雌性大鼠离体垂体前叶内在促黄体生成激素释放节律性现象

雌性大鼠离体垂体前叶内在促黄体生成激素释放节律性现象 雌性大鼠离体垂体前叶内在促黄体生成激 素释放节律性现象 7一,乡' 生理,1997,49(6).649,656 雌性大鼠离体垂体前叶内在 促黄体生成激素释放节律性现象 谢衷明毛垒福棘美红顾佩德 (上海市生育科学研究所,上海20?32) 选\/(北京大学概率统计系,北京100871) * 尺3f 摘要众所周知,下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)以脉冲形式驱使垂体前叶释放促黄 体生成徽素(tH),但垂体前叶本身释放LH的形式却遭忽略直到啪Gambetcciani(1987)Lt和 谢(1987)~才发现^和大鼠离体垂体的1月释放呈节律性.本文目的在于进一步证实是否确实 存在LH释放的内在节律.取出SD雌性大鼠垂体后,经1bl99培液蓓流,在整个120rain的实验 过程中,每5min收集一次0.5Inl的灌流液,由放射免疫测定出的1月值经消除趋势后,再用时间 序列的潜周期分析法,极大埔haxim咄Entropy检验和检测出I朋中的周期性节律.实验结 果为:(1)不同生殖激素条件下1月释放的内在节律不同.动情前期组的释放频率(F,min/cycle) 与振悟(A,rig/In1)最高,其次为去卵巢组;最低的是哺乳期组.(2)多肤激素或甾体激 素能改变 1月释放的内在节律性.(3)wrar,~il和EGTA能使动情前期组的内在节律变慢.本工作表明垂 体前叶LH释放的内在节律随生殖内分秘条件而异.并受外繇性激素的影响,推测这种节律可能 有Ca2的参与.垂体前叶LH释放的内在节律的真正生理意义还不清楚. (77 的正常生理活动.70年代ErnstKnobil发现猴促黄体生成激素LH的释放呈脉冲状,以后 Gray和Jackson等人证实垂体?{分泌的脉冲式释放,是由于下丘脑对GnRH的释放呈 "振荡"式所致J,换言之,印垂体LH脉冲式释放是被动的,这一观点已被普遍接受. 但在离体实验中,我们观察到大鼠垂体前叶的LH基础分泌并不平稳.许多研究者包括 本实验室早期的认识都认为基础分泌出现的波动是实验过程中造成的,对其是否为生物 我们在分析数据过程中才发现这些数据的波动活动现象一直没引起人们的注意. 颇具规 律性,可能潜在着垂体LH释放的内在节律性现象.本文试图观察大鼠垂体前叶在离体 条件下释放LH是否呈节律现象?如果确有节律现象,它与生理状态有无关系?能否受 外加激素影响? 1和方法 1.1动物成年Spr~Lle—Dawley雌性大鼠,体重220?加g.本实验组别为:动情 1996-03-29收稿1997—03.25信回 国隶自然科学基金委员台(No-39370277),国隶计划生育委员台和世界卫生组甥人类生殖研究,发展和研究培训 特别规蝌署(WHO/HRP)贷助项日 65O生理49卷 前期组(P),其周期经阴道涂片判别;哺乳期组(L),母鼠已授乳10d(喂8只小鼠); 去卵巢组(OVX),实验前40d去卵巢 1.2试荆Tc一199DIFCOLaboratories,Detroit,Michigan,USA;GnRH,Verapaafil, EGTA,均为Sigma公司产品. 13离体大鼠垂体前叶组织灌流方法各组大鼠分别均于上午1O时断头取出垂 体,去除后叶后,将前叶切为4,6块,置人有恒温系统的灌流腔内,由微量泵(SAGE Instrument)恒速(0.5ml/.5n)将经95%o2+5%CO2混合气体饱和的Tc,199培养液灌流组 织.每5min由LKB部分收集器收集一次样品.正式实验前需有90min的预灌流,然后进 人120min的正式实验.实验结束后用GnRH(20ng/IIl1)刺激5rain,再观察203Omjn以检 验组织的生理功能状态.本文所述的内容只示正式实验的结果. 1.4LH放射免疫测定采用Niswender方法L4J.LH品为羊垂体经提纯,聚丙 生物效价相当于1.05×NIH-LH.Sm第一抗体为兔抗羊烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度. LH抗 血清,抗体稀释度为I:40000.第二抗体为羊抗兔球蛋白,稀释度为1:20.用I (A—r8ll一公司产品,英国).氯胺T法标记. 每批测试均附有高,中,低质量控制.在测定样品同时制定标准曲线,【且值为?LH(经 扣除基础值),用ng/IIll表示.利用上海第二医科大学RIA软盘进行运算.批内误差小于 7%,批间误差小于1I%. I.5潜周期分析法的运算对测量到的LH数据,由于是依赖于时间的带随机 性的数据,因而是时间序列.本文的数据处理方法如下: (I)先对测到的数据xt删除其中的趋势成分,由大量观测数据看其趋势,可视为线性 模型,因而用最小二乘回归估计其趋势项是:=n+bt. (2)令=置一,它可视为如下的潜周期模型: 三 Yt=2JA.c0(叫f+)+(f) ;】 Yt 式中:Yt=平稳时间序列, P=阶数. A.