胚胎移植及遗传基因生物工程科研项

胚胎移植及遗传基因生物工程科研项目 立项报告 ——（牛、马、羊的胚胎移植和繁育） 项目名称：胚胎移植及遗传基因生物工程科研项目项目性质：新建（校企合作） 项目单位： 宁夏工商职业技术学院 宁夏花儿生物科技有限公司 研发单位：宁夏花儿生物科技有限公司 联系人：王举通 联系电话：13259680701 申请时间：2014年12月2日 目录 第一章总论...................................................................................................3 1.1项目概况..........................................................................................3 1.2可行性研究报告编写依据..............................................................3 1.3综合..........................................................................................4 第二章项目研发背景、必要性...................................................................4 2.1项目研发的背景..............................................................................4 2.2项目研发的必要性..........................................................................6 2.3项目研发的有利条件.......................................................................8 第三章现状分析及预测...............................................................................8 3.1世界胚胎移植和繁育概况...............................................................8 3.2胚胎移植的历史回顾.......................................................................9 3.3胚胎移植的技术可行性.................................................................10 3.4细胞培养流程.................................................................................12 3.5胚胎移植的应用及发展趋势........................................................14 3.6冻精市场分析（以马为参考）....................................................14 3.7胚胎移植市场分析........................................................................15 3.8胚胎移植及细胞培养研发项目优劣势分析...............................16 第四章项目组织与管理.............................................................................17 4.1组织机构与职能划分....................................................................17 4.2技术培训........................................................................................19 4.3劳动保护与安全卫生....................................................................19 第五章研发方案.........................................................................................19 