原花青素对紫外线诱导晶状体上皮细胞氧化损伤保护作用研究

原花青素对紫外线诱导晶状体上皮细胞氧化损伤保护作用研究 原花青素对紫外线诱导晶状体上皮细胞氧化损伤保护 作用研究 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名: 盘李 日期: ， lqs(|々j 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即:研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容 保密内容除外 ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 日 期: 鲨丝:!:心 ,,YNl,四攀 目 录 一、摘要 中文论著摘 要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„”1 英文论著摘 要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„“3 二、英文缩略 语„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„‘5 三、论文 前 言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„”6 刖 舌„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„” 材料与方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„7 实验结 果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„11 讨 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„:„„„„?2l 结 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„23 四、本研究创新性自我评 价„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„24 五、参考文 献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„25 六、附录 综 述„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„27 在学期间科研成 绩„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。36 致 谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„37 个人简 介„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„38 ??中文论著摘要?? 原花青素对紫外线诱导晶状体上皮细胞 氧化损伤保护作用的研究 目 的 应用碱性单细胞凝胶电泳实验和流式细胞定量检测研究原花青素 epithelialcells，LECs DNA氧化损伤的保护作用，为原花青素临床治疗白内障提供 实验依据。 方法 将LECs传代培养取第4代细胞随机分为5组。未处理组:正常培养的LECs; C，VC 组: 0(2mg,m1 再分为3个亚实验组。各实验组于UVB照射前2小时加药，常规培养。 全培养1小时后收集细胞，分别用碱性单细胞凝胶电泳法计数分析不同处理组 LECs DNA单链断裂的程度和流式细胞定量检测分析各组细胞的凋亡率。 结 果 各PC组的尾长、尾部DNA,、尾力矩及LECs凋亡率与阳性对照组比较， 均有抵抗作用。各PC组的尾部DNA,、尾力矩与未处理组比较，差异均无统计 05 ，表明该浓度PC对LECs的氧化损伤有较强差异均无统计学意义 P 0( 的保 护作用。各抗氧化剂组问尾长、尾部DNA,、尾力矩和LECs凋亡率相比差异均 有统计学意义 P 0(01 ，且PC实验组的结果在数值上均明显小于牛磺酸和VC 实验组，即PC具有相对牛磺酸和VC而言更强的抗氧化保护作用。在一定浓度 范围内，各抗氧化剂组尾长、尾部DNA,、尾力矩和凋亡率随抗氧化剂浓度的增 大逐渐降低。 结论 外源性PC对UVB照射诱导的人LECsDNA的氧化损伤有保护作用。PC的 保护作用明显强于已研究证实的抗氧化剂TAU和VC，并且在一定浓度范围内随 着浓度的增加其抗氧化作用逐渐增强。 关键词 原花青素;紫外线;晶状体上皮细胞;DNA损伤 2 ??英文论著摘要?? The on of studyprotectionProcyanidinsagainst UV-inducedoxidativeof damage Lens cells epithelial Purpose Todeterminethe of UVB-inducedoxidative protectionprocyanidinsagainst oflens cells、析t lalkalinecell andflow damage epithelial singlegelelectrophoresis orderto all foundationforcataractclinical cytometry,inprovideexperimental treatment( Method Thelens of 4weredivided into epithelialcells LECs linesgeneration randomly 5 untreated cultured control groups(As group:normalLECs;positivegroup:normal