=振幅, = 频率, . = 随机相位, c=时间, (t):平稳随机过程. 其中P.,IA,?,中.;皆为未知参数,{【f)为满足适当数学条件的弱.P平稳列[引,{cc.}为独立 同u(o,2)分布的随机相位.利用HSyC]可由的观测值估计出以上诸参数. *有关数学模型的工作曾于19帅年第十届欧洲控制论与系统研究学术大会作报告 6期谢衷明等:雌性太鼠离体垂体前叶内在促黄体生成澈素释放节律性现象 2结果 2.1不同生理状态下离体大鼠垂体前叶的内在LH节律性释放 以"re-199恒速灌流(0.5ml/5Il1in)离体雌性大鼠垂体前叶组织块,预灌流1.5h(图 中未画出)之后,正式{整流220mitt.图1为正式灌流垂体前叶组织块220n的LH释放 及对GnRH刺激的反应情况.在此期间LH的基础分泌在一定的水平上呈现起伏.若在第 220分钟给予10min加n异/ml的GnRH刺激,垂体前叶释放LH在5,10mill内 即可达高峰. 每批实验的重现性较好.围2为动情前期与哺乳期离体大鼠垂体前叶组织的LH释放曲线 图(预灌流及正式实验后的GnRH检测均未画出). 圉1离体整流动情前期大鼠垂体前叶ul释放曲线田 Fig.1LHreleasefromisolatedproestrousanteriorpituitary. bysuperfusion 图2动情前期与哺乳期离体大鼠垂体前叶LH释放曲线图 Fig.2IllustrationofLHrelea~fromisolatedanteriorpituitary, glandsofproestrousand lactatingrats 『-.,In 652生理49卷 动情前期(P),哺乳期(L)和去卵巢(OVX)离体大鼠垂体前叶释放的【JH值,经 时间序列一HSY潜周期分析法处理结果显示,不同生理状态下,LH平均释放频率和振幅都 互不相同.表1为不同生理状态下所获得的离体大鼠垂体前叶LH释放的内在节律现象. 若从表l三组问进行比较,可见P期的垂体释放频率最快(26.82n),释放量在三种生 理状态下亦最高(2.04ng/In1).在L期LH释放频率明显变慢(60.68min),振幅亦降低 (1.07n),而在OVX组,其频率与振幅居于上述P与L组之间,频率为46.00min,振 幅为1.56ng/II1l.以上结果在Xie(1993)_8中用极大熵方法独立分析得到相同的结果. 表1不同生理状态下离体大鼠垂体前叶u{释放的内在节律 Table1IntrinsicrhythmicLHreleasefromisolatedratwtlteriorpituitarygilaundervailOtis physiologicalconditions bW日?P<0-001;dwe?P<0.{301;c岱a,P<0O1;d鹏f,P<0.01;cwb,P(005; f岱e.P(0O1. 2.2肽类激素和甾体激素改变离体大鼠垂体前叶的LH节律性释放 GnRH对垂体Ltl释放的内在节律影响:用Tc.199灌流进人正式实验后.即改用Tc 一 199?GnRH(2.5ng/m1)灌流5nfin或30min后再改用To.199灌流115min或90IDin. 实验发 现三种不同生理状态背景下的离体垂体前叶对GnRH刺激的反应不同.同一种生 理状态下 的垂体前叶对GnRH刺激时程的不同其反应亦异.表2中的F,A皆为各组检测到 的频率 与振幅的平均值. 表2GnRH刺激后离体大鼠垂体前叶LH释放的内在节律 Table2lntr/nsicrhythmofLHreleasefromisolatedratanteriorpituitary GnRI/5vainperfusionwithTo一199+GnRH(25nIII1)for5min;CnRH30ruin perfusionwithTe?199+GnRH(2.5ng/II11)for30min;F,Frequency(min/eyele);A, An~plituae(n晷,mI);n:numberofexperimentalav_imals;P<0.05;P<0.01; ….P<0.001,Experimentalgmup?controlgroup;<0.O1.GnRH5minwGnRH 30mi11. 6期谢衷明等:雌性大鼠离体垂体前叶内在促黄体生成激素释放节律性现象653 从表2可见,5和3omin的CnlIH(25,le,/m1)刺激使P组的频率由对照组的26.82min 变慢为46.o0和43.50min,振幅亦由2.04rig/ml降至1.24和0.92n异/nd,这种下降 趋势与 对照组相比均有统计学差异.5rnin组和30min组两组无显着性差异(P>0.05),但 30 rain组使A降低比5rninGnRH组更为明显(P(0.05).L组和对照组相比无论是5min 或 30min的GnRH刺激,均不能改变LH的释放频率,但能陴低振幅,由对照组的107n 异/ml 降至0.63和0,72nml(均为P<0.O1).