酸奶中乳酸菌的微生物学检测与酸奶的制作

酸奶中乳酸菌的微生物学检测与酸奶的制作 乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验与酸奶的制作 摘 要 本实验选用达能酸奶作为材料，通过制作改良MC和改良TJA两种培养基，观察分析比较达能酸奶在两种培养基中生成菌落的异同，并以达能酸奶作为菌源接种到奶粉液中制作酸奶，对所得酸奶进行感官评定，讨论影响菌落生成及酸奶感官的因素。 关键词:酸奶 乳酸菌 菌落形态 菌落总数 感官评价 前 言 酸奶为纯绿色食品, 它是由牛奶经乳酸菌发酵制成的, 除具有鲜牛奶的营养价值外, 因内含乳酸菌并在发酵过程中产生乳酸及B族维生素(B、B、B)等, 2612可促进人体消化呼吸, 提高人的免疫力, 长期饮用既可保证钙质的需求, 又可 [1]健肠胃, 调节人体代谢,提高人的抗病能力, 使人健康长寿。酸奶中的乳酸菌主要有乳杆菌、双歧杆菌和片球菌三个属，它们能够定植在人体内，起到改善营 [2]养健康状况、改善胃肠道功能、改善免疫能力、抗有害菌和抗衰老的作用。对酸奶中的这些益生菌进行研究，有助于了解酸奶的保健原理，对制作更加营养、更优质的酸奶具有指导意义。 1 材料与方法 1. 1 仪器与材料 1. 1. 1 仪器 玻璃瓶(无盖，2个)，电磁炉(带不锈钢锅)，不锈钢杯，移液管及移液管筒，电子天平，量筒，具塞锥形瓶(带玻珠，3个)，具塞试管(7支)，培养皿(16个)，接种环，酒精灯，载玻片(4片)，光学显微镜。 1. 1. 2 材料 达能酸奶，脱脂奶粉，白砂糖，MC培养基粉末，TJA培养基粉末，擦镜纸，吸水纸，牛皮纸，保鲜膜，橡皮筋。 1. 2 培养基和试剂 1. 2. 1 改良MC培养基,每升, 大豆蛋白胨5g，牛肉膏粉5g，酵母膏粉5g，葡萄糖20g，乳糖20g，碳酸钙10g，琼脂15g，中性红0.05g，最终pH6.0?0.2。 [3]1. 2. 2 改良TJA培养基,每升, 番茄汁50mL，酵母抽提液5g，肉膏10g，乳糖20g，葡萄糖2g，KHPO 2g，24吐温-80 1g，乙酸钠5g，琼脂15g，最终pH6.8?0.2。 1. 2. 3 试剂 蒸馏水，结晶紫染液，卢氏碘液，95%的乙醇溶液，番红染液，香柏油，二甲苯。 1. 3 方法 1. 3. 1 无菌水和培养基的制备 1、无菌水的制备:量取90mL自来水于带玻珠的具塞锥形瓶中，用牛皮纸和橡皮筋封口;用7支具塞试管分别量取9mL自来水，用牛皮纸封口并用橡皮筋捆成一束。上述锥形瓶和试管在121?下灭菌15min备用。 2、改良MC培养基的制备:称取16g改良MC培养基粉末置于不锈钢杯中，加入200mL蒸馏水，加热使其溶解完全，倒进具塞锥形瓶中用牛皮纸和橡皮筋封口，在121?下灭菌15min备用。 3、改良TJA培养基的制备:称取12g改良TJA培养基粉末置于不锈钢杯中，加入190mL蒸馏水和10mL番茄汁，加热使其溶解完全，倒进具塞锥形瓶中用牛皮纸和橡皮筋封口，在121?下灭菌15min备用。 1. 3. 2 乳酸菌的分离和培养 1、稀释平板分离:在无菌操作下，用移液管吸取10mL达能酸奶于冷却至45? -1-1左右的90mL无菌水中，振荡混合，制得10稀释度的菌液。再从10稀释度的菌液 -2中吸取1mL置于另一装有9mL无菌水的试管中，制得10稀释度的菌液。