病学杂志带2I卷 与方法 1.材料含CVB1VPl基凼的质粒pM1)18T— VP1为我窜构建真核表达载体pCEP4为Invit— rogen产品.限制性内切酶,QIAGENPlasmidM.axi Kit为QIAGEN公司产品.DNA转染试剂CION fectln为C1()NTECH公产品CVB1由中国预防 医学科学院病毒所提供,CVB1lgM,IgGELISA榆 测试剂为中国军事医学科学院产品BA1B/’C小鼠 购自中国医学科学院动物学部. l,2I)NA疫苗构建和鉴定将pMD18TVP1和 pCEP.1分别用BamH1和Hind?酶切获得2个 互补粘端.在F4DNA连接酶作用下连接获得含 VP]基因的真核表达质粒pCEP1一V11.转化 JMl09感受态苗.提纯质糙.崩NheI,Nhe【 BamHI酶切韧步桀定质粒构建的JF确性.用PCR 方法扩增VPl基..提纯质粒由TaKaRa公测 序 1.3DNA痘苗太量提纯制备按QlAGENPlas midMaxiKit的方法进行 1,4pCEP4VP1在He1a细胞的袁遮在6孔板 培养Hel细胞.按C1()Nfectin说?Jj书进行转染 将(,I_()Nfcctin分别与pCE11Vl1和pCEPI混 合.形成1)NA/C1()Nfectin复合物将复合物滴加 于细胞.培养.冷丙酮固定十燥.将含CVB1一lgG 的清滴加至转染的Hcla细胞I,作用30rain滴 加兔抗鼠lgG荧光抗体.作用30min晾干.荧光显 微镜下观察 15动斗轩接种6周龄BALB/C小鼠随机分成生 理盐水组,pCEP4组和pCEP4VPl组.每组l0只 动物.腹腔注射盐酸氯胺酮2Illg.待小鼠四肢松弛 接种双人腿股叫头肌.剂量为l00l,~g/只.4周后进 行第2次接种.作为加强免疫,剂量和方法『司前.首 次接种前,首次接种后1用,加强免疫前,n?强免疫 后3周断尾采血.分离.们清.待榆. 16CVB1_lgM与lgG的EIISA检删参照试剂 盒说明书在96孔板进行.结果用酶标仪下波长150 nm处测A..值,|_j牵白对照孔校正.各组A值问 差异用榆验.汁尊P/N伉.P/\一被检血清A值 /阴性对照孔A.值.P,\?2.1为阳性.P,\<2.1 为阴性. 1.7细盹毒性T淋巴细胞((I)反应的检测 1,7,1效应细胞的制备加强免疫后3周处死小 鼠.无菌取脾.分离脾细胞.在200目不锈钢网筛上 研碎鼠脾.将脾细胞置于无血清的RPM1]640培养 液中.离【去上清.加H低渗液破坏红细胞.离 心去消,加RPMI1640重悬后吸至细胞培养瓶 内.贴壁I,5h吸取清过无菌尼龙毛柱.分离得 到T细胞.将T细胞重悬于T细胞培养摹【TCM). 用TCM调T细胞数为1×10/”ml.取1mJ加入24 孔培养板.每孔加0,3mt灭活的CVB1病毒再刺 激于3C.5CO,培养jd. 1.7.2靶细胞的制备用CVBl病毒感染P815 细胞过夜,无血清RPM1l640洗3次,加人lO0{C1 Na25CrO,培养1,5h.尢血清RPMIl640洗3次. 调节细胞浓度至l×l0/m1.作为靶细胞.将效应细 胞和靶细胞分别以l00:1,50:l,25:1共同37C 5CO崤养6h.同时做自然释放和最大释放对 照.离心后吸取清lI)o【.装人小塑料管.于7计 数仪凄取CPM值.按以下计算细胞杀伤率: 杀伤率--×00 2结果 2,lpCt’:P,1VPl的构建与鉴定提纯的pCEP4 VP1经Nhe1酶消化ur成1],23kb的线性片段, 经NheI—Ban1Hl酶切成10.4kb,0,83kb2个片 段.符合理论预期值pCEP4VP1为模板进行 PCR可扩增出VP]基日(图1).对pCEP4VP1测 序表明vP1以正确的方向克降在pCEP,t载体上. 测序谱略. ABCD 2123kh 515kb 图lpl’FV【1缝Nhe1+Ban]fII酊划杖PCR的缔果 A:L{lrI1daDNA.”EcoR1IIIi【LdIIB:VPl基罔PCR结果 【,pCEt1VfI/NhcI【】DEl’1Vt1/NheIBamHI 2,2pCEP,1Vtl在HeIa细胞的表达转染 pCEP,1VPl的HeLa细胞在荧光显微镜下可见荧 光标记(2A),而转染pCEP4的细胞无荧光标记 (图2B).