在O组30rnin的GnIIlt刺激能加快频率,由 对照组的46.O0min加快为36.05min,此差异具有统计学意义,对振幅的影响不明显,对 照组为1.56.e-/ml而30minGnRtt刺激组为1,69n异/?d.从GnRH对三种不同生理背景下 的节律影响可归纳为三类:一类是加入GnI1H后既影响频率又影响振幅如P组,另一类为 影响频率,不影响振幅如OVX组,第三类为只影响振幅而不影响频率如L组. RU486和抗孕.53对垂体LH释放的内在节律影响:实验分为三组.对照组:选用P 期雌性大鼠,取出垂体前叶前经肌肉注射0.5nll茶油;RU486组:取出P期大鼠垂体前叶 前120rain或30win或10min,经肌肉注射RU4862me/O.5ml茶油;抗孕-53(Anordtin) 组:取出P期大鼠垂体前叶前120min或10min经肌肉注射抗孕I532me/O.5IIll茶油.实 验结果表明,垂体前叶组织对不同甾体激素有不同的频率和振幅反应,同一体激素由于 垂体的反应亦异. 给药时间的不同, 表3RIJ486或Anordrin对离体大鼠垂体前叶LH释放的内在节律性影响 Table3EffeetofII1J486orAnordrinoi1intrinsicrhrthmofLHreleasefromisolatedrat anteriorpituitary F,Frequency(rain/cycle);^,Amplitude(,le/~a);"一"beforestartingexperiment;…P<0.001 'P<0OI..P<O.05cm. 由表3可见对照组得出的频率为29.98?8.04-nIin,振幅为0.35?0.加l1?IIIl,而 RU486组则为先加快频率(注射后10nlin)后降低,由对照组的29.98?8.04min降为 20.63?5.10mill,两值相比P<0.01.而振幅不变,两者为0.35?010和0.35?0.12he./ ?Il.若Rl/486的刺激提前为一30mIn和一120m_m,则可看出频率逐步变慢,到一120?Iin 最为明显,频率为6642?18.00min,与对照组相比P<0.00l,而在振幅上无明显区 别. 在带有内源性雌激素活性的抗孕.53组,无论是一10~rfin还是一120min都能降低频率.由 29.98?8.o4rain增至40.92?16.20和39.69?10.21mn,而对振幅的影响无统计学意义. 概括上述结果,可见t1U486先加快频率尔后降低,而抗孕-53则始终为变慢频率效应. 2.3钙通道阻断剂对离体垂体前叶u1分泌内在节律性的影响 实验发现以含钙离子通道阻断剂0.1mol/LVerap~mlil和4mo1/L钙离子偶台剂EGTA的 3"e.199培液灌流垂体前叶组织能使P组频率变慢P组由对照组的26.82?7.22IIIin变慢为 生理49卷 68.98?42.61min,两组有显着性差异(见表4). 表4Verapamil(0.1mol/L)+EGTA(4mol/L)影响离体大鼠垂体前叶LH释放 的内在节律 Table4EffectofVerapamil(0.1mol/L)+EGTA(4mol/L)0ntheintrinsic~hythmof LHreleasefromisolatedanteriorpituitary -p<0.05;"P(0.O1,experimentalgroupcmatrolgroup 3讨论 近年来已公认垂体前叶的LH释放呈脉冲式,并已探明系受下丘脑GnRH节律性刺激 所致J,但就垂体前叶本身的分泌是否也呈节律性却未见报道.本实验室与北京大学概率 统计系在分析离体大鼠垂体前叶(以下简称"离体前叶")释放LH的资料中,偶尔发现 其分泌过程呈节律现象,并于1987年由本实验室首次报道这一现象[2,5,7,11J.为了进一步 验证"离体前叶"确实存在LH释放内在节律性现象,就必须能从下面三个方面得到证 实:(1)这种内在节律性在不同的生理条件下应有不同的节律;(2)此节律对外加的生殖 激素(肽类和甾体激素)应有不同的应答;(3)某些工具药应能干扰此内在节律. 实验结果肯定了上述的假设,在不同的生理条件下节律不同,对不同的生殖激素有不 同的反应.从拮抗剂能干扰P组频率.提示Ca2参与LH释放的内在节律机制,这 点与前人报道Ca2拮抗剂能消除GnRH的释放节律有相似之处[.】.这些结果提示"离体 前叶"本身确实具有最基本的LH释放内在的节律,其理由有三:(1)由于垂体促性腺细 胞上具有多种受体,其中包括肽类与甾体类激素的受体,因此在不同生理状态下(动情前 期,哺乳期,去卵巢)体内有一种或几种不同的生殖激素占优势,当其与受体结合后即启 动LH细胞的LH合成与释放.从而改变了促性腺细胞最基本的LH释放内在的节律.本实 验所示不同生理状态下离体LH释放节律不同,正是这种现象的"后效应";(2)从实验 结果证明在离体条件下这种"后效应"不是一成不变,而是能为肽类或甾体激素所改变, 呈现为另一种节律;(3)c82拮抗剂能减慢此离体细胞的节律. 