【doc】脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人外周血单个核细胞TAP-1表达的抑制作用

【doc】脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人外周血单个核细胞TAP-1达的抑制作用 脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人外周血单个核细 胞TAP-1表达的抑制作用 246 ? 论着? Q!=!细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMollnmmno1)2005,21(2 文章编号:l007—8738(2005)02—0246—03 脱氧雪腐镰刀茵烯醇对人外周血单个核细胞TAP-1表达的抑制作用 李月红,张祥宏,邢凌霄,左连富!,严 (河北医科大学实验病理室,河北石家庄050017; 霞,王俊灵,王凤荣 河北省肿瘤研究所细胞室,河北石家庄050011) Theinhibitoryeffectofde0xyniValen0l oNTAP--1expressioninhumanperiph-- eralbloodmononuclearcellsinvitro L1一hong,ZHANGXiang—hong,XINGLing—xiao, ZUOLian-f.,YANXia',WANGJun—ling,WANG Feng—rong 'Lab.ofExperimentPatholo~,,HebeiMedicalUniversit.y,Shijia— zhuang050017:Lab.ofCytology,HebeiProvin('Plnslituleof Oncolog>,Shijiazhuang050011,China 【AbstractJAIM:Toexploretheeffectsofdeoxyni- valenol(DON)ontransporterassociatedwithantigenpro- cessing?l(TAP-1)expressioninhumanperipheralblood mononuclearcells(PBMCs).METHODS:Effectsofvari? ouscOncentratiOnsOfDONOnTAP?lexpressionof『门vitro culturedhumanPBMCsandthedose?effectrelationship wereanalyzedbyflowcytometry(FCM)andsemi'quantita' tiveRT.PCRattheproteinandmRNAIevels.RESULTS: FCManalysisindicatedthattreatmentwithvariousconcen? trationsofDONcouldinhibitTAP?lexpressionsinPBMCs. showinganegativecorrelationbetweenDONconcentration andTAP.1expression.Semi?quantitativeRT-PCRdetection indicatedthathighcOncentratiOnsOfDON(1000and2000 pg/L,coulddistinctlyinhibitTAP'lmRNAexpression. CoNCLUSIoN:DONcandown?regulateTAP?lexpression inhumanPBMCsinadose?dependentmanner/nvitro. whichsuggestsDONmayinterferewithhostimmunosurveil- Iance.andthismayaccountforthecorrelationbetweenDON— contaminatedgrainandesophaguscancerinhighriskarea [Keywords]deoxynivalenol;humanPBMC;TAP-l;RT?PCR [摘要]目的:探讨脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对人外周 血单个核细胞(PBMC)中TAP?1表达的影响:方法:采用流 式细胞仪(FCM)和半定量RT-PCR方法,从蛋白和mRNA水 平上同浓度的DON对体外培养的人PBMC中TAP一1 分子表达的影响及量一效关系结果:FCM定量表日月,用 收稿日期:2004—05一l9;修回日期:2004—07一l0 基金项目:河北省自然科学基金资助项目(No.301350);科技部重大 基础研究项目前期研究专项资助(No.200lCCC00500) 作者简介:李月红(1972一),男,山东无棣人,主治医师,博士. l:(O3l1)7222082;Email:145js@helHUH.edu?i Correspondingauthor 不同浓度的DON处理,均可一定程度地抑制人PBMC中 TAP一1蛋白的表达,且二呈显着的负相关(r=一0.865, P<0.01)半定量RT—PCR检测显示,不同浓度的DON处理 均可抑制人PBMC中TAP一1mRNA的表达一结论:DON可剂 量依赖地抑制体外培养的人PBMC中rrAP一1蛋白和其mRNA 的表达,对阐明食管癌高发区被DON污染的粮食食管癌发 生的关系具有重要的意义一 [关键词]脱氧雪腐镰刀菌烯醇;人外周血单个核细胞; FAP一1;RT—PCR [中图分类号]R378[文献标识码]A 抗原加工相关转运体(transpoderassociatedwith antigenprocessing,TAP)由TAP—l和FAP一2两个亚基 构成,是调节HLA—I类分子限制性抗原加工和呈递 功能的重要分子.TAP表达的缺失或下降可造成 HLA—I类分子表达下调,影响T细胞免疫应答和免 疫监视功能.