胶冻样类芽孢杆菌PS04产抗真菌物质培养条件的优化

胶冻样类芽孢杆菌PS04产抗真菌物质培养条件的优化 胶冻样类芽孢杆菌PS04产抗真菌物质培养 条件的优化 第3O卷第3期 2011年6月 华中农业大学 JournalofHuazhongAgrieulturalUniversity Vo1.30No.3 June2011,276~279 胶冻样类芽孢杆菌PS04产抗真菌物质 培养条件的优化 胡亮亮徐汉虹廖美德 华南农业大学资源环境学院/天然农药与化学生物学教育部重点实验室,广州510642 摘要以胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacilluskribbensis)PS04为试验材料,运用传统的单次单因子法,筛选 得到适合胶冻样类芽孢杆菌PS04生防菌株生长及其拮抗物质产生的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为NaNO.,并 在逐因子试验的基础上进行正交试验,得到该培养基各组分的最佳含量:蔗糖3,NaNO.0.15,KzHP0 0.1.在确定适合该菌株的培养基组分基础上,对其培养条件进行优化试验,结果表明在初始pH7,8,温度 30?,转速180r/rain,100mL/1000mL摇瓶培养84h时,菌株生长及抑菌活性均达到最大值. 关键词胶冻样类芽孢杆菌;抗真菌;培养条件;优化 中图分类号S482.2..8文献标识码A文章编号1000—2421(2011)03—0276—04 随着病原真菌耐药性问题的日趋严重,微生物 来源的抗真菌抗生素研究得到了飞速发展,并已取 得显着成果.笔者从土壤中分离得到具有高抑真菌 活性细菌菌株PS04.通过16SrcDNA分析,表明 该菌为胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacilluskribben— sis),培养液乙醇粗提物抗真菌活性强,作用菌谱 广[1].该菌株产生的抗真菌素具有较好的水溶性和 耐热性,有可能是一种新型抑真菌素产生菌,具有良 好的开发应用前景.笔者探讨了PS04菌株生长最 佳培养基组成,并通过正交试验确定各组分的最佳 配比,观察培养条件对PS04菌株生长及发酵液活 性的影响和主要影响因子与菌株生长及抑菌活性的 关系,旨在建立最优培养条件,为该菌株的工业生产 并获得高产抗菌物质提供理论依据. 1材料与方法 1.1供试菌株 胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacilluskribbensis) PS04菌株,由笔者所在实验室保存;水稻纹枯病原 菌(Rhizoctoniasolani)由华南农业大学植物病理学 研究室提供. 1_2培养基 查氏培养基:硝酸钠3g,磷酸氢二钾1g,硫酸 镁(MgSO?7H.0)0.5g,氯化钾0.5g,硫酸亚 铁0.01g,蔗糖30g,蒸馏水1000mL,用于 PS04菌株培养. 马铃薯培养基(PDA):马铃薯200g,葡萄糖 20g,琼脂20g,水1000mL,自然pH.称取 200g马铃薯,洗净去皮切成小块,加水煮沸20~30 min,用4层纱布过滤,加人葡萄糖和琼脂各20g, 继续加热搅拌混匀,稍冷却后再补足水至1000mL,分装(121?)灭菌20min,用于抗菌活性测定. 1.3种子液的培养 刮取新鲜的菌苔1,2环接种在装有100mL 种子培养基的500mL锥形瓶中,30?,180r/min 振荡培养24h. 1.4菌体生物量测定 将种子液接种到查氏培养基中恒温振荡培养, 得到发酵液,用721型分光光度计,在波长600nm 处测定用蒸馏水稀释5倍后发酵液的吸光度D.o, 以未接菌的查氏培养基为对照.以光密度值..为 判断菌体生物量,De..值大表示菌体量多,Dsoo 值小表示菌体量少. 1-5抑菌活性的测定 取PS04菌株发酵液,按2mL/50mL的比例 添加到已融化的马铃薯培养基中,待凝固后接种水 09—25 收稿日期:2010— 基金项目:广东省广州市科技局项目(2008J1一C221) 胡亮亮,硕士研究生.研究方向:微生物农药.E-mail:honams@foxmail.corn 通讯作者:廖美德,副教授.