用上述方 -3-4-5-6-7-8法重复操作，分别制得10、10、10、10、10、10稀释度的菌液。待两种培 -6-7-8养基冷却至45?左右时，取10、10、10这三种稀释度的菌液，用移液管吸取每一种菌液0.2mL滴在四个培养皿中央，然后分别向其中两个培养皿倒入15mL改良MC培养基，向另外两个倒入15mL改良TJA培养基，摇匀静置使其凝固，一共制 作12个平板。 2、划线分离:在无菌操作下，用冷却至45?的改良MC培养基倒两个平板(每个15mL)，再用同样温度的改良TJA培养基倒两个平板(每个15mL)，静置使其凝固。待四个平板完全凝固后，用接种环蘸取一环达能酸奶，分别在四个平板上划线。 3、待上述平板完全凝固后，将培养皿倒置并用报纸包好，于28?室温下培养24h左右。 1. 3. 3 乳酸菌菌落形态观察 培养完成后，取用“划线分离”法制作的四个平板， 观察在培养基表面形成菌落的形状、颜色、表面光滑程度、质地、大小，并作好记录。 1. 3. 4 菌落计数 培养完成后，取用“稀释平板分离”法制作的12个平板，计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克(每毫升)样品所含菌落总数。 1. 3. 5 乳酸菌个体形态的观察 培养基平板和改良TJA培养培养完成后，取用“划线分离”法制作的改良MC 基平板各一个，在无菌操作下，用接种环分别挑取少量菌体用常规涂片法制成涂片，干燥、固定后，进行革兰氏染色，再次干燥后用显微镜先在低倍镜下观察，再用油镜观察。 1. 3. 6 酸奶的制作 1、乳酸菌发酵酸奶方法: (1)用不锈钢锅取适量自来水，加热煮沸后，放入两个玻璃瓶，再煮20min，取出沥干水备用。 (2)用不锈钢杯取300mL自来水(可适量多点)，加热煮沸后，倒入30-36g脱脂奶粉，继续加热直至完全溶解，再加入20-30g蔗糖调味，接着分装到两个玻璃瓶中，每瓶约150mL。 (3)待奶粉液的温度降至45?左右，在无菌操作下，用移液管分别吸取10mL达能酸奶于两瓶奶粉液中，用保鲜膜和橡皮筋封口，在43?下培养4h，然后置于4?的冰箱中冷藏过夜。 2、酸奶的感官评价: 取冷藏过夜后的酸奶，以颜色、口感、质地、香味作为指标进行感官评定，并作好记录。 2 结果与分析 2. 1 乳酸菌在不同培养基上的菌落特征 用划线平板法把达能酸奶接种到改良MC培养基和改良TJA培养基上，观察在不同培养基上菌落的形成，所得结果如表1所示。 表1 达能酸奶乳酸菌在不同培养基上的菌落特征 培养基 改良MC培养基 改良TJA培养基 酸奶 皿底为粉红色 皿底为黄色 菌落多为圆形或椭圆形，棕菌落多位圆形或椭圆形，浅 达能酸奶 红色，表面较光滑，呈膜状，黄色，表面较光滑，呈膜状， 分布较疏，菌落较小。 分布较疏，菌落较小。 从表1可以看出，菌落的颜色跟两种培养基各自的颜色相近，在形状、光滑度、质地上两种培养菌落较为一致，且两种菌落分布均比较疏，但从实际观察的情况来看，改良TJA培养基上生成的菌落比改良MC培养基上的要多。比较两种培养基的配比成分，发现成分大致相同，但是改良TJA培养基中含有番茄汁，这使改良TJA培养基中含有更多的维C、 维B、维E、叶酸、核黄素、烟酸、硫胺素等 [4]维生素，而乳酸菌是对维生素依赖性很强的微生物，因此在改良TJA培养基上可形成较多的菌落。 2. 