研究发现,某些外界因素可通过抑 制TAP的抗原转运能力而影响HLA—I类分子限制性 的抗原加工,呈递..一 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxyni~alenol,DON)又 称作呕吐毒素(vomitoxin,VT),是我国食管癌,胃癌 高发区居民粮食污染的主要霉菌毒素国内外研 究表明,DON可通过诱导免疫细胞凋亡,抑制或超 诱导细胞因子的分泌等而对人和动物的免疫功能产 生不利影响但有关DON对机体免疫细胞中 HLA—I类分子和TAP等的影响尚未见报道.本研究 中,我们应用半定量RT.PCR和流式细胞定量检测法 (FCM),在mRNA和蛋白水平上分析了DON对体外 培养的人外周血单个核细胞(PBMC)与免疫监视有 关的TAP.1表达的影响,以探讨其在肿瘤发生中的 可能意义. 1材料和方法 )为美国BD公 1.1材料流式细胞仪(FACS420型 司产品:新鲜健康成年人外周静脉血(5人份)由河 北省血液中心提供.脱氧雪腐镰刀茼烯醇(Sigma公 司产品)由北京中山生物技术公司提供:淋巴细胞分 离液(Fieol1)购自上海试剂二厂:RPMII640培养基 为Gibco公司产品.小鼠抗人TAP—l单克隆抗体 1SSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMollnununo1)2005,21(2 (mAb)为SantaCruz公司产品. 1.2方法 1.2.1实验分组与处理采用Ficoll密度梯度离心 分离人PBMC,按l×10个细胞/L的浓度接种在含 100mL/L胎牛血清,105U/L青霉素及100mg/L链 霉素的RPMI1640培养基中,加入PHA(终浓度 300mg/L),于37?,50mL/LCO,条件下培养取 4mL培养基置于25mL的培养瓶中培养48h,更换 不含PHA的RPMI1640培养基实验分为实验组和 对照组:实验组又根据DON的浓度分为4个亚组, 每组5瓶细胞.各组分别加入浓度为100mg/L的 DON溶液(生理盐水配制)0.5,l,l0,20L(不足 20者用生理盐水补足),终浓度分别为50,100, l000,2000g/L,对照组加入生理盐水20L.继 续孵育24h后,用生理盐水洗涤2次,更换新的RP— MI1640培养基,再培养24h.离心收集细胞,用于 FCM和RT.PCR检测 1.2.2TAP.1表达的FCM检测离心收集细胞用 PBS洗2次,以l0g/L多聚甲醛固定后,于4~C保存 待测:TAP.1检测的主要步骤如下:离心收集细胞, 用冷PBS洗涤离心,去上清,加入200L以PBS稀 释(1:100)的小鼠抗人TAP-lmAb轻吹混匀,于4~C 孵育30rain以PBS洗涤1次,加入200LPBS稀 释的荧光素标记的羊抗鼠抗体,轻吹混匀,4~C避光 孵育30rain:以冷PBS离心洗涤2次,将细胞重新 悬浮于200LPBS中混匀,用FCM进行检测检测 结果以荧光强度(fluorescenceintensity,FI)表示 TAP.1蛋白的表达量,以平均荧光强度(MFI)计量各 组TAP.1蛋白表达的强弱 1.2.3细胞总RNA的提取及电泳鉴定采用异硫 氰酸胍一步法提取细胞总RNA,主要步骤如下:细 胞沉淀中加入500L裂解液,按常规操作方法提取 RNA,加入20LDepc-H,O溶解,用l0g/L琼脂糖 凝胶电泳(1×TAE)lh,鉴定其完整性,紫外灯下观 察结果并照相. 247 1.2.4TAP.1mRNA表达的半定量RT.PCR检测 (1)反转录合成cDNA:按顺序依次加入:5×buffer 5txL,dNTP2.5txL,RNasin0.5L,AMVlL,01. ig0(dT).50.5L及样品RNA2txg,加水至终体积为 25L,于42?水浴lh,冰浴10nlill,置一80?冰箱 中备用.(2)引物设计:扩增TAP.1基因的引物, Sense:5.CGCCTI'CGTI'GTCAGTI'ATG.3,Antisense: 5.GccGAcGcAcAGGGIrr.3,扩增产物的长度为 113bp.扩增GAPDH基因的引物,Sense:5.GGAA. GGTGAACCTCCCACT.3,Antisense:5.CCTGGAAG. ATGGTGATGGG.3,扩增产物的长度为23lbp:以 上引物由软件辅助设计,由上海生工公司合成:(3) PCR反应:反应体系如下:5L反转录产物,5L l0×buffer,3txLMgC1,,0.5txLdNTP,0.3txLTaq DNA聚合酶及上,下游引物各10pmol,加三蒸水至 终体积为50L.置PCR仪中扩增,扩增循环参数 为:94?变性5rain,94?50S,54oC30S,72oC 30S,35次循环后再于72~C延伸10rain.将PCR产 物进行100g/LPAGE,用紫外分析仪观察并照相, 凝胶分析软件进行定量. 1.2.5统计学处理实验数据均以x-4-s表示:将 实验数据输入计算机,采用SPSS10.0统计软件进行 方差分析和直线回归分析. 2结果 2.1TAP-1蛋白表达的FCM检测实验组细胞中 TAP.1蛋白的表达量低于对照组(图1):定量分析 表明,用DON处理24h后,各DON组PBMC中 TAP.1蛋白的平均表达量均低于对照组:l000L 和2000gJLDON处理组TAP—l蛋白表达的降低更 为明显(P<0.05,表1).