薏苡仁油对高糖环境下人视网膜血管

薏苡仁油对高糖环境下人视网膜血管 Tel:029-82245172 82210956 IntEyeSci,Vol.14,No.12,Dec.2014 Email:IJO.2000@163.com www.ies.net.cn ·实验研究· 薏苡仁油对高糖环境下人视网膜血管内皮细胞增殖和VEGF表达的影响 李 敏,章运生,李 芳,彭辉灿 作者单位:(421001)中国湖南省衡阳市,南华大学附属第二医院眼科 作者简介:李敏,女,在读硕士研究生,研究方向:眼底病学。通讯作者:彭辉灿,教授,硕士研究生导师,《国际眼科杂志》编glucosecontrolgroup(P<0.05). 誗CONCLUSlON:CoixseedoilcaninhibittheHRCECsproliferationandsuppresstheVEGFexpressioninhighglucoseenvironment. 委,研究方向:眼底病基础与临床研究.Penghuican@sina.com收稿日期:2014-07-03 修回日期:2014-11-21 EffectscapillaryofCoixseedoilonVEGFexpressionendothelialinhighcellsglucoseproliferationhumanretinalenvironment andMinLi,Yun-ShengZhang,FangLi,Hui-CanPeng DepartmentSouthCorrespondenceChinaofUniversity,Ophthalmology,theSecondAffiliatedHospitaloftheto:Hui-CanHengyangPeng.421001,DepartmentHunanofProvince,Ophthalmology,China421001,SecondReceived:HunanAffiliated2014-07-03 Province,HospitalofSouthChinaUniversity,Hengyang China.Accepted:2014-11-21 Penghuican@sina.comAbstract Coix誗AlM:Tostudytheeffectsofdifferentconcentrationsof (seedoilfactorHRCECs(VEGF)proliferationonhuman)expressionandretinalcapillaryendothelialcellsinhighvascularglucoseendothelialenvironment.growth誗eyeballMETHODSexperimentandcultured:HRCECsexperimentalweretheinvitroextractedfromhumanfreshergrowth,andofultimatelyusedintheglucoseglucosecontrolwereconcentrations+(50ügroupdivided3rd~4thcells,theL/mL,,highinto100üLglucoseblankcontrolgroup,low/mL,200controlüL/mLgroup,highmultiplicationmethodofVEGFwasexpression. employedofHRCECsCoixseedoilgroup.Detecting)differentthetobydetectMTT,thetheeachimmunocytochemicalgroupHRCECs誗concentrationsRESULTS:MTTinhibitionofcoixassayseedresultsoilactedshowedatHRCECsthat:differentcomparedofWithinwithcellhighproliferationglucosecontrolwassignificantgroup(Pdifferencefor48h,<0.05nohighstatistical48hshowedconcentrationdependence.Therewas).assayglucosedifferencecontrolgroupbetween(thelowglucosegroupandseedshowedthat:50üL/mLP,>0100.05ü)L./lmmunocytochemicalmL,decreasedoilactedcontrolsignificantlyatHRCECscompared48h,the200üL/mLCoixwithexpressionthehighofVEGFmanner.groupexpressionHowever(P0.05)。免疫细胞化学检测法表明:用50,100,200μL/mL的薏苡仁油作用于高糖下HRCECs48h,高糖+不同浓度薏苡仁油组与高糖对照组相比VEGF表达下降明显(P<0.05),将高糖+不同浓度薏苡仁油组之间进行两两比较亦具有统计学意义(P<0.05)。且呈浓度依赖性。高糖对照组与低糖对照组相比,VEGF表达明显(P<0.05)。 结论VEGF:薏苡仁油可抑制高糖环境下HRCECs的增关键词的表达殖和:薏苡仁油。 ;血管内皮生长因子;人视网膜血管内皮细胞 DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2014.12.10 引用:李敏,章运生,李芳,等.薏苡仁油对高糖环境下人视网膜 血管内皮细胞增殖和(12):2147-2150 VEGF表达的影响.国际眼科杂志2014;140 引言 常见的有糖尿病视网膜病变 糖尿病是一种多系统损害的慢性病(diabetic,retinopathy,其微血管并发症DR)。 2147 国际眼科杂志 2014年12月 第14卷 第12期 www.ies.net.cn 电话:029-82245172 82210956 电子信箱:IJO.2000@163.com 其发病机制相当复杂,包括多元醇途径亢进,生长因子和黏附分子表达增加,蛋白激酶C激活,氧化应激增高等[1],最终促使糖尿病视网膜新生血管(retinalneovascularization,RNV)形成。其中VEGF被认为是促进RNV生成和视网膜黄斑水肿(DME)的主要生长因子之一[2]。在DR患者中,VEGF含量高于正常水平且与其严重程度呈正相关[3]。我们由此推断抑制VEGF的表达可以降低糖尿病引起的视网膜损害。薏苡仁油具有降血糖,镇痛抗炎,抗肿瘤,抗病毒,增强肿瘤放化疗敏感性等作用[4,5]。本实验通过研究薏苡仁油作用于人视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)在高糖环境下的增殖抑制及VEGF的表达,从而了解薏苡仁油在DR中抑制新生血管的机制。1材料和方法 图1 HRCECs融合成单层,如铺路石样(伊200)。 悬液2mL,放入37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养24h,弃1.1材料 薏苡仁油注射液(KLT,浙江康莱特药业有限公司,批号Z10970091)、胰蛋白酶、DMEM培养基(Hyclone公司()、二甲基亚砜DMSO、噻唑蓝MTT、DAB显色试剂盒(长沙艾佳生物技术有限公司Tex)、长沙艾佳生物技术有限公司培养瓶兔抗人。VEGF抗体(Gene)、)、SABC(Tex)、兔抗人胎牛血清Ⅷ兔因子)-POD-IgG(试剂盒、96孔板Gene、1.2方法 1.2.1HRCECs的培养 对新鲜眼球进行取材,参照其培养方法的相关文献[6]对HRCECs进行原代培养,将培养瓶放置于5%CO换液1次,待细胞在培养瓶内长成致密单层后进行传代2、温度为37℃的恒温培养箱内,每1~2d培养。 1.HRCECs2.2HRCECs的鉴定 利用倒置相差显微镜养板内等待内皮细胞长至融合状态时的形态特点,将无菌盖玻片1cm×1cm观察,利用第Ⅷ置于因子相关6孔培抗原抗体检测,在显微镜下观察其表达。 1.2.3实验的分组 实验分组如下:A0组只有培养基没有细胞的调零组50μL;AL组低糖对照组;AH高糖对照组;AA/mL薏苡仁油组;A/mL薏苡仁油组1高糖+2高糖+100μL;5.3高糖+200μL/mL薏苡仁油组1.5mmol2.4MTT/L,高糖组的葡萄糖浓度。检测薏苡仁油对HRCECs25mmol低糖组的葡萄糖浓度增殖的影响/L。 取对数生长期的细胞,弃培养基,PBS洗涤2~3遍,加胰蛋白酶消化约1min,加入含胎牛血清的低糖或高糖DMEM培养液终止消化,分别吹打制成高糖和低糖的细胞悬浮液,调整细胞浓度为5×103个/mL,加入96孔板、200μL/孔。每组设5个复孔,共设6组(A孔板放置于5%CO0,AL,AH,A1,A2,A3胞贴壁后取出、换液2。、温度为A1~A337℃组分别加入的恒温培养箱内)。200μL不同浓,将待细96度的薏苡仁油48h50μL,4h后,弃培养,其终浓度为基,PBS洗涤50,100,200μL,加入含/mL,继续培养荡10min,后终止培养使蓝紫色结晶完全溶解,弃液体,每孔加入噻唑蓝的培养基,用波长为DMSO490nm200μL,自动震酶标仪测定吸光度[7]A值。上述操作重复3次,根据计算细胞存活率相关文献得出:细胞存活率%=实验组平均A值/对照组平均A值×100%;细胞抑制率%=(1-细胞存活率)×100%。 1.2.5免疫细胞化学方法检测薏苡仁油对HRCECsVEGF表达的影响 将消毒灭菌并做好标记的盖玻片放入无菌的6孔板里,每孔接种密度为4×104个/mL 的细胞 2148 去培养基。分5组,AL组含低糖DMEM的低糖对照组,A含高糖DMEM的高糖对照组,其余为高糖DMEM培养基H加终浓度分别为50,100,200μL/mL的薏苡仁油加药组,每组2个复孔,每孔2mL,继续培养48h,取出盖玻片,PBS液洗涤2~3遍,4%多聚甲醛室温固定30min,再次PBS液洗涤,3%过氧化氢-甲醇室温浸泡15min,以封闭内源性过氧化物酶,再次PBS液洗涤,之后加入5%BSA温盒中室温封闭VEGF20min,滤纸吸去多余液体,加入一抗(兔抗人温度为1：200)4℃温盒中过夜并以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照,37℃复温45min,PBS液洗涤,滴,加二抗37℃孵育30min,SABC法染色,DAB显色,苏木素复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,镜下观察。