造成.离体前叶"内在节律的产生机制还不清楚,亦无相关文献可参考.近年来却有 不少文章述及钙振蔼.我们认为离体垂体前叶内在节律性的产生机制比较复杂,其中至少 与钙振荡(calcium~seillation)"有密切关系.少数文献报道…及本实验的结果提示.细 胞内介导了u{的内在分泌节律.钙振荡实际上是胞桨游离钙的一种普遍运动形式. 广泛存在于电兴奋性细胞以外的多种细胞,它是膜电位的周期性去极化和电压门控钙通道 的周期性开放与关闭的结果.现已证实垂体细胞内同样具有这种振荡模式.是否钙振荡的 频率与振幅编码了相应的激素释放模式?两者之间是否确实存在着直接的联系,尚待进一 步研究.纵观本文的结果,同一种状态下的"离体前叶同时具有13个频率(本文提 供的数值为平均值),以及在不同生理状态下及受不同激素刺激后能有不同的频率反应就 . 6期谢衷明等:雌性大鼠离体垂体前叶内在促黄体生成激素释放节捧性现象655 不足为奇.从本文的结果来看频率较易受生理状态,甾体或肽类激素影响而改变,而振幅 相对来说比较稳定,不易受影响,这一点与影响钙振荡会改变I的分泌频率而不影响振 幅有相似之处.有关进一步阐明"离体前叶"内在节律的产生机制将另文发表. 参考文献 [1]G帅accM,IjuJH,s州?乜 wH,Intrinsicpuls~lityofIAqrelemyefromthehumanpituits~inI加. n幽,1987,45:402—406 [2]谢裒明,顾矗德,赵白鹤等.太鼠垂体前叶体外?1分秘节律研究中国第一届神经内分撼学术舍议摘要汇 编.19g7.40 [3] [4] [5] '6] [7] [8] 【9] [1O] [11] [12] GoodmanRL,K丑I础FL.Thehypothalamicpulse目时 1emt:akeydeterminantofrepn~tcfivecyclesinsheep InFoilerBK.F0IlettDEe?b'gcand?Rewod~Cycf~.C,ohtonPaper1981,No. 32.223 NiswenderGD,Midgl.yLE,Monroe8E,a/.Radi01mm皿啷吼 yforratluteinizinghor/21Oll~withtmtiovineLH s~rtUllandovineI_H.1./:'roceeddngsthes?f?,rExpe..imenzalB/o/ogyandMed/dne,1968, 128;807— 8I1 XiezJ,YeKang-sheng.HsiehChtmg-ming.et.erhythmanalysisofIMrdeaseinisolatedpituit ary.g bytimeseriesanalysisapproach.InRobeaTmppled.0fand跏%London:wdSclerotic PublishingCo..PteLTd,1990.505—509 er~hkeDJ,Bh曲ctlBIyaAN,A止目mlIE."越Cizehoralo~illaficmsofPI丑穹? aLHIevdsintheovari- cctomizedmonErdocr/aotogy.199~387:B5O一853 谢衷明,顾佩德.撩美红等离体大鼠垂件前叶的内在节律性分秘.第十八届中国生 理学大台,学术论文摘要, l9台9.271 Xie7~ongjie,HsiehChung-ming.peTiodieiwan~lysiqofIMreleaseinisolatedpj出 ndbyhidden缸 quency?小如Inxie7.honkieedSmdiesSm~esAac@si~.Case.London:‰ddScientific PublishingC..Pte,LTD.1993.一792 HstisenlederDJ,Yasinf,Yadn,etBeg,a,lofprohtin,~yrothinsubunit,andgonadolropinsubu nit gentexDre9byptJr,nnIUOL18:ale/u_-lIals~r/na/ogy.1993-133(5):20,2051 BeiridgeMCahfiu~bc10120B/o/Chem990.265. 9583,9586 Stojilkovic一.crciumosciUatiunshaldnrpituitarycel1.Endoer脯199213:256—2帅 胡清华.