2 菌体形态的检测结果 取达能酸奶在两种培养基上的培养所得的菌体制成涂片，经过革兰氏染色法染色后用光学显微镜在油镜下进行观察，所得结果如图1、图2所示。 图1 改良MC培养基上达能酸奶中的菌体形态 图2 改良TJA培养基上达能酸奶中的菌体形态 从图1、图2中可以看出，达能酸奶中的菌落几乎全部被染成紫色，说明绝大部分为革兰氏阳性菌，其中又以杆菌为多数，可看到少量球菌存在。 2. 3 乳酸菌菌落总数检测结果 取用稀释分离法制成的平板，培养完成后计算平板内的菌落总数，所得结果如表2所示。 表2 达能酸奶中的细菌含量 培养基 稀释液及菌落数两稀释 菌落总数, -6 -7 -8液之比 (,,mL) 10 10 10 160 改良 4 130 MC培养基 4 多不可计 145 9 (平均) — 1.5×104 改良 98 多不可计 多不可计 TJA培养基 92 9 (平均) — 9.5×1095 从表2的结果可以看出，改良TJA培养基中达能酸奶的菌落总数要远远多于改良MC培养基中的菌落总数，这与菌落形态观察所得的结果是一致的，由于改良TJA培养集中含有番茄汁，增加了适合乳酸菌生长繁殖所需的生长因子——维生素，因此改良TJA培养基中乳酸菌的菌落总数更多，由此可知改良TJA培养基比改良MC培养基更适合用于培养乳酸菌。 2. 4 达能酸奶的感官评价 取出4?冷藏过夜的酸奶，以颜色、口感、质地、香味作为指标进行感官评定，记录结果如下: 表3 酸奶的感官评价 感观品质 颜色 口感 质地 香味 酸奶 上层口感细腻，有奶香味，较浓 达能酸奶 米白色，微黄 甜味重，酸度低 下层有颗粒感 郁 从表3感官评价的结果可知，用达能酸奶作为菌源制作的酸奶色泽均匀，口 感纯正，香味浓郁，质量较好。“甜味重，酸度低”可能是因为接种的乳酸菌不足，同时加入的白砂糖稍过量。“下层有颗粒感”是因为奶粉和水的配比没有调好，虽然在加热的时候奶粉完全溶解，但冷藏时奶粉的溶解度变小，一部分奶粉以颗粒状析出，聚集在酸奶下层。应该在加热溶解时多加水或者减少奶粉的质量。 3 结论与讨论 通过划线法接种，达能酸奶中的乳酸菌在改良MC培养基上形成的菌落呈棕红色，在改良TJA培养基上呈浅黄色，两种培养基上的菌落均为圆形或椭圆形，表面光滑，个体较小呈膜状，分布较疏，但是改良TJA培养基上培养得到的菌落数 9较多。利用稀释平板法得到，达能酸奶在改良MC培养基上的细菌总数为1.5×10 9(1/mL)，在改良TJA培养基上的细菌总数为9.5×10(1/mL)，后者菌落总数要远多于前者。上述结果均是因为改良TJA培养基中含有番茄汁，增添了有利于乳酸菌生长的多种维生素。用达能酸奶作菌源制作的酸奶色泽均匀，口感纯正，香味浓郁，质量较好，但应注意奶粉和水的配比，以及调味剂白砂糖加入量的多少，以免影响口感。综上可知，改良TJA培养基更适合于乳酸菌的培养，达能酸奶中含有大量的乳酸杆菌和少量球菌，由这些菌种发酵得到的酸奶质量较好，营养丰富，可应用于工业上大规模生产酸奶和家庭小型酸奶制作。 参 考 文 献 [1]张玉兰.瓶装酸奶的制作技术.农业科技通讯.2005(10):35。 [2]李晓红.乳酸菌发酵在乳品加工中的应用.农村新技术.2010(02):23-25。 [3]刘敏，宋曼丹.乳酸菌检验培养基_改良TJA的研究.中国卫生检验杂志.1998.8(05):304-305。 [4]张刚，范培萍，蔡妙英等.乳酸细菌——基础、技术和应用.化学工业出版社.2007(01):78-80。