5.1研发规划与布局.............................................................................19 5.2研发方案........................................................................................20 1 5.3胚胎细胞培养及移植流程............................................................21 5.4 第六章胚胎移植......................................................................................27财务评价.......................................................................................285.5胚胎移植工艺流程........................................................................28 6.1财务评价依据................................................................................28 6.2产品销售收入、销售税金和附加估算........................................29 6.3产品成本估算................................................................................29 6.4财务评价结论.................................................................................33 6.5财务效益........................................................................................33 第七章存在的问题及解决手段.................................................................33 7.1存在的问题....................................................................................33 7.2胚胎移植的未来展望....................................................................34 第八章效益分析.........................................................................................35 8.1社会效益分析................................................................................35 8.2风险分析........................................................................................35 8.3市场风险........................................................................................35 第九章结论与建议.....................................................................................36 9.1建议................................................................................................36 9.2结论..............................................................................................36 2 第一章总论 1.1项目概况 1.1.1、项目名称：胚胎移植及遗传基因生物工程科研项目 1.1.2、办公及理论研究地点：银川市宁安南街490号育成中心1#16楼 1.1.3、研发单位：宁夏花儿生物科技工程有限公司 1.1.4、合作单位：宁夏工商职业技术学院 1.1.5、项目性质：新建（校企合作） 1.1.6、主要研发内容： 本项目依靠理论和实践相结合的方式，通过校企合作共建实验室的模式完成牛、羊、马的胚胎移植、繁育，在工商学院实训基地进行细胞培养实验和胚胎移植实验，在育成中心完成理论及课题研究工作。