王迪浔:钙拄生理科学展,1994,箱131,136 ActaPhysiologicaSinlca 197749(6),649—656 PHEN0MEN0N0lFINTRINSICRHY1田M0F LUTE??ZINGHoRM0NERELEASEFR0MIs0LATED AN删0RPITUITARYGLAND0FFEM_ALERAT xrEZHONG-MING(HSIEHCHUH0M口忙),MAOQUAN-Fu, )?MEI.HONG,GUPEIDE (ShanghaiImtmaepla,amlParenthoodRe, WHOc一白Ceater如rResearch/a赫咖脚舰础n,咖2oo032) xJEZHONC,-JIE 蹦瞻1008"/1) (/.a~ratery,PekingUnh,m,s畸, 's州theNationalNamrdScienceFoundationofChin~(No.39370277) 生理49卷 ABSTRACT Theintrinsicnatureofrthymlcl~leasoofluteinizinghormone(LH)ofisolated humanandratanteriorpituitarySla~dreportedindependentlybyMacroGambaccianiand Xiein1987earlbemoredirectlydemonstratedbyacomputerprogrammeofTimeSeries- HSYHiddenPeriodicAn~yficApproachforcontinuousmonitoringtheLHoutputofthe perfusatefromaperfusionsystemwith/nvitroanteriorpituita-q"ofSDfemalerat.The resultsareasfollows:(1)Undervariousreproductiveconditionstheaveragefrequency (min/cycle)andamplitude(ag/m~)oftheintrinsicrhythmofLHreleaseweTequite different:Inproestrousgroupthefrequencyandamplirudewerethehishest,being intermediateintheovariectomizedgroupandlowestinthelactationgroup.(2)The intrinsicrhythmofLHreleasecouldbechangedbyeitherpeptideorsteriodhormones.In pmestmusgroupwith30minofganadotropin-releasinghormone(GnRH),stimulation wouldreducebethfrequencyandamplitude.Ineaseoflactation,thefrequencyWas unchanged,butamplitudelowered,whileintheovariectomizedratpituitary,the30min GnRHstimulationdecreasedthefrequencyofreleaseonly.TheintrinsicrhythmoftheLH releasecouldalsobeinfluencedbysteriodhormones(Ru486andAnordrin).With120 rainbeforeremovaloftheanteriorpituitaryglandtheratsreceivingi.m.injectionof Ru486(2mg/kgbw)orAnordrin(2ms/ks),theresultsshowedthatRu486decreased frequency,whileAnordrindecreasedonlythefrenquencytoalessextent,bothwithout amplitudeaffected.(3)VeraoamilandEGTAaddedtotheperfusionsystemdidnot abolishbutonlydecreasedthee.ya~c~enomenonbyusingproeslrouspitatary.This suggeststhatparticipationofCa2maytakeplaceintheintrinsicreleaseofLH. TheaboveresultsindicatedthattheintrinsicrhythmofLHreleaseofisolated anteriorpituitaryglandisdifferentfromvariousreproductivehormonalconditionsand capableofbeingmodifiedbyexogenoushormones.Thephysiologicalfunctionofthe intrinsicrhythmofLHreleaseofanteriorpituitaryglandremainstobeelucidated. Keywonls:isolatedratanteriorpituitary;variousconditionsofreproductivehormone;intrinsic rhythmofLHrelease;time-seriesanalysis