研究方向:微生物农药.E-mail:liaomeide@scau.edu.cn 第3期胡亮亮等:胶冻样类芽孢杆菌PS04产抗真菌物质培养条件的优化277 稻纹枯病原菌的菌饼(菌饼直径为0.5cm),置于 (28-4-1)?培养箱中,保温培养3,5d.当对照组 菌落直径大约为培养皿直径8O时,用十字交叉法 测量菌落直径,并计算抑制率. 抑制率对照组菌落直径一 菌饼直径 发酵,定期取样测Ds..和抑菌活性,观察菌株生长和 发酵液活性随发酵时间变化的情况. 2结果与分析 ×1O02.1培养基的优化 1.6培养基条件优化试验设计 1)最佳碳源筛选.分别以柠檬酸,半乳糖,乳 糖,鼠李糖,果糖,无水乙醇,棉子糖,可溶性淀粉,葡 萄糖,蔗糖10种碳源替换查氏培养基中的蔗糖,其 他成分不变[2].将不同碳源制成的培养基pH值 均调至7.0,分别取100mL装入500mL三角瓶 中,0.1MPa,121?灭菌20min.接种量为每个摇 瓶中接种5mL培养24h的PS04菌株种子液, 30?下180r/min摇床培养,定期取样测定培养液 光密度(D..)和抑菌活性. 2)最佳氮源筛选.分别以尿素,NHNO.,胰蛋 白胨,(NH)SO4种氮源替换查氏培养基中的 NaNO3,其他条件同上. 3)培养基组分配比优化.以优化得到的蔗糖 (碳源),NaNO.(氮源)和KzHPO(含磷化合物)进 行3因素3水平的正交试验,采用L.(3)正交表确 定培养基各组分的最佳配比(表1). 1_7培养条件优化试验设计[5-91 1)发酵温度.培养基按150mL/500mL比例 分装至锥形瓶,按5(v/v)接种量等量接种,分别 置于2O,25,3O,35,40?下180r/rain摇床培养,定 期取样测D?和抑菌活性,进入平台期后结束. 2)培养基初始pH值.用稀HCI和稀NaOH 将培养基pH值调为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,按150 mL/500mL比例分装至锥形瓶,按5(v/v)接种 量等量接种,30?下180r/min摇床培养,定期取 样测D..和抑菌活性,进人生长平台期后结束. 3)装液量.1000mL锥形瓶分别装培养基 100,200,300,400,500mL,按5(v/v)接种量等 量接种,30?下180r/min摇瓶发酵培养,定期取 样测D..和抑菌活性. 4)接种量.培养基按100mL/1000mI锥形 瓶分装,分别按1,3,5,7,1O(v/v)比例 接种,3O?下180r/min摇床培养,定期取样测D.. 和抑菌活性,进入生长平台期后结束. 5)发酵过程中菌株生长和发酵液活性变化的观 察.按上述试验结果确定发酵条件,并按照该条件 1)碳源,氮源对PS04菌株生长和抑菌活性的 影响.试验结果表明,棉子糖,无水葡萄糖,蔗糖和 可溶性淀粉有利于PS04菌株的生长,且产生大量 的胞外多糖,菌株对柠檬酸,半乳糖,乳糖,无水乙 醇,鼠李糖,果糖的利用率不高;菌株能以有机态氮 源和硝态氮源作唯一氮源生长,几乎不能以尿素,铵 态氮作唯一氮源生长,从NHNo.作唯一氮源可看 出铵态氮能明显抑制菌体对硝态氮的利用. 2)正交试验法优化筛选培养基各组分的配比. 由表1可见,蔗糖是影响PS04菌株生长和抑菌活 性最主要的因素,随着蔗糖浓度的升高菌株生长量 和抑菌活性都有很大的提高;不同浓度的NaNO.对 菌株的生长和抑菌活性也有一定的影响.综合这 3个因素不同水平对发酵的影响,确定最适合该菌 株生产的培养基各组分为蔗糖39/6,NaNO.0.15, K2HPO40.1. 表1培养基各组分配比优化的正交试验设计及统计结果 Table1Orthogonalexperimentaldesignand statisticalresultsforeveryproportionofmedium 序号蔗糖/(g/I)NaNOs/K2HPO/'r,抑菌率/ No.Suer(】se(g/L)(g/L).Inhibit0ryrate 2.2.培养条件的优化 1)发酵温度对菌株生长和发酵液活性的影响. 试验结果表明:PS04菌株在20~40?时均可生长, 其中在30,35?时菌体生长量较高,温度低于 20?或高于40?不适于该菌株生长;在发酵液活 性方面,30?时发酵液显示出较强的抑菌活性,对 水稻纹枯菌的抑制活性达到7O左右,而4O?