项目总投资90万元，其中办公设备和化学仪器等共65万元，赞助细胞培养和胚胎移植科研经费25万元。 1.2可行性研究报告编写依据 1、《华人民共和国畜牧法》； 2、《中华人民共和国国民经济和社会发展第十二个五年规划纲要》； 3、农业部《农业投资项目可行性研究报告一般格式和要求》； 4、研发部《研发项目经济评价方法与参数》； 5、国家发展和改革委员会《投资项目可行性研究指南》； 6、农牧发【2010】6号《关于加快推进畜禽化规模养殖的意见》； 7、农业部《关于加快西部地区特色农业发展的意见》 8、宁夏回族自治区农牧厅农业产业办公室《关于扶持农业特色优势产业发展的意见（2012-2015年）》 3 9、自治区党委、自治区人民政府《禽畜规模养殖污染防治条例》 1.3综合评价 研究种牛、羊、生物工程胚胎细胞培养和胚胎移植，大力发展胚胎移植和繁育是促进宁夏农业和农村经济结构调整，提高农牧民收入和人民生活的需要，是提高农牧民收入和人民生活的有效途径，是加大科技投入、提高产品竞争力、提高企业收益、增强服务“三农”、服务社会的需要。 通过对项目社会效益、生态效益、财务运行等方面的具体分析计算以及对项目研发的必要性、种群市场前景的分析、研究，本项目符合国家及自治区产业发展政策，项目科技含量高，种群市场需求大，发展前景广阔。 通过项目的实施，辐射带动全区胚胎移植和繁育结构的调整和发展，可有力的推动种群产业化进程，提高自治区科学技术实力，促进宁夏经济社会可持续发展，本项目的研发是完全必要的也是切实可行的。 第二章项目研发背景、必要性 2.1项目研发的背景 胚胎移植和繁育是我国畜牧业发展中经久不衰的活力产业，具有良好的群众氛围基础。随着国际胚胎移植和繁育规模的不断增长，竞技马的需求不断攀升，对种群的血统也得到了前所未有的关注度。如何快速繁育良种种群成为了世界胚胎移植和繁育发展的焦点所在。 本项目从宁夏区情出发，遵循经济规律和市场规律，以市场为导向，立足本地，着眼长远，尽快培育和壮大胚胎移植和繁育，努力把优势资源充分转化成经济优势，是今后的发展方向。随着人民生活收入水平的提高，对马社交的需求刚性增长。 4 宁夏胚胎移植和繁育发展的主导趋势是：生产方式逐步从传统方式向现代化转变，规模化、集约化饲养将成为胚胎移植和繁育的主流。充分利用优质种马父本和母本的特性优势，大规模开展经济繁育，扩展优质种群，建立社会化生产服务体系，是胚胎移植和繁育快速、健康发展的总体方向。 本项目以宁夏花儿生物科技工程有限公司为主体，带动区域种植、养殖户。通过建立胚胎移植和繁育繁育工程研发，形成规模化产业化生产格局，推动宁夏胚胎移植和繁育发展。 在家畜改良方面的应用 在特定品种扩繁上的应用 在动物生物多样性上的应用 其它方面应用：转基因动物、性别控制、体外受精 2.1.1、在家畜改良方面的应用： 人工授精技术可成几十到几百倍地提高了优秀种公畜的配种效能，但对优秀母畜来说，受其产仔数和世代间隔的限制，尤其是牛羊等繁殖力较低的畜种更是如此 通过超数排卵和胚胎移植技术（multiple 70%；产奶性状提高33% 2.1.2、在特定品种扩繁上的应用： 牛羊等低繁殖力家畜，从引进到形成一个纯种群体需要7-8个世代，15-20年，而采用MEOT法，一次就可获得一个纯种群体 80年代初，美、澳、新从欧洲引进的大型肉牛品种均采用胚胎移植技术扩繁，2000年前后，我国的波尔山羊也是采用胚胎移植进行扩繁。 2.1.3、在动物生物多样性上的应用： 在保护动物遗传资源，提高家畜生产性能，挽救濒临灭绝的野生动 5ovulationandembryotransfer:MOET)牛羊的生长性状年遗传进展可比正常繁殖提高80%和 物方面，胚胎移植技术越来越发挥出重要作用 冷冻能够很好地保存濒临灭绝动物的胚胎或生殖细胞，但该种动物雌性个体的减少，也是这种动物的胚胎或生殖细胞无法得到移植，科学家开始研究在该种动物的亚种或亲缘种中试验，并取得一些成功，如斑马胚胎移植给马，蒙古马胚胎移植给驴，白肢野牛移植给荷斯坦牛。 2.1.4、其它方面应用： 胚胎移植是克隆技术的必须过程，体外受精必须借助胚胎移植实现“试管婴儿的继续发育”转基因及动物生物反应器的研究也必须借助胚胎移植。 2.2项目研发的必要性 2.2.1项目研发是实现畜牧业现代化必然要求 规模化养殖、科技化繁育是畜牧业科技水平高低的体现，也是畜牧业生产由粗放数量型向血缘品种效益型转变的基础。虽然近年来我国胚胎移植和繁育的发展速度保持强劲的增长势头，但马的生产水平仍然较低、牛羊的繁育规模仍然较小。