cultured treatrd treated LECs+UVB;threegroups:PC TAUtreated treated groups:LECs+TAU+UVB;VC weredividedinto3 finalconcentration ofantioxidants tothe groups groupsaccording fromlowtohigh 0(05mg,ml，0(1 treatedwastreated mg,ml，O(2mg,m1 (Eachgroup by antioxidants2 beforeirradiatedunder conventional hours UVB，respectively,then cultivation(TheLECsoftreated and control wereallirradiated groupspositive groups atUVB-dose15mJ,cm2(AllofLECsin collectedaftertreatmentan every were group houL thenwere wimalkalinecell respectively,andanalyzed singlegelelectrophoresis andflow cytometry( Results 3 Thedifferencesoftail DNA,andtailmomem PC length,tail betweentreated and control were is groupspositive groupsstatisticallysignificant P O(01 ，which showedLECstreatedwitllPCCanresistantthe ofUVB(Thedifferencesof damages tail momemineachPCtreated anduntreatedwerenot DNA,，tail groups groups ratesof0(1 PCanduntreaded significant P o(05 (Theapoptosis mg,ml PC，0(2mg,ml havenosignificant indicatedthatPCinthose groups differences P 0(05 ，which concentrationsmore role oxidative onLECs(The playedprotective against damage differencesoftail DNA,andtailmomentinvarious length，tail antioxidanttreated were 1 (The functionsofPCtreated statisticallysignificant P 0(0 groups protective were thanthoseoftaurinetreated and groupssignificantlyhigher groupsVCtreated tail moment DNA,，tail and rateofvarious groups(Thelength,tail apoptosis antioxidanttreated alldecreasedwiththeconcentration groups along gradually increased( Conclusion PChas effecttoUVB-induced Exogeneticprotective DNA damage(The effectofPCWas thanthoseoftaurineand in a protective obviouslystronger VC，and cA!rtain of effectofPC rangeconcentration，the havethe protective possitive ofdose-effect( relationship Keywords cells;DNA Proeyanidins;Ultravioletrays;Lensepithelial damage 4 ??英文缩略语?? 5 ??论文?? 原花青素对紫外线诱导晶状体上皮细胞 氧化损伤保护作用的研究 刖 舌 白内障在全世界致盲眼病中居首位。自从证实氧化损伤是一个包括白内障 在内的许多年龄相关性疾病的共同启动因子，用化学方法延缓白内障发生或抑制 白内障的进展就显得非常有价值【lJ，特别是对白内障的预防具有重要意义。 流行病学调查和实验研究证实:长期慢性的紫外线辐射与年龄相关性白内障 的发生密切相判2,3】。1926年Duke(Elder首次提出日光辐射与白内障形 成有密切的 关系，一系列调查也发现白内障患病率与日照量呈正相关关系f4】。紫外线己被广 泛认为是引起白内障的一个主要因素，其对晶状体的影响是长期的、慢性蓄积的 氧化损伤过程。这种氧化损伤首先发生于上皮细胞，其光子造成晶状体上皮细胞 Lens cells，LECs DNA和膜泵的损伤而激活凋亡途径。透明晶状体 epithelial 存在的防御系统虽然有足够的保护作用，但当积累的效应超过一个临界水平时， 不可逆的损伤就发生了。因此，研究紫外线对晶状体上皮细胞DNA的损伤和修复， 寻找一种有效抑制紫外线引起晶状体上皮细胞DNA损伤的药物，延缓白内障 的形 成，对白内障的防治具有重要意义。 目前临床上对于白内障的治疗主要分为药物治疗和手术治疗，但是，应用中 的药物无论是滴眼液，还是口服的中西药，经临床验证都没有确切的治疗效果， 而手术治疗除了会增加患者的经济和精神负担，还相应的存在一些术后并发症和 风险性，因而一种有效抑制白内障发生、发展的药物就显得非常有价值。 