时 发酵液活性较低. 2)培养基初始pH值对菌株生长和发酵液活性 的影响.试验结果(图1,图2)表明:PS04菌株在 pH6.0,9.0时均可生长,其中在pH7.0,9.0时 菌体生长量较高,pH5.O,6.0时菌株生长受到一 加加加如如? 123456789 278华中农业大学第3O卷 定的抑制,说明碱性条件有利于菌株生长;在发酵 液活性方面,初始pH7.0"--9.0时的发酵液活性明 显高于pH5.0,6.0时的发酵液活性. 3)装液量对菌株生长和发酵液活性的影响.试 验结果(图3,图4)表明:装液量1O,通气量9O 时菌体生长最为旺盛,发酵液抑菌活性也最高;而通 气量为5O,90时,菌体生长随着通气量的增加 而增加,抑菌活性也有同样的趋势.这说明PS04 菌株生长和产抑菌物质均需要较大的通气量.因 此,在发酵过程中发酵罐装液量减少(通气量增加) 有利于菌体生长和抑菌物质的积累. 4)接种量对菌株生长和发酵液活性的影响.试 验结果(图5,图6)表明:从12,96h的测量中发 现,1,10的接种量对菌体生长影响不大,抑菌 活性也没有表现出较大差异,说明接种量对菌株生 O?6 O?5 0.4 0.3 0.2 O.1 0.0 图1培养基初始pH值对菌株生长的影响 Fig.1EffectofpHofculturemedium orlthegrowthofPS04 时间,hTime. 图3装液量对菌株生长的影响 Fig.3EffectofvolumeOI1thegrowthofPS04 时间/hTime 图5接种?对菌株生长的影响 Fig.5EffectofinoculationdoseonthegrowthofPS04 长和抑菌活性的物质的产生影响不大. 5)发酵过程中菌株生长和发酵液活性随发酵时 间的变化.试验结果表明,菌株在培养0,12h内 处于迟缓期,生长平缓,之后菌株生长进入对数期, 24~48h达最大值;随着培养时间的延长(48, 72h),菌株生长处于稳定期,生长量保持平稳,此结 果恰好符合细菌生长周期规律.在培养96h后菌 液由乳白色变成淡黄色,D值又开始增加,这是因为 细菌生长后期产生色素而引起的变化.发酵液抑菌 活性测定结果表明,在12~48h内随着培养时间的 延长,抑菌率呈逐渐增大的趋势,这是由于培养时间 的延长,菌株产生的抑菌物质不断积累;在培养 84h后,抑菌率达到最大值,并在此之后一段时间 内保持较高的抑菌率.从节省时间上考虑,菌株以 培养84h较为适宜. 70. ?60. g50. 旃40. 翌主30. 20. __10. 0. 图2培养基初始pH值对菌株发酵液活性的影响 Fig.2EffectofpHofculturemedium ontheactivityofPS04 时间/hTime 图4装液量对菌株发酵液活性的影响 Fig.4EffectofvolumeontheactivityofPS04 时间/hTime 图6接种量对菌株发酵液活性的影响 Fig.6EffectofinoculationdoseontheactivityofPS04 鲫?加加0 _d一日0一II一 长,祷褪嚣 如加加mo B】普01lE ,瓣翘嚣 第3期胡亮亮等:胶冻样类芽孢杆菌PS04产抗真菌物质培养条件的优化279 3讨论 通过单因素试验和正交试验相结合,初步得到 了适合摇瓶条件下PS04菌株发酵的培养基配方为 蔗糖3,NaNO30.15,K2HPO40.1;最适培 养条件为初始pH7,8,培养温度30?,1000mL 摇瓶装液量100mL,接种量2,5,培养时间 84h,转速180r/min.此条件下,PS04的培养液 Deoo值及抑菌率分别达到1.1和82,比在查氏培 养基中30?下180r/min培养84h时D..值0.8 和抑菌率70有显着提高. 本研究结果表明,双糖,三糖和多糖作为碳源有 利于PS04菌株菌体生长,该菌株除葡萄糖外几乎 不能利用其他单糖.优化氮源时,发现该菌株在供 试的几种氮源作为唯一氮源中,有机氮源和硝态氮 源有利于菌体生长,难以利用铵态氮源,且铵态氮能 抑制菌体生长和对硝态氮的利用.比较相同碳源, 氮源或金属离子条件下菌株的生长量与其发酵滤液 的活性,发现菌株的生长量与其发酵滤液的活性呈 正相关. 在优化培养条件时,发现PS04菌株最适宜培 养基pH7,8,说明该菌株喜欢在偏碱性的环境中 生长,温度在40?