发达国家多采用胚胎移植进行生产，国内现在还没有采用这种方式，仍然停留在自然受孕和杂交等靠近传统的方式上，严重限制了牛、羊、马等现代畜牧业规模化繁育的市场需求。因此，从长远来看，随着国内外市场的逐步融合，我国胚胎移植和繁育所面临的挑战不容轻视。本项目通过种牛、羊、生物工程研发，加大马品种的改良速度，加快马繁育市场的推广与发展，进一步提高科学饲养的专业化及标准化管理，形成高产值、高效益、高科技含量的现代化胚胎移植和繁育，因此项目研发是实现畜牧业现代化的关键举措。 2.2.2项目研发是现代畜牧种群改良和市场发展的需要 种畜是畜牧业发展的重要物质基础。推进种畜产业持续健康发展，对于加快研发现代畜牧业、保障畜产品有效供给和促进牧民增收具有十 6 分重要的意义。种畜场是种畜供应的主体，原种场作为良种供应辐射力强的种畜场类型之一，对稳定种畜禽生产又具有重大意义。 宁夏曾作为历代军马养殖基地，水草丰美，造就了马品种基因资源丰富的特殊优势。但由于产业发展缓慢，品种资源和经济效益迟迟得不得良好的发挥。因此，应加强种马的培育和品种筛选，以满足现代化胚胎移植和繁育对良种的需求。 2.2.3项目研发是企业自身发展的需要 宁夏花儿生物科技工程有限公司自成立以来，积极采用引种和育种相结合的路线，并进行胚胎移植和繁育配套设备及产品的开发，现已从国外引进九匹优质纯血种母马，年产马驹六匹，胚胎千枚，已在国内胚胎移植和繁育良种繁育领域构建了核心竞争力。 为进一步做好牛、羊、马繁育工作，公司拟在种马领域实施良种工程研发，并且与2014年1月在银川市兴庆区月牙湖乡研发了种马场，现在该场工程研发已完成10%，饲养种群12匹。配套饲料生产及加工设备已采购到位，为企业拓展新的经济增长点。 2.2.4项目研发是促进农牧民增收的需要 本项目通过牛、羊、生物工程研发拉动饲草料种植业快速发展，促进循环经济发展。牛、羊、生物工程研发项目专业化分工明确细致，集标准化饲养、集约化管理等于一体，集成了现代胚胎移植和繁育的多项技术成果。本项目建立的胚胎繁育运作模式，必将充分展示优良品种、科学饲养、现代管理等因素对胚胎移植和繁育发展的巨大作用，带动区域经济的发展，增加农牧民收入。因此，项目研发是推动区域经济发展实现农牧民增收、胚胎移植和繁育增效的有效途径。 2.2.5项目研发是牛、羊、马繁育体系研发的需要，我国到了20实际70年代开始进行液氮冷冻精液的研究和推广应用，80年代从国外开始引进马冷冻精液的技术和设备。经过40余年的研究发展，生产工 7 艺已相当成熟，主要是利用液态氮（-196℃）作为冷源，将经过处理后的精液及卵子进行冷冻并保存。从而解决了精液及卵子长期保存的问题，使其不受时间、地域和种畜生命的限制。在解冻后通过复活处理即可受精形成胚胎，极大限度的发挥和提高优良种马的利用率，加速品种的育成和改良。同时，对优良种马在短期进行后裔测定，保留和恢复某一品种或种马的优秀特性，在进行血统更新、引种、减低生产成本等方面具有重要意义。因此，项目冷冻实验室研发是种马繁育体系研发的重要一环。 2.3项目研发的有利条件 2.3.1项目研发有坚实的组织保障和技术支撑 宁夏花儿生物科技工程有限公司位于银川市高新技术开发区IBI育成中心16楼，是银川市高新技术开发区管委会重点培育企业，也是目前宁夏唯一一家从事胚胎移植繁育研究的企业。 公司在月牙湖乡建有一座种马繁育基地，下设行政部、财务部、技术部、育种部、销售部、采购部、生产部等七个部门，主要从事牛、羊、马的胚胎细胞培养和繁育研究、饲料生产、培训咨询及销售业务。 目前共有员工30人，其中高级管理人员2名，中层管理人员4人，技术人员5人，销售人员10人及其他办公人员10人。 公司现与宁夏工商职业技术学院共同研发，确保种牛、羊、马的基因筛选与传承。 第三章现状分析及预测 3.1世界胚胎移植和繁育概况 1991-2000年国际胚胎移植状况，结果表明胚胎移植已成为畜牧产业中最活跃的领域之一。胚移比例最大的依然是牛，其他种类的动物胚 8 胎移植，如：绵羊、山羊、猪、马、鹿、美洲驼、羚羊等，也十分活跃。牛的胚胎移植，有几个重要指标分析结果如下：(1)供体牛的品种分布基本相同，肉牛与奶牛所占比例接近，但不同国家之间差别很大；(2) (3)鲜胚移植与冻胚移植的比每头供体牛所得可用胚胎数在5-6枚之间； 例基本持平，但近年来冻胚移植的比例稍大于鲜胚移植；(4)通过IVF (5)妊娠率：体外方式生产胚胎数目有所增长，目前每年大约在3-4万枚； 鲜胚移植妊娠率在60%以上，冻胚移植妊娠率在50%以上，IVF体外方式生产胚胎妊娠率在40%左右；(6)胚胎移植技术的发展状况在全世界分布不均衡，北美和欧洲胚移技术最成熟；(7)胚胎贸易有所增长。 3.2胚胎移植的历史回顾 1890年Heape在英国剑桥大学首次报道获得兔子胚胎移植成功[1]。20世纪30年代后开始大量研究，1951年willett首次成功地进行了牛的胚胎移植。