原花青素 Procyanidins，PC 是一种在植物界广泛存在的多酚类化合物， 是现今研究最热门的新型高效抗氧化剂之一。到目前为止，PC是已发现的最强 效的自由基清除剂，具有非常强的体内活性【51。PC主要从葡萄籽中提取， 其在葡 6 萄籽提取物中含量最高可达95,，具有抗脂质过氧化和清除自由基、保护心血管 和预防高血压、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抗疲劳等功效[6,71。在体内，其抗氧 】，并吸收化、清除自由基的能力是维生素E的50倍、维生素C的20倍【8迅速、完全， 口服20分钟即可达到最高血液浓度，代谢半衰期达7d,时之久。由于其具有无毒、 高效抗氧化、容易获得的优点，可以作为防治白内障LECs氧化损伤的重要研究 物质。 本实验将人LECs作为研究对象，用中波紫外线 UltravioletB，UVB 制 备 氧化损伤模型，探讨新的可用于白内障防治的药物的可能性。稳定传代的细胞系 有利于实验观察，UVB又是到达眼部的紫外线中被认为生物损伤性最强、可以独 立致眼部白内障[21的一种紫外线，故本实验采用UVB作为氧化损伤因素，不仅明 确证实了其对于晶状体上皮细胞的强氧化损伤作用，而且为比较各抗氧化剂之间 保护作用的差异提供了一种良好的实验基础条件。本研究采用单细胞凝胶电泳实 验和流式细胞检测研究PC对UVB所致人晶状体上皮细胞DNA氧化损伤的保护和 C，VC 的保护 修复作用，并与牛磺酸 Taurine，TAU 和维生素C Vitamin 作用对比，藉以证实抗氧化剂PC对晶状体氧化损伤的保护作用。 材料与方法 一、实验材料 一 培养细胞 本实验选择人晶状体上皮细胞系SRAOI,04 购自中国科学院肿瘤研究 所 。 二 主要试剂和仪器 1 MEM培养液、胰蛋白酶、非必需氨基酸、胎牛血清、双抗 青霉素、 链霉素 :美I雪Hyclone生物公司产。 RNA酶和TritonX-100(美[雪sigrna生物工程公司产。 3 原花青素、牛磺酸、VC 分析纯 :成都生物制剂公司产。 4 UVB段紫外灯:XX(15N,F型，美国SP公司产。 7 5 电泳仪:HE(120型，Tanon公司产。 6 倒置荧光显微镜:BX51型，日本Olympus公司产。 二、实验方法 一 实验分组 将人LECs细胞系经传代培养取第4代细胞随机分为对照组和实验组。 对照组 再分未处理组和阳性对照组;实验组按不同抗氧化剂种类分为原花青素 PC 组、牛磺酸 nW 组和维生素C VC 组，各抗氧化剂组再按浓度进一步分别 分为3个亚组 如表1所示 。 二 M1vr比色实验 将传代生长良好的第3代LECs用O(25,胰蛋白酶消化，用含10,胎牛血 清的完全培养液调整细胞浓度为2×104个,mL，接种于96孑L培养板中，每孔 180lJL。四周的36个孔加入灭菌PBS以饱和中间60个孔的水分，以免发生由 于细胞培养过程中边孔的水分蒸发过快、药液浓缩而导致的“边缘效应"。置 入细胞培养箱，培养24h静待细胞贴壁;细胞贴壁后分别加入PBS溶液 对照组 u 和预先配制的PC溶液 实验组 各20l，使各PC组的终浓度为0(Ol、O(02、0(05、 0(1、O(2、0(5、l、2、5mg,mL;培养24h后，弃去培养液，PBS轻柔洗两次， p u h l、单纯MEM培养液80l，继续培养4 每孔加入5mg,ml的MTT溶液20 后中止培养，吸去孔内培养上清液，加入150ul二甲基亚砜，室温下脱色摇床 振荡10rain，在酶标仪570nm处测量各孔的吸光值。并计算细胞存活率和细胞 抑制率。重复实验三次，经MTT比色法测定计算，将PC实验浓度确定为0(05、 O(1、0(2mg,ml。结合相关文献资料，为利于实验结果比较，将TAU和VC组的 浓度也都确定为O(05、0(1、0(2mg,ml。 8 表1，实验分组 分组 处理因素 正常培养的LECs 对照组 翥茬筹熹组 正常培养的 LECs+UVB PC+UVB 0(05mg,ml LECs+0(05mg,ml PC组 LECs+0(1PC+UVB 0(1mg,ml mg,ml PC+UVB 0(2mg,ml LECs+0(2mg,ml TAU+UVB 0(05mg,ml LECs+0(05mg,ml LECs+0(1TAU+UVB 实验组TAU组 0(1mg,ml mg,ml TAU+UVB 0(2mg,ml LECs+0(2mg,ml VC+UVB O(05mg,ml LECs+0(05mg,ml VC组 0(1 LECs+0(1VC+UVB mg,ml mg,ml LECs+0(1 0(2mg,ml mg,mlVC+UVB 三 细胞培养 使用含10,胎牛血清、非必需氨基酸、5,双抗的MEM完全培养液，在37?、 5,C02、90,湿度的孵箱中人LECs单层贴壁生长。 取第四代人LECs，分别计数细胞约lxl04,m1种植于各培养皿中。待细胞生 长融合至90,培养基，换成不含血清的MEM培养基，于37?、5,C02培养箱 中再孵育24h，使细胞生长同步进入休止期。实验开始前，弃去培养液，并用PBS 轻柔洗2次，分别加入终浓度为分组中抗氧化剂浓度的完全培养液，对照组 和未处理组加入PBS和完全培养液。孵箱中继续常规培养2小时。 四 紫外线照射 次使用前都预先经紫外线仪器测量，通过适当调整距离使照射强度一致性，避免 由于衰减造成的强度不统一 ，照射时间为10s，即采用的照射剂量为15mJ,cm2。 取出实验分组培养后的细胞，经PBS轻柔冲洗2次，弃去液体，将各实验组和阳 性对照组的细胞培养皿置于暗室中紫外光源下10cm处，照射时打开培养皿。照 射后加入完全培养液，孵箱内继续培养1h。 五 碱性单细胞凝胶电泳 SCGE 检测 1、铺胶 细胞取出后用冰冷的PBS洗2次，离心收集细胞，消化后制备单细胞悬液 稀 9 释成约2X104,m1 。