以上实验重复3次。阳性染色为棕色或者棕褐色颗粒。对各组进行灰度值测定(背景灰度值-阳性灰度值)。阳性染色越多组实验数据以 统计学分析,其值越小x¯ ±:s采用表示SPSS。 ,多组间均数的比较用单因素方18.0软件进行统计分析,各 差分析,组间均数的比较用SNK-q检验。以α=0.05为检验水准。2结果 2.1HRCECs的培养与鉴定 在倒置相差显微镜下观察细胞融合成单层如铺路石样贴壁生长(图1)。运用免疫细胞化学方法,经第Ⅷ因子相关抗原抗体染色,HRCECs胞浆中有棕色着色HRCECs,阴性对照组无着色。说明体外培养2.2薏苡仁油对体外培养的成功。 HRCECs增生的影响 MTT比色法检测显示:在相同培养时间条件下,高糖对照组与低糖对照组相比,无统计学意义(P<0.05)。而不同质量浓度薏HRCECs苡仁油处理HRCECs48h,0.有增殖抑制作用,并存在浓各度浓度薏苡仁油对2.05,3薏苡仁油对体外培养的表1)。 的依赖性(P0.05vsAH组。 表2 薏苡仁油对体外培养的HRCECs中VEGF表达的影响组别AHA2 VEGF灰度值 ±s,n=4)(x¯ ALA1A3 92.76±2.69c 154.66±3.97 薏苡仁油是从禾本科植物薏苡的成熟种仁中提取出来的,1995年薏苡仁油注射用乳剂,即康莱特注射液(KLT)被国家正式批准用于临床治疗。主要用于抗癌治疗,其抗癌机制包括:(1)诱导癌细胞的凋亡和抑制癌细胞的增殖,Lu等[13]研究发现康莱特诱导细胞凋亡来抑制肝癌细胞生长,这可能是通过激活Fas/FasL途径。(2)增强放化疗的敏感性。(3)抑制肿瘤血管的生成。冯刚等[14]建立动物肿瘤模型检测KLT对其抑瘤率、肿瘤内血 111.66±7.44a,e 134.24±4.35a,e161.38±3.30a,e 注:aP<0.05vsAH组;cP<0.05vsAL组;eP<0.05:A1~A3各组两两比较。 3讨论 糖尿病的微血管并发症之一———糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR),其分为非增殖性和增殖性。两型的区别在于后者有视网膜新生血管(retinalneovascularization,RNV)的形成,新生血管生成可引起视网膜脱离、玻璃体出血等并发症。故增殖性视网膜病变对视力的危害性更大,严重者可致失明。RNV形成是一个高度复杂和协调的过程,查阅文献[8]得知:它首先发生血管扩张,血管通透性增加,然后经过血管壁基底膜酶的降解,内皮细胞的迁移、有丝分裂和周细胞的相互作用,导致血管腔形成。多种细胞因子参与其中,如肿瘤坏死因子(TNF)、VEGF、表皮生长因子(EGF)[9]。其中VEGF是一种分子量为34~50kDa的糖蛋白,广泛分布于各组织的 管密度、瘤体bFGF和VEGF表达的影响。结果表明KLT可抑制S180肉瘤生长和下调S180瘤体内VEGF和bFGF的表达。说明KLT抑制肿瘤血管形成的机制可能是降低VEGF和bFGF的表达。 张霞等[15]建立大鼠角膜碱烧伤模型,得出薏苡仁油抑制大鼠角膜碱烧伤后角膜新生血管(V)的形成与降低V的VEGF表达有关。所以本实验探讨了薏苡仁油对高糖环境下HRCECs增殖和VEGF表达的影响,以进一步阐明其对DR的治疗作用。本次实验MTT检测显示:不同浓度的薏苡仁油对高糖下培养的HRCECs的增殖抑制,并呈浓度依赖性,免疫细胞化学检测显示在高糖环境下的HRCECs中VEGF的表达增加,但是经过薏苡仁油处理后,高糖环境下HRCECs中VEGF表达明显下降。因此我们推理认为,薏苡仁油抑制高糖环境下HRCECs的增殖可能是通过下调VEGF的表达来实现但目前对薏苡仁油下调VEGF表达的信号通路以及具体调控点仍不清楚,需进一步探讨研究。 2149 国际眼科杂志 2014年12月 第14卷 第12期 www.ies.net.cn 8DistlerH,HirthA,Kurowska-StolarskaM,etal.Angio-genicand2003;47(3):149-161 9LeeYM,BaeMH,LeeOH,etal.Synergisticinductionofinvivoepidermalgrowthfactor.OncolRep2004;12(4):843-848retinopathy.CurrDiabetesRev2009;5(1):39-46 电话:029-82245172 82210956 电子信箱:IJO.2000@163.com 总而言之,在RNV的形成过程中,VEGF起着关键的作用,我们的实验研究显示:薏苡仁油能抑制高糖培养下HRCECs的增殖和下调VEGF的表达,从中得到提示:该药在DR的防治中具有潜在的应用价值。 参考文献 1易茜露,于明香.糖尿病视网膜病变的发病机制.复旦学报(医学2谢秀雯,周建强,崔红平.VEGF在糖尿病视网膜病变发病机制中作3SelimKM,SahanD,MuhittinT,etal.Increasedlevelsofvascular4WuLQ,LuY,LuHJ,etal.EfficacyofintratumorinjectionofKang-retinopathy.IndianJOphthalmol2010;58(5):375-379 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