1974年第一头胚胎移植的何斯坦奶牛在美国出生。1976年，一些研究小组报道了采用导管高效采集胚胎的非手术方法，随后胚胎移植在奶牛中的应用得到飞速发展。由于牛经济价值高，产仔数量少，用胚胎移植技术进行纯种扩群繁殖的效果好，且供受体牛均可反复使用，因此牛的胚胎移植技术已较多应用于实际生产中[2]。我国对牛胚胎移植研究起步较晚，1978牛手术法胚胎移植犊牛降生，1980年非手术法移植成功，1982年冷冻胚胎移植成功[3]。本世纪韧，我国先后开展了“万枚高产奶牛胚胎移植富民工程”项目，“奶业重大关键技术研究与产业化技术集成示范”项目，使我国的胚胎移植技术得以较快发展与推广，并逐步向产业化阶段迈进[4]。根据IETS(国际胚胎移植协会)的统计，1991年全世界移植牛胚胎总数为240730枚，到2000年全世界移植牛胚胎总数达528540枚。从1991-2000年，国际胚胎移植总数增长120％。胚胎移植已经发展成为畜牧业中最活跃的领域之一[5]。 9 2.1991—2000年世界胚胎移植，移植的牛的胚胎总数的统计与分析1991年全世界移植牛胚胎总数为240730枚，1995年牛胚移总数首次超过40万枚，2000年创造50多万枚的新记录。以ITES提供的胚移妊娠率为参考(按平均60％计)。全世界在该年有30多万头胚移牛产生。而且IETS的统计数据还不能包括世界上所有的地区，特别是亚洲地区，因此这些数据要比实际要低一些，但这些数据已充分说明胚胎移植已成为畜牧业中最具前景的实用繁殖技术之一[5]。因为畜牧业的现代化(即家畜良种化、饲养管理科学化、生产方式工厂化)的实现，其中心是提高优良家畜的繁殖效率。如果繁殖率低下，优良家畜的数量扩大受到限制，畜群的质量就得不到提高，则奶、肉、毛等畜产品的增加就都成了空话。胚胎移植可以使优良母畜的繁殖率得到很大的提高，从而给养殖者带来更大的收益。在牛的胚胎移植中，有几个数据为人们所关心：(1)供体牛品种的分布：胚胎移植的状况因地域不同有很大差异；(2)可用胚数目：每头供体所得可用胚数在5—6枚之间；(3)鲜冻胚移植比例：鲜胚移植与冻胚移植的比例基本持平；(4)胚胎生产方式：体内方式生 (5)产胚胎的规模继续扩大，体外方式生产胚胎的研究与应用继续加强； 妊娠率胎移植的技术：由于技术经验的积累，移植后的妊娠率总体上有缓慢的提高；(6)地理分布：胚胎移植技术的发展状况在全世界分布不均衡。 3.3胚胎移植的技术可行性 3.3.1供受体的选择（以牛为参考） 供体选择是胚胎移植的前提，应注意以下几点： 1、具备遗传优势的育种价值，即选择产奶、产肉量高，乳脂率、蛋白含量高，肉质好的母牛，祖代中或本身产过双胎的个体较好。 10 2、具有良好的繁殖力，既往繁殖史好，易配意孕，分娩顺利，无难产或胎衣不下现象，发情周期正常，发情体征明显。 3、年龄以4～7岁经产牛为宜。 4、营养良好，体质健康，生殖器官正常，无繁殖疾病。 5、分娩70天后方能进行超排处理。 6、卵巢活性正常，卵巢质地有弹性，黄体功能好，超排前供体牛血清孕酮含量3．0ng／ml或以上，总胆固醇含量140ng／100ml或以上，可作为选择供体牛的参考指标，据统计，按上述标准严格选择供体牛，可获得超排率80%以上。受体牛的选择在胚胎移植中同样占有重要地位。发情周期正常，无产科疾病，营养状况良好均可作为受体牛的初步选择对象。但为了保证较高的移植妊娠率和体现胚胎移植的应用价值，尽量选择青年母牛和低产母牛做受体。受供体牛比例一般为1：6—8[8]。 3.3.2同期发情 同期发情技术时牛胚胎移植技术的主要环节之一，这可使在同一时间内为超数排卵供体牛准备足够可用于移植的受体，另外就是使同期化处理的受体牛群和供体牛群再同期化，达到供受体处于相同的生理状态。该技术的原理是根据母牛在发情周期卵巢具有不同变化时期的特点，即卵泡期和黄体期交替出现。人为的利用外源性激素调节，使母牛的发情周期达到同一生理变化水平，从而实现牛只同期发情的目的。方法基本有两种：其一是通过对停药后即可达到同期发情，其二是注射前列腺素溶解黄体促使母牛在一定的时间内发情、排卵、从而实现同期发情[9]。 3.3.3越数排卵 在母牛发情周期的适当时间，注射促性腺激素，使卵巢中有较多的卵泡发育和排卵，这种方法称为超数排卵。在进行胚胎移植时要对供体 11 母牛做超数排卵处理，以使一次取得多枚胚胎。一般认为超排擞最好是l0个左右，太少会降低胚胎移植的意义，同时胚胎的收集也有困难，排过多易引起诸如排卵效果不稳定，卵泡囊肿等不良后果。超排处理的一般方法是在预计发情到来之前4天，即发情周期的第16天注射促性腺激素，在出现发情的当天注射绒毛膜激索，为了使排出的卵子有较多的受精机会，一般在发情后输精2—3次，每次间隔8一12小时。母牛对超排处理的个体反应差异较大，受到母牛的品种、年龄、状况、生理状态、制剂质量、投药方法和剂量等各因素的影响，因此需要在实践中不断探索和总结。 