去透明带仓鼠卵母细胞穿透试验[指南]

去透明带仓鼠卵母细胞穿透试验 人精子与仓鼠卵母细胞融合的过程在功能上同与人卵母细胞融合的过程是一样的，因为与卵母细胞质膜融合的过程都是通过质膜覆盖在已发生顶体反应的人精子赤道段而启动的。仓鼠卵母细胞穿透(HOP)试验，或称精子穿透试验，由于去除了透明带，因此它不等同与生理状态。此试验的标准方案见后。 注释:常规穿卵试验是依赖精子的自发性顶体反应而实现的，这需要延长精子在体外的孵育时间。由于此步骤不如生理过程有效，且可能涉及不同的机制，因此 常常出现假阴性结果(病人的精子在仓鼠卵母细胞穿透试验中失败，而在体内或 WHO，1986)。尽管如此，穿卵试验仍可以反应获体外可使人的卵母细胞授精， 能精子头部质膜与卵细胞膜发生融合能力的信息。 继精子-透明带之间的相互作用后，引起顶体反应的细胞内信号是钙内流和胞浆碱化，两者均可由二价阳离子载体A23187人工诱发。另一种方法是使用A23187激发的精子，该方法在文中亦有所描述。 4.5.1 实验方案 4.5.1.1 试剂 1(BWW储存液:见附录4，A4.1节。 2(透明质酸酶(300-500IU/mg)。 3(?型胰酶(10000 BAEE U/mg)。 4(蜡块(融点为48-66?)。 5(凡士林 6(矿物油 7(去除透明带的仓鼠卵:可购买商品化的卵或通过对仓鼠超排卵获得。(见框 4.1) 8(二甲基亚砜(DMSO)。 9(钙离子载体(用于可选择方案)1mm储存液。 4.5.1.2 不用钙离子载体的标准方案 1(将精液标本混合均匀。(见框 2.3) 2(用密度梯度离心法(见5.5节)或上游法处理精液标本(见5.4节)。 3(弃去大部分上清液，留下沉淀。 4(轻轻吹打重悬精子沉淀，并计数精子密度。(见2.7节和2.8节) 65(在约0.5ml培养液中将精子密度稀释至约10×10/ml。 6(将试管倾斜，与水平面呈45?角，以增加气体交换面积。 7(精子悬液置于含5%(V/V)CO的37?孵箱中培养18-24小时，使精子2 获能。(将试管盖子拧松以利于气体交换)。如果没有CO孵箱，可用Hepes缓2 冲的培养液并将试管盖拧紧后，于37?孵育。 8(将试管复原到垂直位，放置20分钟使获能后不动的精子沉淀下来。 9(从液面顶部1/3吸取活动精子转移到另一新试管中，注意要小心操作，不要搅动起下部的死精子。 6(在培养液中调整活动精子密度至3.5×1010/ml。 11(每滴吸取50-150µl精子悬液，缓慢地加入到一个小的Petri盘中;用一次性吸头吸取已经预温并在CO孵箱中平衡好的矿物油覆盖液滴，小心操作不2 要搅动精子液滴，并保证加入足够的矿物油以覆盖每一滴精子悬液。 4.5.1.3 掺入钙离子载体的可选择方案 1(用密度梯度离心法制备获得高活力的精子悬液，详细描述见5.5节。 2(从80%密度的梯度离心液底部吸取沉淀物，并转移至8ml BWW液中。 3(500g离心5分钟。 4(弃去沉淀上方大部分上清液，轻轻吹打重悬沉淀物。 5(计数精子密度(见2.7和2.8节),用新鲜配制的BWW液将活动精子密 6度稀释至约5×10/ml。 6(分别加入1.25和2.5µl A23187储存液(1 mmol/l)至1 ml精子悬液中，达到1.25和2.5µmmol/l 两个终浓度。 7(精子与钙离子载体于37?条件下孵育3小时。 8(500g离心细胞5分钟。 9(弃去沉淀上方大部分上清液，轻轻吹打重悬沉淀物。 10(评估精子活动率。 611(用新鲜配制的BWW液将活动精子密度稀释至约3.5×10/ml。 6活动精子密度低于1×10/ml时仍可以获得有效结果(Aitken & Elton,1986)。 12(将精子液滴用矿物油覆盖，详细描述见4.5.1.2, 步骤11。 注:钙离子载体处理的剂量-效应曲线有个体差异，因此最好两个浓度的钙离子 载体都检测。 框4.1 仓鼠诱导排卵 确保注射活体动物的流程都符合法律程序。准备好合适剂量的孕马血清PMSG)和人绒毛膜促性腺激素溶液。小量分装后储存于-20?备用。经腹腔注( 30单位PMSG给未成熟仓鼠或动情期第一天的成熟仓鼠。48-72小时后，经射 40单位的hCG。用一只手抓住动物背部并向腹部上方拉紧腹部皮肤，腹腔再注射 21号针头的1ml注射器将激素注入仓鼠腹腔(从髋关节上方另一只手拿一个带 进针)。