在50,2000g/L范围 内,随着DON浓度的升高,TAP.1蛋白的表达量相 应降低,两者呈明显的负相关(r=一0.865,P<0.O1, n=5 FIFIFIFIF 图l不同浓度的DON处理的人PBMC中TAP-l蛋白表达的FCM检测 FiglAnalysisofTAP-lexpressioninhumanPBMCstreatedwithvariousconcentrationsofD ONbyFCM 2.2TAP-1mRNA表达的半定量RT-PCR检测 RT-PCR产物经100g/LPAGE分析,每个泳道均出 现两条带,与DNAmarker相比较,得知分别为 231bp的内参照基因GAPDH和113bp的TAP?1基 248兰QQ二墨三墨胞王堂盘壹(ChinJCellMo1]mmuno])2005,2】(2) 因(图2).应用凝胶成像分析系统对其进行定量分 析,以TAP一1/GAPDH比值表示TAP—l的相对表达 量,DON(50,100,l000,2000g/L)处理组TAP—l 的相对表达量,分别为0.353,0.350,0.303, 0.304,均低于对照组的0.420(图3). 表1不同浓度DON处理24h人PBMC中TAP一1的表达 Tab1ExpressionofTAP一1inhumanPBMCstreatedwith,'ari— OUScon(?entrationsofDONfor24h(n=5.?s) DON(0-g/L)ExpressionofTAP一1(MFI) P<0.0500-g/IDONtreatmentgroup 150 l00 图2不同浓度的DON处理的人PBMC中TAP—lmRNA表达 的RT—PCR检测 Fig2DetectionofTAP—lmRNAexlmessioninhumanPBMCs treatedwithvariousconcentrationsofDONby. RT—PCR M:DNAnlal'ker;l-5:21300.1000,l00,50and0t- g/LDON.respel'Ii,Pl, 044 042 【140 【138 036 34 032 030 028 0【110I)10001000 ConcnofDON(uL) 3TAP—J基因RT—PCR产物的凝胶成像定量分析 Fig3GelimagingquantitatixPana1)'sisofRT—PCRproductof TAP—lgene 3讨论 细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在机体抗肿瘤免疫 中发挥着重要作用.HLA—I类分子限制性抗原的呈 递是激活CTL的前提.在HLA—l类分子限制性抗原 加工,转运和呈递过程中,完整的内源性抗原必须 先在细胞质内由LMP降解成8—10个氨基酸的多 肽,然后通过内质网膜上由TAP.1和TAP一2两个亚 基组成的TAP转运至内质网腔,才能与新合成的 HLA—I类分子结合形成HLA—I一抗原肽复合物,转 运至细胞表面,供T细胞识别产生免疫应答. DON是我国食管癌高发区居民粮食污染中最常 见的一种霉菌毒素,且常与其他致癌性霉菌毒素(如 黄曲霉毒素,杂色曲霉素及伏马菌素等)混合污 染.目前,DON的免疫毒理学研究越来越受到医 务工作者的重视.本研究从免疫应答的转运环节, 分析了DON对体外培养的人PBMC中TAP—1分子表 达的影响.FCM定量分析表明,经PHA活化的PB— MC在DON处理24h后,TAP—l蛋白的表达均受到 明显抑制,且二者呈明显的负相关半定量RT—PCR 检测表明,DON可明显抑制PHA活化的PBMC中 TAP—lmRNA的表达.提示DON在蛋白和mRNA水 平上,均可抑制HLA—I类分子限制性抗原呈递途径 中的抗原转运环节,由此而抑制细胞免疫应答 通过对河北省食管癌高发区居民的粮食被多种 霉菌毒素污染进行综合分析,我们认为该区居民由 于长期食用被DON污染的粮食,体内TAP分子的表 达下调,抗原多肽的转运,提呈受阻,进而便可降低 CTL介导的免疫应答,使恶变的细胞逃避CTL免疫 监视,而导致食管癌的发生.因此,在食管癌高发 区针对DON等霉菌毒素采取有效的预防工作,具有 重要的意义. 参考文献: [Do,,he. ~SE,GhoshNS,wrightKL.1,ossofinterferon—ginducibilit~ ofTAPIandLMP2inarenal('ellear~'illOlllarelllinel:J:.C(uuer Res.2000.60:5789,5796. 12jKutsehO,V)T,KPrkau...1,eta1HI\'?)pJabrogatesT^P—media— tedtransportotantigeniepeptidesplesentedl1,MHCclass1.Trans— porterasso('iatedwithantigei1presentation— J4/DSRes&HumRet— rol'irllses.2002.18(17):l319—1325 3VamhutasA,DeVotiJ,PinnW.ela1.Intertionofhunmnpapillo— ma,~irusI,pe11E7proteinw_fhTAP一1resuhsintheredut'tionof ATP—dependentpeptideh'anspnrlJj.Cliu[mmuno[,2001.101 (1):94—99. 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