下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS配制。第1层凝胶的制备: la 将加热熔解的0(8,的正常熔点琼脂糖冷至45--60"C。取100l滴加在经多聚赖氨 酸预处理的载玻片上，用盖玻片使胶均匀展开，在酒精灯上略过火，使正常熔点 琼脂糖完全凝固于玻片上，注意过火的时间和位置，以免导致玻片炸裂。第2层 凝胶的制备:再次滴加与第一次相同的正常熔点琼脂糖，盖玻片使胶均匀展开后 4。C下固化10min。第3层胶的制备:低熔点琼脂糖凝胶在60,70。C水浴加热至少 20min使之完全溶化，冷却至37。C 可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37 u ?，低熔点琼脂糖在37。C可维持3d'时 。将25 l单细胞悬液 约104个 和75 pl的低熔点琼脂糖混合均匀后迅速滴加到第2层胶上，立即盖上另一干净盖玻 片，置4?下10min使凝固。 2、细胞裂解 移去盖玻片，将凝胶载玻片浸没于新配置的裂解液 pH 10 中，4。C下 裂 解2h，除去细胞浆。取出载玻片用PBS轻柔漂洗2次。 3、DNA解旋 将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的电泳缓冲液约覆过载玻片胶面 0(25cm左右，4。C冰箱内避光解旋20min 1mmol,L NaOH， 300mmoUL Na2EDTA， PH 13 ，以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA断链 在电场中易于迁移。 4、细胞电泳 25V电压、4。C冰箱内避光条件下电泳15min。电泳后将载玻片置于平皿内。 用PBS浸泡漂洗2次，每次5min。 5、染色 la 0min。 每张载玻片JJN2―3滴5 g,ml染色剂EB，盖上盖玻片，4。C下避光染色 1 6、观察、拍照和分析 1 染色后的凝胶载玻片，置于倒置荧光显微镜装置下调至55(560nm 绿 光 波长的激发光，可清晰的观察到核DNA和迁移的DNA。每个实验组随机计数 100 10 个细胞，用单细胞凝胶电泳分析软件TriTekCometScore进行图像分析，计量尾长、 尾部DNA,和尾力矩。 六 流式细胞定量检测 取第5代人LECs细胞传代培养。细胞分组方式、处理因素和照射制模条件均 同上。照射处理后的细胞经PBS冲洗2次，胰酶EDTA消化，制成细胞密度为lxl06 min，弃上清液，加入95,冰乙醇 -20。C冰箱内预冷 胞，再次1200转,min离心5 lal 每管内加入500PBS，再次重悬计数细胞，并予1200转,min离一t二,5min 后弃上清， 度为lxl0S,mi，4。C避光染色1小时，上机自动检测细胞凋亡率。以上实验在同样 条件下重复3次，取平均值。 三、统计学处理 数据资料以X?S表示，应用SPSSl6(0统计学软件进行随机样本的单因 素方差分析，P 0(05为差异有统计学意义。 实验结果 一、实验结果观察 一 单细胞凝胶电泳实验细胞形态学观察 实验中观察到细胞分布适中，DNA较均匀，清楚地反映了细胞的损伤 情况。各实验组细胞呈不同程度的彗星图像，头尾分明。 图l，倒置荧光显微镜下细胞形态学观察 C3:PC O(2mg,m1 组:D1:TAU O(05mg,m1 组;D2:TAU O(1mg,m1 组; 1:vc o(05mg,m1 组;E2:vc o(1mg,m1 组;E3: D3:TAU O(2mg,m1 组;E vc o(2mg,m1 组。 照片可见电泳时未损伤的DNA部分保持球形，而损伤的单链DNA片断从细 胞核中溢出，在电场中向阳极方向迁移泳动，二者形成了头尾分明，酷似“彗星" 的图像。未处理组LECs呈圆形基本无拖尾、保持较完整的拟核状态，表明 细胞基本未受损伤 图l，A 。阳性对照组LECs从胞核中溢出的单链DNA 12 片段最多，表现为尾部长度最长、面积最大、荧光强度最强，说明细胞受损 伤较重 图1，B 。各实验组可见尾长、尾部荧光强度较阳性对照组短、弱 图l，C、D、E ，说明细胞的损伤程度也较其轻，即各抗氧化剂均起到一 定的保护作用。相同浓度时，PC组、TAU组和VC组LECs尾长逐渐增加，尾 部荧光强度逐渐增大。各抗氧化剂在一定浓度范围内均有随其浓度增加，对 LECs的保护作用逐渐增强的趋势。 二 流式细胞定量检测各实验组细胞凋亡率 Untreated组 Control组 蓉泐 日 等k s量; 重寥 曼爵 l I 瞳幽 刈 ? ，一- 醚盆 j 厶―警 PC 0(05mg,m1 缍[PC 0(1 量等o 鹭喾一 i萝 i万 I虿 J I k，衫圣， J啕 ,1，?1叫 ――一 嵫 TAU O(05mg,m1 组TAU O(1 量嚣o l孑 ， ? , vc o(05mg,m1 组 vc o(2mg,m1 组 vc o(1mg,m1 组 图2，各实验组晶状体上皮细胞凋亡率比较 该流式细胞检测结果图是各样本经流式细胞仪检测后直接输出的模式图， 其中蓝色区域代表各样本全部细胞中凋亡细胞所占的比率 Apoptosis表示 。 通过比较各组LECs的凋亡率，可以反映各组细胞所受损伤大小的情况。由图 可见，未处理组LECs凋亡率接近0，即细胞未受任何损伤 图2，Untread组 。 图2，Conwol 阳性对照组LECs凋亡部分所占比例最大，表明其受损伤最重 组 。各抗氧化剂组的LECs凋亡率均小于阳性对照组 图2，PC组、TAU组、 VC组 ，即各抗氧化剂对保护LECs均有效。相同浓度时，PC组、TAU组和 VC组LECs凋亡率逐渐增大。各抗氧化剂在一定浓度范围内均有随其浓度 增加，细胞凋亡率逐渐降低的趋势。 