注射每只动物都更换针头，这样易于穿透皮肤并减轻动物的不适。 4.5.1.4 收集卵巢 1(注射hCG后18小时内，按照动物饲养使用委员会批准的方法处死动物以回收卵母细胞。 2(仓鼠腹部朝上放置，用95%(v/v)酒精蘸湿腹部皮毛。 3(用齿镊夹住皮肤，用剪刀剪开皮肤和肌肉，暴露子宫及卵巢。 4(用95%酒精擦拭镊子和剪刀，擦净上面的毛发。 5(将小肠拉出腹腔，暴露双角子宫。 6(用镊子夹住双角子宫的一边，将其拉出腹腔外以暴露输卵管、卵巢及卵巢韧带。 7(持住子宫最远端的位置，紧贴镊子下方从子宫末端切断。切下卵巢，放入装有BWW液(37?预温)的Petri盘中。 8(以相同的方法收集另一个卵巢。 4.5.1.5 收集卵丘复合物 1(在解剖显微镜下通过透视检查卵巢，在输卵管的膨大部位找到卵丘复合物。 2(用镊子固定输卵管，用21号针头刺破膨大区域。卵丘复合物将从刺破处溢出。 3(用针头拨出卵丘复合物，并用镊子挤压输卵管以使所有卵丘复合物溢出。 4.5.1.6 卵细胞的获取与处理 1(用针头和镊子将卵丘复合物收集并放置到一个面玻璃盘，滴试板或其它浅盘里，盘中事先加热37?，CO平衡过、含0.1%(1 g/l)透明质酸酶2 (300-500IU/ml)的BWW液。 2(将容器用铝铂纸包裹以避光，于室温孵育10分钟。解剖显微镜下观察颗粒细胞分离的情况。 3(用火焰上拉的玻璃吸管将去除颗粒细胞的卵母细胞从透明质酸酶消化液中，转移到37?平衡的BWW液里。 4(将获取的卵母细胞转移至新的BWW液滴(37?平衡)内，洗涤2次。这一步可在多孔玻璃盘或滴试板中进行，每一步卵细胞转移操作前均需用BWW液洗涤吸管。 5(室温下，用1%胰酶(10 000IU/ml)消化卵细胞1分钟以去除透明带。解剖显微镜下观察透明带消化的情况，透明带被消化掉后尽快将卵细胞移出。 6(用BWW液洗涤卵细胞3次以上。 7(将分离好的卵细胞温育至37?，并滴加精子悬液共同孵育。如果暂时不用，卵细胞可在4?保存24小时备用。 4.2 框玻璃吸管的制备 玻璃毛吸管或巴斯德管置于煤气灯火焰上方转动，双手持住玻璃管的两端，于火焰上方一边转动管子，一边前后移动，使玻璃管充分受热。当玻璃管开始融化时，两手快速向相反方向拉伸使玻璃管被拉长、口径变细。从适当口径(约1mm)的地方切断玻璃管，将玻璃管未拉伸的一端与1ml注射器相连接。 4.5.1.7 配子的共孵育 1(将去除透明带的卵细胞分别放入几个精子悬液微滴中，每滴放5枚卵细胞。(例如，每份精液标本需20枚卵细胞，准备4个精子悬液微滴，每滴内放5枚卵细胞)。 2(玻璃吸管吸取5枚卵细胞，用尽可能少的液体将其转入精液微滴，使精液微滴尽量不被稀释。 (管尖直接伸入一个精液微滴的中央，将卵细胞缓慢释放。玻璃吸管维持3 正压以阻止矿物油倒吸，同时注意不要向精液微滴内吹打出气泡。 4(玻璃吸管从精子悬液移出后，需将管尖多余的油擦掉。 5(重复步骤3，直到所有卵细胞都被转入精液微滴。 6(每一次卵细胞转移后，均需在BWW液内充分洗涤吸管，以避免精子间的交叉污染。 7(配子置于37?，5%(v/v)CO环境下，孵育3小时。2 8(从矿物油覆盖的微滴内吸取卵细胞，小心擦掉吸管尖端多余的油，然后将卵细胞转至BWW液内。 9(在BWW液内，用火焰上拉的巴斯德吸管通过吹打，洗涤去除卵细胞上粘附松散的精子。 4.5.1.8 卵细胞 1(在矩形的四个角上放置4滴石蜡-凡士林混合物(见框 3.1)，使每滴成小柱状以支撑盖玻片(22mm × 22mm, 厚度编号1.5, 0.17mm)。 2(放一小滴包含卵细胞的BWW液于4个小柱的中央。 3(缓慢地将盖玻片盖在石蜡柱上并轻轻压下，使卵细胞变平。光学显微镜下观察解聚的精子头部时，需要将卵细胞很好地铺平。 4(有必要的话，可加更多BWW液至盖玻片下，以防止卵细胞被压破。 5(相差显微镜200倍放大倍数下检测每个卵细胞。 6(计数有尾的或与尾关连的解聚精子头数。(见Fig 4.4) 7(记录至少有1条精子穿透的卵细胞所占百分比，以及每个卵细胞内穿透的精子数。 (洗涤后仍然观察到有精子粘附在卵细胞表面的，加以记录。这可以提示8 精子群体中发生顶体反应的比率。 4.5.1.9 质量控制 该试验一定要在阳性对照精液标本显示大于50%穿透率的前提下进行。