3.4细胞培养流程 3.4.1胚胎的采集 利用冲洗液将胚胎从母畜生殖道中冲出，并收集到器皿中过程称为胚胎采集。采集方法分手术法与非手术法，其中后者已在生产上普遍应用，通过带气囊的导管使气囊膨胀将导管固定在子宫角内适宜位置并防止冲洗液倒流，在用注射器通过单路管将冲洗液注入子宫角，反复几次后将冲洗液吸回注射器，再注入集卵杯内。 3.4.2胚胎的检测 在显微镜下对胚胎进行质量鉴定，根据胚胎的形态、分裂球的大小、均匀度、透明带的间隙和变形情况，将胚胎分裂分为四级。其孛一级胚胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和液胞。二级胚胚胎轮廓清晰，色调和细胞密度良好，可见的少量附着的细胞和液胞，变性细胞约占10％-30%。一般而言，一、二级胚胎适于移植，后两级不宜移植。 12 3.4.3胚胎的保存 冷冻保存有效的延长了胚胎的保存年限，相当于极大的延长了动物的世代间隔，也便于保种。通常有以下三种保存法： ①．常规冷冻保存法：目前此法已经是一项成熟的技术，大多数哺乳动物胚胎保存仍然采用传统的平衡冷冻法。其基本方法为：先将牛胚胎放入防冻液中平衡一段时间，装管：以每分钟0．3～0．5℃的速度降温至一7℃，植冰，然后缓慢降温至一35℃：平衡10分钟后，投入液氮中保存。 ②．直接冷冻法：是一种比较简单的牛胚胎冷冻方法。它是由常规的慢速冷冻法改进而来的，其要点是细管的冷冻液和稀释液是分开的，牛胚胎直接冷冻的研究大多采用甘油-蔗糖一起作为防冻剂。 ③．玻璃化冷冻法：玻璃化是指液体转变为非晶态(玻璃态)的固化过程，Rail和Fahy在1985年首先发明了玻璃化冷冻法，他们首次提出了一种有效的玻璃化溶液，Mahmoudzadah等在1995年采用玻璃化冷冻液进行牛胚胎冷冻保存试验。结果表明，采用两步平衡法，其胚胎的存活率明显高于一步平等法。 3.4.4胚胎的解冻 细管从液氮罐中取出，在室温下保持6s，然后把细管水平的放置在35℃的温水中浸渍15s，持封口部摇晃细管，使装有胚胎的防冻剂与防冻剂除去液混合，并在室温下封口朝上直立静置7～10min后，剪去封口装入移植器进行移植。 3.4.5胚胎移植 多采用非手术移植法，使用特制的胚胎移植器，通过阴道和子宫颈，将胚胎注入到子宫角的一定部位。操作时动作要稳、快，移植部位要准确，移植后检查细管，看有无胚胎遗漏，如有遗漏需重新移植，胚胎移植后要注意观察供体和受体的健康状况和在预定的时间内是否发情。至 13 此，胚胎从供体到受体“安家落户”完成了一个生命两个阶段的有机衔接，踏上了正常发育之路。 3.5胚胎移植的应用及发展趋势 3.5.1能加快纯种动物和优良品种的繁殖速度 充分发挥优良母畜的繁殖潜力，提高其繁殖效率，迅速增加优良母畜的后代数量，最大限度地延长具有优秀遗传特性母畜生产后代的时限。母畜性成熟后，妊娠和哺乳占去了大部分时间。在实行该技术的情况下，将良种母畜的胚胎移植到其它母畜体内而不需要在供体内完成胚胎后期发育，这样，良种母畜就减少了妊娠和哺乳的过程，使繁殖周期无形中被缩短。更重要的是由于实行了超数排卵处理，一次可获得多枚胚胎，因此，无论从一次配种或一生繁殖来看，都能产牛比自然状态下超数倍的后代，使良种母畜的个体性能得到更大的繁衍。 3.6冻精市场分析（以马为参考） 3.6.1提高优秀种马的配种效率： 对马进行人工授精和胚胎移植可提高种公马与种母马与配数量，大幅度提高了种马的配种效率，使优秀种马的优良性状得到了充分利用。 3.6.2加速品种改良步伐和育种工作进度： 对马进行人工受精和胚胎移植技术可突破时间和地域的限制，使最优秀的种马得到充分利用，扩大其优良遗传基因的影响。并可加速品种改良步伐，提供完整的配种记录，保证了配种计划的顺利实施。 3.6.3降低配种生产成本： 人工授精配种和自然交配相比，使种马的公母比例提升至1:300，相对减少饲养种公马的数量，节省了部分人工、饲料、栏舍、设施、资金的饲养管理费用，从而提高了经济效益。 14 3.6.4防止疾病传播 采用人工受精和胚胎移植配种可以防止接触性传染疾病的传播。另一方面，对检查出的患有生殖道疾病的种群可进行正确治疗，扩大其适龄母马的数量。 3.6.5有利于提高母马的受胎率 在人工受精和胚胎移植配种之前，首先要对母马进行发情鉴定。这样既可以准确掌握适宜配种的时间，又可以及时发现与治疗难孕母马，淘汰不孕母马，降低了空怀率，提高了母马受胎率。 3.6.7推广种马人工受精的潜力巨大 据中国马协统计，全国每年要进口一万余匹纯血马、温血马进入国内马术竞技领域。若我国将全部进口转为人工授精繁育。以市场行情购买一匹纯血/温血马50万人民币计算，购买种群需要50亿元，而进行人工受精繁育，按照70%的成活率计算，繁育一万匹马需要一万四千三百枚胚胎，每个胚胎的费用以两万元计算，繁育仅需要3亿元，远远低于购买的价格。