二、原花青素对紫外线诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤 的保护作用 14 一 碱性单细胞凝胶电泳 SCGE 实验结果 表2，不同处理组单细胞凝胶电泳实验指标的比较 X?S 尾长、尾部DNA,和尾力矩是目前应用较广泛的评价SCGE检测实验qbDNA 损伤的指标。由于尾力矩是由尾长和尾部DNA,一--者共同决定的，目前已经逐渐 取代尾长成为SCGE实验更具有代表性的检测指标。 表3，不同处理组单细胞凝胶电泳实验指标的比较 注:Pl示阳性对照组和各PC组与未处理组比较的P值，P2示各PC组与阳性对 照组比较的P值。 售 V 益 图3，不同处理组单细胞凝胶电泳尾长的比较 15 注:PC 1:PC 0(05mg,m1 组;PC2:PC 0(1mg,m1 组;PC3:PC O(2mg,m1 组。 未处理组尾长明显小于阳性对照组，两组尾长比较，差异有统计学意义 小于阳性对照组，并且各PC组与阳性对照组尾长比较，差异均有统计学意义 P 0(01 ;各PC组尾长均大于未处理组，各PC组与未处理组尾长比较差异均有 护作用。 臀”_h柳'“,?:‖“一× 加 (， 【7。。“9j ”,7“’’7”7一一一’‘i蔼 蛤 m ? ^, vI叁蘸 蔼 5 黝批7 纠?MW#F目l$7# 么渤麓缴滋燃 o 图4，不同处理组单细胞凝胶电泳尾部DNA,的比较 未处理组尾部DNA,明显小于阳性对照组，两组尾部DNA,L匕较，差异有统 部DNA,均明显小于阳性对照组，并且各PC实验组与阳性对照组尾部DNA,L匕 较，差异均有统计学意义 P 0(01 ，说明三种浓度的PC对于UVB导致的LECs 氧化损伤均有保护作用。各PC组与未处理组尾部DNA,比较差异均无统计学意 义 P o(05 ，表明各PC组对于UVB诱导的LECs氧化损伤均有较好的保护作用。 16 图5，不同处理组单细胞凝胶电泳尾力矩比较 未处理组尾力矩明显小于阳性对照组，两组尾力矩比较，差异有统计学意义 显小于阳性对照组，并且各PC组与阳性对照组尾力矩比较，差异均有统计学意 P 0(01 ，说明三种浓度的PC对于UVB导致的LECs氧化损伤均有保护义 作用。 各PC组与未处理组尾力矩比较差异均无统计学意义 P 0(05 ，表明各PC组对于 UVB诱导的LECs氧化损伤均有较好的保护作用。 从数值上看，各PC组尾长、尾部DNA,和尾力矩均随其浓度的增加逐渐减 小，即在一定的浓度范围内，PC的抗氧化作用强度随其浓度的增加逐渐增 强。 二 流式细胞定量检测结果 细胞凋亡率检测能够反映总体细胞的损伤程度，人LECs凋亡是各类白内障 发病的共同细胞学基础，因此，测定LECs的凋亡率可以反映细胞总体的氧化损 伤情况。表现为损伤越重，细胞凋亡率越大。 表3，不同处理组晶状体上皮细胞凋亡率比较 X?S 17 注:Pl示阳性对照组和各PC组与未处理组比较的P值，P2示各PC组与阳性对 照组比较的P值。 ^毋v君露 图6，不同处理组晶状体上皮细胞凋亡率比较 未处理组的LECs凋亡率明显小于阳性对照组，未处理组与阳性对照组比较 差异有统计学意义 P 0(01 ，说明UVB对于LECs具有明确的独立致损伤作用。 各PC组的LECs凋亡率均明显小于阳性对照组，且与阳性对照组比较，差异 均有保护作用。 PC组与未处理组的细胞凋亡率比较，三者间差异均无 0(1mg,ml、0(2mg,ml 较强的保护作用。 各PC组数据均随其浓度的增加逐渐减小，即在一定的浓度范围内，PC 的抗 氧化作用强度随其浓度的增加逐渐增强。 三、不同抗氧化剂对人晶状体上皮细胞氧化损伤保护作用 的比较 一 碱性单细胞凝胶电泳 SCGE 实验结果比较 18 表4，各实验组单细胞凝胶电泳实验指标的比较 X?S 鲁 V ?Pc ?TAU 遴 口vc oang,nl 图7，各抗氧化剂组单细胞凝胶电泳尾长比较 ^'6v S吞舄讴枷瓯 图8，各抗氧化剂组单细胞凝胶电泳尾部DNA,比较 19 ?Pc ?TAU 口 VC 图9，各抗氧化剂组单细胞凝胶电泳尾力矩比较 相同浓度各抗氧化剂组间比较，差异均有统计学意义 P 0(01 ，说明三种 抗氧化剂对LECs氧化损伤的保护作用不同。从数值上看，三者的保护作用从 各组均可见随其浓度增大，尾长、尾部DNA,、尾力矩逐渐减小，VC组当浓 度增大到一定程度 O(2mg,m1 时，效果相反。说明在一定浓度范围内，增大 抗氧化剂浓度会增强其抗氧化作用。 二 流式细胞定量检测结果 表5，各抗氧化剂组间LECs凋亡率的比较 X?S 注:P示相同浓度下PC与另两种抗氧化剂LECs凋亡率的比较。 ^, 肆n髫 图10，各抗氧化剂组LECs凋亡率比较 相同浓度条件下，PC组LECs凋亡率小于其他抗氧化剂组。PC与TAU UVB诱导的LECs氧化损伤具有更强的保护作用。 LECs凋亡率比较，三种抗氧化剂的保护作用从PC到VC逐渐减弱，即PC 对LECs的保护作用比VC和TAU更强。 讨 论 白内障为全世界首位致盲眼病，目前我国白内障患者视力低于O-3的约有 500万人，并以每年40-一120万例的数目累积增长。调查显示高原地区白内障 发病率明显高于平原，流行病学调查和实验研究证实长期慢性的紫外线辐射与 年龄相关性白内障的发生密切相关‘2捌。因此，探讨紫外线相关性白内障的发病 机理及寻求有效的治疗药物具有重要意义。 白内障的发生是多种因素综合作用的结果，其中最具有普遍意义的环节便是 氧化损伤。许多研究表明晶状体的氧化损伤发生在晶状体混浊之前，且氧自由基 最先损害的靶目标是晶状体上皮细胞【9】，其次是晶状体纤维，蛋白质和脂质过氧 化，发生交联、变性，并聚积成大分子，最终形成白内障。 体可吸收绝大部分到达眼部的UVB。本实验选择UVB段紫外灯，有针对性的复 21 制LECs的氧化损伤模型，进一步证实了UVB对LECs的氧化损伤作用。通过未处 理组和阳性对照组比较的显著性差异 P O(01 ，明确了UVB的独立致损伤作用， 及采用该因素制模的可行性。 