以上时菌株的生长量显着下降, 说明该菌株不耐高温.在本研究获得的优化培养基 组分和培养条件下,PS04菌株的生长量及抑菌代谢 产物都得到了显着提高,而且盆栽试验结果表明,此 发酵滤液防治水稻纹枯病的效果显着增强. 本试验只是在摇床条件下对PS04菌株发酵培 养基的组成及其培养条件进行了优化,今后尚需在 发酵罐中进行验证,在实际生产中对发酵条件的控 制方法也需进一步研究. 参考文献 Eli廖美德,楚娟娟,徐汉虹.PS04菌株的抗真菌活性口].长江大 学:自然科学版,2008,5(1):59—63. E23章四平,刘圣明,王建新,等.枯草芽孢杆菌生防菌株NJ一18的 发酵条件优化[J].南京农业大学,2010,33(2):58—62. [3]方传记,陆兆新,孙力军,等.淀粉液化芽孢杆菌抗茵脂肽发酵 培养基及发酵条件的优化[J].中国农业科学,2008,41(2); 533-539. [4]李文鹏,蔡磊,毕廷菊,等.胨冻样芽孢杆菌(Bacillusmucilag— inosus)的分离,筛选及其发酵培养基研究[J].土壤通报,2001, 32(2):70—72. [5]杨好.中国东海枯草芽孢杆菌321122的鉴定,发酵及其次级代 谢产物的研究[D].上海:第二军医大学图书馆,2006. [6]黄六容,何冬兰,刘梅芳.产谷氨酰胺转胺酶菌株的筛选及其产 酶条件研究口].华中农业大学,2005,24(4):369—372. [7]陈双臣,刘爱荣,王晓清,等.放线菌株F培养条件优化和抗菌 物质的稳定性研究口].生物技术,2009,19(2):76—79. E8]郑嫒,王跃军,孙谧.海洋侧孢短芽孢杆菌Brevibacilluslat— erosporusLh-1产抗菌肽R-1的培养条件优化[J1.微生物学通 报,2009,36(3):398—403. [9]周靖,廖美德,徐汉虹.淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)培 养条件的优化[J].微生物学杂志,2007,27(2):45—48. OptimizationofcultureconditionsforastrainofPS04 producingantifungalantibiotics HULiang—liangXUHan-hongLIAOMei-de CollegeofResourcesandEnvironment,SouthChinaAgriculturalUniversity/KeyLaborato ryof NaturalPesticideandChemicalBiologyMinistryofEducation,Cruangzhou510642,China AbstractThefavorableconditionforthegrowthandantagonisticproductionofaPaenibacillu s kribbensisPS04,abiologicalcontrolagent,bysinglefactorexperimentswaspresentedinthis study. Theresultsshowedthatthebestcarbonsourcewassucrose,thebestnitrogenwasNaNO3.Thebest compositionofthemediacontained:sucrose3,NaNO3O.15andK2HPO4O.1bytheorthogonal experiment.Subsequentlythecultureconditionswereoptimizedandtheresultsshowedthemediumini— tialpHwas7— 8,theculturetemperaturewas30?,thequantityofmediumwas100mLina1000mL flask,theculturecyclewas84h,andtherotationspeedwas180r/minrespectively. KeywordsPaenibacilluskribbensis;antifungal;cultureconditions;optimization (责任编辑:陈红叶)