因此，推广种马人工受精的效益显著，潜力巨大。 3.7胚胎移植市场分析 3.7.1世界胚胎移植概况 自从1890年Heape在英国剑桥大学首次报道获得兔子胚胎移植成功以来，胚胎移植技术已有120多年的研究历史。20世纪50年代，胚胎移植的研究越来越多，对各种家畜均获成功，主要有牛、马、绵羊、山羊、猪等。1975年1月在美国科罗拉多州召开了第一届国际胚胎移 15 植学会成立大会，标志着胚胎移植技术进入了更高的发展阶段。 3.7.2中国胚胎移植概况 在我国，这一技术起步较晚，1973年家兔胚胎移植成功，但直至1982年才将马胚胎移植成功。目前，我国正处在有传统农业向现代农业产业化体系的过度阶段，而实现畜牧业的良种化是农业现代化的重要环节。我国是世界养马大国，所以，改造我国养马业现状的任务极为重要，需要大量的良种马来改良，通过杂交改良的速度很慢；依靠进口需要大量外汇。 3.8胚胎移植及细胞培养研发项目优劣势分析 3.8.1优势 1、成本优势：种群销售目前仍以销售马驹为主，但价格越来越高，已经偏离了马自身的价值。而使用冻精，每匹马的配种费用（包括服务费）仅为80元左右，比用直接交配的方法减少了100元，推广价值很大。 2、先发优势，国内目前尚未大面积推广种群冻精，仍然停留在小范围试验阶段，项目可先立足于市场； 3、资金优势，国内种马场培育品种受资金影响较大，培育效果不甚理想，而公司可利用上市募集资金，集中优势打在优质冻精及服务模式； 4、使用冻精的市场推广已经具备市场基础，具备快速拓展并垄断市场的能力。 3.8.1劣势 一是要求制作高密度冻精，一次的输精量保证在2.5亿含金量，解 16 冻后的活率为40%以上的精液可用于输精。 二是员工饲养管理水平较低，需要加强培训。 第四章项目组织与管理 4.1组织机构与职能划分 本项目属宁夏花儿生物科技工程有限公司与宁夏工商职业技术学院合作的胚胎移植及细胞培养科研项目立项报告，项目研发及建成后的运营均由宁夏花儿生物科技工程有限公司经理班子全面负责管理，公司将采用先进的劳动组织形式，科学组织、合理使用劳动力，明确分工与协作，充分发挥劳动者的技能和积极性，保证企业生产正常运行，提高企业经济效益。 胚胎移植及细胞培养科研项目立项报告实行管委会负责制，由工商学院与宁夏花儿生物科技分别牵头负责整个研发项目的运作。工商学院实训处设专人组织课题和统筹参与研发的教师队伍。宁夏花儿生物科技组织学术申报及实验工作。 17 校企合作管理委员会 工商学院（实训处）花儿生物（科技部）实科综细移课训研胞植题办办合 培 公公办养实研 训发 室室公 室室室部 18 4.2技术培训 本项目在投入运行之前，在本年度选派其中3-5人到外地学习冻精制作，细胞培养等技术，从项目实施初期就建立标准的操作方式。同时请相关的技术专家到基地讲课，对全体职工进行定向的技术和业务培训，不断的全面提高职工的专业技术水平。 每月至少培训一次，每次一天；主要内容为专业知识、岗位技能、职业素质、职业道德。 全部管理员工必须进行岗前培训，合格者方可上岗。兽医技术员上岗前必须接受兽医临床实习，具有一定的防疫治疗经验后，方可独立工作。对职工进行三级安全教育，造就一流的业务、技术骨干。 4.3劳动保护与安全卫生 各建筑物之间严格按照建筑防火设计规范留有足够的空间，以保证安全消除火灾隐患；草料堆场严加防范并设置消防池。 全体职工定期体检，不符合畜牧业养殖卫生要求的人员禁止上岗，岗前应进行安全生产知识、消防知识教育及培训。制定安全#管理#及奖惩制度，生产过程中严格按操作规程操作，定期对各种设备进行检查维修，以确保职工人身安全及生产的正常运行。 第五章研发方案 5.1研发规划与布局 宁夏花儿生物与工商职业技术学院通过共建实验室模式，实现胚胎移植和细胞培养的研发，项目将理论研究与实践操作相结合，理论工作在银川市金凤区宁安南街育成中心完成，实验工作在工商学院实 19 训基地完成。 5.2研发方案 本项目研发内容包括冻精、胚胎实验、采精室、胚胎分割，细胞培养和胚胎移植等工作，需要购置胚胎移植设备、灌装机等设备机械；购进移植用受体和供体； 胚胎移植及细胞培养设备明细表 20 5.3胚胎细胞培养及移植流程 见附件一： 5.3.1冻精生产技术方案 供体精液质量直接影响着种群整体繁殖性能的发挥及生产任务的完成，因此科学饲养及合理使用种马是发挥其最佳种用性能的前提和保证。采精期应重视和加强种马的饲养管理，使其常年保持中上等膘情、健壮的体质、充沛的精力、旺盛的性欲和良好的精液品质。 21 22 23 24 5.3.2精子密度评定 根据采精量、原精液精子活率、精子密度以及预测冷冻后精子活率、每份精液量来确定精液的稀释比例和应加入的稀释液量，以保证每份精液中含有2.5亿有效精子数 5.3.3精液的平衡和分装 精液的平衡 稀释后的精液在2-5℃的冰箱及低温操作柜中作平衡处理2-3H。