本实验各检测指标PC组与阳性对照组比较差异均有统计学意义 P 0(01 ， 且经PC预处理的人LECs接受UVB照射后细胞损伤程度和总体凋亡率都明显低于 未加任何预处理的阳性对照组细胞，表明PC是一种对UVB所致的人LECs损伤具 有保护作用的强效抗氧化剂。 两个实验均证实浓度为0(1mg,ml和0(2mg,ml的PC实验组，检测 结果与未处理 组比较，差异均无统计学意义 P 0(05 ，表明该浓度的PC对人LECs具有较强 的保护作用。以往已有实验证实PC在白内障方面的应用，Durukan等【旧】在用亚硒 酸钠致大鼠白内障模型的研究中，发现PC能有效的抑制白内障的发生。Osakabe 等Ill】用可可豆提取物PC作用于糖尿病性白内障的大鼠，亦发现其具有良好的抗 糖尿病鼠白内障发生的效果。本实验将PC应用于UVB致损伤的人LECs上，明确 了在体外培养条件下PC对LECs的保护作用，以及对白内障的预防作用。 本研究采用两种实验方法，目的是为了更好的验证PC对UVB诱导的LECs损 伤的保护作用。近年来，碱性SCGE实验因其对DNA损伤的高敏感性和所需样品 细胞数量少等优点越来越广泛的应用于有核细胞DNA断裂的检测实验中，实验结 果中LECs的损伤主要表现为移入尾部的DNA片段增加，尾部荧光强度增强。而流 式细胞定量检测是在宏观领域，即细胞收集量达到一定标准时可用于检测整体细 胞凋亡情况的实验方法。将两个实验结合起来，有利于更好的研究PC对于LECs 的保护作用。本研究中，二者结果的趋势基本相同，但是两个实验对于0(05mg,ml PC组与未处理组比较的差异有差别，分析可能是由于碱性SCGE具有主观性因素 所致。 SCGE实验成功与否的最关键步骤就在于铺胶，有时轻柔操作尚无法避免脱 胶，针对这一问，本实验在铺胶方法上作了一些改良，与以往文献记载不同， 本实验增加了经多聚赖氨酸预处理和正常熔点琼脂糖凝胶铺胶过火两个步骤，事 实证明该改良方法确实减少了脱胶问题的出现，又未对实验结果产生明显影响， 明显提高了实验的成功率，希望对完善和改进该实验步骤会有一定帮助作用。 在以往的研究中，牛磺酸和VC对LECs氧化损伤的保护作用均已得到明确证 实‘12,13]，本实验将Pc对人LECs的保护作用与牛磺酸和VC作对比，三者的差异具 有统计学意义，表明其抗氧化作用强度不同。从数值上看，PC各实验组的细胞 损伤情况均明显小于同剂量组的另两种抗氧化剂，明确证实了PC对于LECs的保 护作用明显强于牛磺酸和VC。并且实验发现PC的抗氧化作用呈现浓度依赖的量 效关系，即在一定范围内随浓度的增加，PC对于LECs的保护作用逐渐增强。 原花青素是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮，是目前国际上公认的 清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂，广泛分布在葡萄、银杏等多种植 物中。其抗氧化能力是维生素E的50倍，维生素C的20倍【8J。在抗肿瘤【61、保护 心血管‘141及对其它药物的协同作用【15】等方面有很好的效果。 本研究结果显示PC对于紫外线导致的晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用 明显强于牛磺酸和VC。目前国内外已经逐步将PC抗炎、抗氧化、调节免疫等相 关作用应用于眼科的研究中，并初步证实其在葡萄膜炎【16】、保护角膜基质细胞【171 和视网膜神经血管疾病【18,19]等方面的应用。已有临床证实PC眼用剂型对于干眼症 的确切治疗作用【201，这也让我们看NYPc的巨大研究价值和发展潜力。但对于 PC如何进入眼内发挥抗氧化作用，哪些有效成分起主要作用及有效质量浓度等 问题还有待进一步探讨。希望通过更深入的研究，在不久的将来能为白内障的临 床治疗提供一种有效的药物。 结论 外源性PC对UVB照射诱导的人LECsDNA的氧化损伤有保护作用。PC 的保护作用明显强于已研究证实的抗氧化剂牛磺酸和VC，并且在一定浓度范 围内随着浓度的增加其抗氧化作用逐渐增强。 ??本研究创新性的自我评价?? 根据白内障的发病机理，开发有效的拮抗人晶状体上皮细胞氧化损伤作用的 抗氧化剂是进行白内障药物防治的一种有效手段。本实验探讨了已应用于抗肿 瘤、保护心血管、美容等领域的原花青素对于UVB导致的晶状体上皮细胞损伤的 保护作用，证实其作用优于已研究证实的抗氧化剂牛磺酸和维生素C，且在一定 范围内，随浓度的增加，其保护作用逐渐增强。本实验结果为原花青素今后 在白 内障临床治疗上提供了实验依据。 ??参考文献?? 1 G，ChandaniS，Sundaria1(Antioxidant Thiagarajan CS，et andblack propertiesofgreen tea andtheir toretard potential the lens ability progressionofeye EyeRes， 2001，72: cataract(Exp 393-401( 2 Shui YB，Sasald observation H，Pan?