此结果提示vP1基在HcIa细胞中获 得r表达 苹3期赵铁强.等扣J萨奇BI病毒VP1基因D)4A免疫的研究?l63? AEl4VPi转架tqe[i缅胞B:埘组pCEPI转染tte1a细胆 图2lICKI1VII转染He]a胞_r几龟症甍光转测结粜 2.3L’vB1IgM与lgO的检删CVB1lgM实验生首次免疫后4岗,加强免疫后3周各组P/N值 结果见表1.首次免疫前小鼠采『f『L.检测不到IgM<2.1,A值间差异无显着意义CVB1IgO检测结 (数据略】首次免疫后1周.pCEP4Vt1接种组果见表2第1次免疫前检测不刨IgG(数据略). P/N值>2l,而pCEP组和l申理盐水组P/N值<pCEP1一VI1接种组十加强免疫后3周一可检测到 2.].结果说l时J【tEP4VP1接种小鼠产生r抗IgO抗体pCEP4接种组和牛理盐水组在任何时间 CVB】的IgM.『fr『单纯pCEP4质粒接种则不能产点均检测不到lag 表lElISA检删小鼠免疫后CVB1IgM水平 l? :?l , 革 基 屿 g如 I 圄:小鼠免疫后(II,反应的检测绪果 2.4CTI反应的检测从图3可见pCEI4VPl 接种小鼠aJ诱导较强的CTI反应.其杀伤率明显高 于对照组,mJI}CEP4组.生理盐水组几乎无杀伤效 应,说明pCEP4一VPl做为I)\A疫苗可诱导特异性 CTI反应 3讨论 CVB可在世界各地散发或暴发流行.目前尚无 CVB灭活疫苗和减毒活疫苗应用于临床的报道,主 要问町能是CVB型别较多且核酸具有感染性. DNA疫苗是近年来兴起的一项新技术,由于它制备 简便,诱导免疫应答完整,可联合免疫等优点,目前 已进行了多种微生物DNA疫苗的研究.有的已经进 入临床试验.显示了良好效果 CVB基因组中的VPl基因是主要中和抗原,因 此构建cVB的DNA疫苗.VPI基困是最值得考虑 ? 164?匿地方病学杂志第2l蔷 的,.我们构建丁含有VP1基因的真核表达系统 pCEP4一VP1,在体外将pCEP4VP1转染到He[,a细 胞获得了VPI基因的表达,证实了该候选DNA疫 苗的真核表达能力.为体内实验奠定了基础.候选的 DNA疫苗接种小鼠后可检测到特异性lglvl和IgG 提示pCEP4一VPI注射至体内可以在体表达VP1蛋 白.刺激机体产生相应的抗体但是抗体水平并没有 预期的高.其它DNA疫苗的报道也得出抗体水平不 高的结果?.原因可能是DNA疫苗编码的蛋白 不能被很好的加工;?接种DNA疫苗在体内表达的 病毒蛋白往拄是不能致细胞病变的.病毒蛋白不能 从细胞中释放:L’VH1足胞浆病毒.其转求和转录 后途径可能与其在细胞中的低表达有关DNA疫苗 很重要的优点在于它诱导体液和细胞双重免疫.接 种pCEI4VPI的小鼠可被诱导产生CT1反应.事 实卜.病毒性感染后机体除产生特异性抗体中和游 离病毒外.还通过特异性CT1识别,杀伤,破坏病毒 感染的细胞.后者在病毒感染中兄为重要DNA疫 苗较蛋白疫苗的优点就在于它不仅能诱导体液免 疫,还可引起细胞免疫这F是很多1)NA免疫报道 的低水平抗体,高水平免疫保护结果的原因之所在 综所述.pCEI’4VP1nr在体外表达VP1蛋 白,可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫至于它保 护小鼠抵抗病毒攻击的效果.有待进一步深入研究 [参考文献] 虎林市消除碘缺乏病阶段目标评估结果分析 :中图分类号]R59ll 曲宝胜.陈王杰 t虎林『li生衙蜓站.黑龙江虎林lb8400) [文献标识码]r]:文章编号]l0004955(2002)03nl61nl 虎林}忙于龙?J_省女,部.属碘缺 乏摘中等地,从l969盯始实施了 以争M食盐加碘的综台防治为进 步掌握我市碘缺乏病的防治现状. 2乏病工作是』页长 期艰}r,持续性_l_作.还庖继续完善叮 持续消除碘缺乏病的运行机制.更好地 巩固裴市的防治戚粜. 篓蒌一 藿篓,