，et oncelldeath a1(Morpological and phagocytosis inducedultravioletirradiationina by culturedhumanlens cell epithelial line(ExpRes， Eye 2000，71:609-618( 3江南(紫外线辐射和白内障的研究【J】(国外医学眼科学分册，1999， 23:243(250( 4 Dovral oflens A，Weinreb and O(Recoveryoptics afterultraviolet epithelialenzymes Aradiation(Invest Vis 1 OphthalmolSci,1995，36:247(2424( 5 Saada HN，Said seedextractVitisvinifera UZ，MekyNH，eta1(Grape protectsagainst radiation-inducedoxidativeandmetabolic damage disordersin Res(2009 rats(PhytotherMar, 23 3 :434_438( 6 X W Y Y，LiG，WuJ，et from seeds Zhang a1(Proanthocyanidin anti(tumor grape potentiate ofdoxorubicinvia mechanism(hat activity immunomodulatory Immunopharmacol， 2005， 5 7-8 :1247??1257( 】(食品与药品，2005，7 2 :59(61( 7王建平(葡萄籽提取物的神奇功效【J 8 Bagchi M，StohsS，eta1(Cellular with D，Bagchi protection derivedfrom proanthocyanidins seeds(AnnY N Acad grape Sci，2002，957:260―270( 9 Kleiman A(UltravioletinducedDNA NJ，WangRR,Spector and light damagerepair inbovinelens cells(Curr epithelial 185(1193( EyeRes，1990，9 12 :l 10BagchiD，Sen a1(Molecularmechanisms CK,RaySD，et anovel ofcardioprotectionby grape seed extract(Mutat proanthocyanidinRes，2003，523(524:87―97( 1lJourdain C，Tenca a1(In―vitroeffects A(et of forcocoaand Deguercy polyphenols G， beta-sitosterolon the ofhuman caner growth prostateandnormalcell(EurJCancer Prey， 2006， 15 4 :353??361( 12Chen C(An F，Chen researchoftaurineOn experimental H202(inducedbovinelens epithelial cell YanKeZaZhi(2000 apoptosis(Zhonghua Jul，36 4 :272(274( 13罗文娟，阎洪禄，王传富(维生素c抑制晶状体上皮细胞凋亡的实验研究【J】(实验研究， 2004 April，22 2 :148―151( 4 1 Zhu effectsofcocoaflavanolsand QY，HoltRR,LazarusSA，et a1(Inhibitory procyanidin onfreerasical-induced Biol oligomers erythrocyte Med Maywood ， 2002， hemolysis(Exp 1??329( 227 5 :32 15Faria Freitasa,(Modulation inCaeo-2 A，MateusN，de V，et by ofMPP+uptakeprocyandins cells:involvementofoxidation,reductionreaction(FEBS Lett,2006，580 1 : 155-160( 16 et EffectsofAroniaExtractonRat K，llievaI，ShiratofiK Ohgami a1(Anti-inflammatory Endotoxin-Induced Uveitis(InvestVis 1( OphthalmolSci，2005，46:275-28 17Robert of G(Effect oncorneal AM，RobertL，Renard procyanidolicoligomrs collagen fibrillogenesis(FrOphtalmol，2005，28 10 :1017-1025( 18Sano a1(Anti-thromboticeffectof T，OdaE，YamashitaT，et proanthocyanidin,apurified seed(Thromb 15-121( ingredientofgrape Res，2005，115 1-2 :1 19 NN(Oxidative-inducedisattenuated ZhangB，Osbom retin却 degenerationbyepigallocatechin 76―187( gallate(BrainRes，2006，8 12 :1 20孙禹，原慧萍，周欣荣(原花青素眼用剂型的临床应用及对干眼症的影响【J](哈尔滨医科 大学学报，2009，43 3 :268(274( ??综述?? 原花青素对紫外线诱导晶状体上皮细胞 氧化损伤的保护作用研究进展 白内障为全世界首位致盲眼病，高原地区白内障发病率明显高于平原，流行 病学调查和实验研究证实长期慢性的紫外线辐射与年龄相关性白内障的发生密 切相关。随着DNA损伤与修复的研究向各生命学科的渗透和分子生物学的新 技术 应用，白内障和晶状体上皮细胞DNA氧化损伤与修复成了白内障发病机理研究新 热点。已有实验证实原花青素对晶状体上皮的氧化损伤具有明确的抑制和减少 DNA损伤的作用。然而原花青素在眼科尤其是白内障的应用还处于实验性研究阶 段。现就该方面的研究进展综述如下。 一、紫外线与白内障发病机理的流行病学调查 白内障在全世界致盲眼病中居首位，目前我国白内障患者视力低于0(3的约 有500万人，并以每年 40"-'120 万例的数目累积增长。青海省地处高原地区，约 有60,的面积海拔在4000米以上，白内障的发病率明显高于内地，据文献 报告西 藏地区白内障发病率为14(6, 青海尚无报道 ，比其它地区 相同年龄和性别人121 的白内障发病率 约高出60,，因此探讨紫外线与高原地区白内障的发病机理具有 重要意义。 Elder首次提出日光辐射与白内障形成的关系密切，流 1926年Duke( 行病学调 查也发现白内障患病率与日照量呈正相关关系【11。紫外线是一种电磁波，穿越大 气层时，由于臭氧层的存在，200nm至400nm的大部分短波紫外线被吸收，为人 类提供了一个良好的防护短波紫外线的安全屏障。近几十年来，由于工业污染导 致了臭氧层的急剧破坏，使地面紫外线辐射水平大幅度增加，人类和动物的生存 环境受到了严重的威胁。自然界中的紫外线来源于太阳光，眼组织对不同波长的 吸收特性和生物效应不同，即波长越短，单个光子能量越大，穿透眼组织能力越 弱，根据生物学作用，自然界中的紫外线可分为短波紫外线 Ultraviolet C，uvc 、 27 B，UVB 、长波紫外线 UltravioletA，trVA ，波长分别为 中波紫外线 Ultraviolet 素影响，如大气臭氧、空气浑浊度、纬度、海拔高度、日照时间及周围环境的反 射等。大气臭氧对紫外线有一定的滤过作用，将波长小于290nm的紫外线 UVC 全部吸收，射入地面的是UVB和UVA[2捌。因此，UVB和UVA是阳光的主要成分， 臭氧层是UVB辐射最主要的平流屏障，大气中臭氧层减少将会导致环境中UVB 辐射增加[41。工作环境如工业、医疗及食品行业中广泛存在着人工紫外线，它们 主要来源于电焊弧光、水银蒸汽和钨弧光。包括UVA、UVB、UVC--个区段的 紫外线。紫外线辐射引起的广泛的、潜在的作用引起人们广泛重视，尤其对眼的 影响。 众所周知，是由臭氧层的减少和紫外线辐射的增加，导致白内障更高的发病 率。有人估计臭氧层减少1,的厚度，白内障的发病率就会增加0(7,?0(1,。流 行病学研究表明:环境中的UVB辐射量和人群中的白内障的发病率呈正相关。紫 外线对晶状体的影响是长期的，慢性蓄积的氧化损伤过程。透明晶状体存在的防 御系统虽然有足够的保护作用，但当积累的效应超过一个临界水平，不可逆转的 损伤就发生了。 二、紫外线对晶状体上皮细胞的损伤 到达地表的紫外线中，部分UVB被角膜吸收，其余的UVA和UVB可穿过角 膜和房水被晶状体吸收。Dovart等【5】研究表明，夏季地球温带地区中午每小时可 7,的 倍，且70,'-'80,的紫外线通过角膜几乎全部被晶状体所吸收。晶状体代谢最活 跃的部位是晶状体上皮细胞，而DNA又是晶状体上皮细胞损伤的最薄弱的靶子之 一。紫外线氧化损伤首先发生于上皮细胞，其光子造成晶状体上皮细胞DNA和膜 泵的损伤而激活凋亡途径。近年来Li等【61分别用过氧化氢、钙离子透入及紫外线 照射诱发白内障的晶状体离体实验中，首次晶状体混浊前均有上皮细胞的凋亡。 由此可见，晶状体上皮细胞凋亡是发生在晶状体混浊之前，从而说明晶状体上皮 细胞凋亡是白内障形成的早期事件，也是各种白内障发生的共同细胞学基础 【(71。 紫外线诱发体外培养的晶状体上皮细胞凋亡的作用机制尚未明了，研究表明 可能有以下三种途径:?通过与细胞内外成分的光化学反应产生各种氧活性集团 H202、02等，升高细胞氧化水平，直接损伤染色体，从而诱导细胞凋亡【8】; ?光氧化产生的活性氧自由基诱发晶状体上皮细胞凋亡。紫外线可能引起 PGE(2、激酶和离子等细胞内外成分改变，并通过受体或非受体的途径影响细胞 的生理状态和代谢【9，10】;?细胞核内C―fos基因延长表达。C―_fos原癌基因是一 个瞬息基因，其特征为静止细胞在受到外界丝裂原刺激时能快速瞬间的表达。持 续表达的C―fos基因是程序性细胞死亡的标志。在上述因素中，氧化作用 在紫外 线照射诱发晶状体上皮细胞凋亡中起着最为重要的作用 三、抗氧化剂原花青素的研究现状 葡萄是世界上产量最大的水果之一，年产量约为6500万吨，其中80,用于酿 酒、13,作为鲜果食用、7,用于加工果汁及其它葡萄产品。我国葡萄年产量约 有200多万吨，其中40,作为鲜果食用，40,用于酿酒，20,用于加工葡萄干、 果汁等制品。葡萄中含有大量以植物多酚为主的生物活性物质，如白黎芦醇、酚 酸、黄酮、儿茶素、表儿茶素、原花青素等，具有抗脂质过氧化和清除自由基、 保护心血管和预防高血压、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抗疲劳等功效。其中 研 究最多的生物活性物质是原花青素 procyanidins，PC 。 一 原花青素的化学结构与性质 原花青素是由不同数量的儿茶素、表儿茶素或没食子酸缩合而成，最简单的 原花青素是儿茶素与表儿茶素形成的二聚体、三聚体、四聚体等直至十聚体。根 据聚合度的大小，通常将2~4聚体称为低聚原花青素 oligomersprocyanidolic， OPC ，将5聚体以上的称为高聚体 polymers 物质 PPC水溶性较差 ，极易吸收，其清除自由基的能力与分子结构和聚合度有 关【I?。根据缩合键位的不同，可将原花青素寡聚物分为A、B、C、T、D等几类， 如葡萄耔中的原花青素主要是B型、C型和T型。二聚体在各类原花青素中分布最 广，抗氧化活性最强，是最重要的一类。二聚体中，因2个单体的构象或缩合键 位的不同有多种异构体，已分离鉴定的8种异构体命名为B1,B8，其中B1~B4由 29 C4--C8键合，B5,B8由C4--C6键合。 原花青素分子中具有多电子的羟基部分，8个酚羟基 Jh茶素 均与双键共轭， 为氢原子的供体，且芳环上的共轭双键使电子在分子中稳定，2个脂肪族羟基使 其具有良好水溶性，正是这些分子结构特点使其具有良好的清除自由基和抗氧化 的活性。 二 原花青素的药理学作用