与此同时，还应将事先印字标记的待装细管及其托盘架也放在低温操作柜中预冷至2-5℃。 精液分装 在平衡处理过程的后期，利用精液装管机在2-5℃的低温操作柜中制作细管精液，并码排在托盘架上，待平衡时间结束，即可进入冷冻细管操作。 25 5.3.4精液的冷冻 用液氮罐生产冷冻精液，可将码排有精液细管的托盘架置于专业冷冻仪中，在低温温度计的监测下，按照规定的降温曲线完成精液冷冻过程。 5.3.5精子活率评定 完成冷冻的细管精液，每匹公马均需抽样检查冷冻后精子活率。精子活力在0.3以下的细管精液必须废弃。采用细管托盘架冷冻的细管精液，经检验符合国家质量标准要求才允许分装入袋。 5.3.6精液的预贮及入库 冷冻后经检验合格的细管精液，必须在液氮罐预贮2天，再经精子活率评定，合格后方可交付入库。 5.3.7冻精质量控制和检测 冻精质量是项目的生命线，采取行之有效的方法和制度，才能保证生产出高质量的冻精产品，冻精质量控制和检测主要是剂量、活力、有效精子数、畸形率、顶体完整率、存活时间、细菌菌落数的检测。 5.3.8胚胎移植技术方案 胚胎移植的基本程序包括供体超排与受精，受体同期发情处理、采卵、检卵和移植。 26 5.3.9胚胎回收 从供体收集胚胎的方法有手术法和非手术法两种。由于手术法对供体的损伤较大，公司采用非手术法收取胚胎。 非手术采卵一般在输精后5-7天进行。可采用二路导管的冲卵器。导管中一路为气囊充气用，另一路为注入和回收冲卵液用。 冲卵液多数为组织培养液，如林格氏液、杜氏磷酸盐缓冲液、布林斯特氏液和TCM-199等。冲卵液温度使用时应为35-37℃，每毫升要加入青霉素1000国际单位，链霉素500-1000微克，以防止生殖道感染。 5.3.10胚胎检查 检卵：将收集的冲卵液于37℃温箱内静置10-15分钟。胚胎沉底后，移去上层液。取底部少量液体移植平皿内，静置后，在实体显微镜下先在低倍（10-20倍）下检查胚胎数量，然后在较大倍数（50-100倍）下观察胚胎质量。 吸卵：吸卵是为了移取、清洗、处理胚胎，要求目标明确，速度快，带液量少，无丢失。吸卵可用1毫升的注射器装上特别的吸头进行，也可使用自制的吸卵管。 胚胎质量鉴定：正常发育的胚胎，其中细胞（卵裂球）外形整齐，大小一致，分布均匀，外膜完整。无卵裂现象和异常卵都不能用于移植。 5.4胚胎移植 一般在受体发情后第六至九天进行，过早移植会影响受胎率。采用胚胎移植枪和0.25毫升细管移植的效果较好。将细管截去适量，吸入少许保存液，吸一个气泡，然后吸入含胚胎的少许保存液，吸入一 27 个气泡，最后再吸取少许保存液。将装有胚胎的细管装入移植枪内，通过子宫颈插入子宫角深部，注入胚胎。移植要严格遵守无菌操作规程，以防止生殖道感染。 5.5胚胎移植工艺流程 优秀种马供体通过饲养-----超排------人工授精-----采卵流程共约三周，采卵后供体马返回马厩，全年优秀供体母马共流动生产两批次。采集的卵胚随后进入鉴定、分割、移植、冷冻、保存、销售等流程。 2015年移植种群周转计划见表1-1 表1-1 2016年以后每年推广冻精3000剂，优质胚胎1000枚； 第六章 6.1财务评价依据财务评价 根据国家现行财务制度和价格体系，按照国家发改委颁发的《研发项目经济评价方法与参数》、轻工总会编制的《研发项目经济评价方法轻工行业》和国家发改委颁发的《投资项目可行性研究指南》进行评价。 28 6.2产品销售收入、销售税金和附加估算 6.2.1产品销售和销售收入 本项目中销售收入主要是冻精和胚胎。 每剂冻精销售价2000元， 每枚冷冻胚胎售价2万元， 6.2.2销售税金及附加 营业税：根据营业税暂行条例，本项目免征营业税； 增值税：免征； 企业所得税：根据国家现行政策免征。 6.2.3总成本及经营成本估算 6.3产品成本估算 依据本项目技术方案提供的物料消耗确定单位产品消耗定额。外购原材料价格根据宁夏历年价格指数和企业近年来生产实际情况以及参考市场平均价格来确定单位产品成本费用。企业自己种植的饲草料按成本价格已换算为入库价格。苜蓿等混合干草1.5元/KG，精饲料 2.5元/KG；冻精生产费用每剂500元；胚胎生产费用每枚680元；疫病治疗、药费1000元/匹；胚胎移植费用每剂2000元；液氮2元/KL；辅助材料费用12000元/月。 人工费：育种、配种及胚胎移植人员10人，年均6万元；冻精采集及制作技术人员10人，年均5万元；兽医技术人员2人，年均6万元；管理人员3人，年均10万元。 29 2014年出栏、存栏及年销售收入情况 品名 年初 外购 成年种公羊成年母羊羊羔 合计 3522582 4848 22 年内增加生产 育成 存栏 年内减少销售 淘汰 2014年8月25-12月31日 年末 死亡 352 44 69124 销售收入 000200 2014年末无销售收入，新增羊羔44只，每只按估价1000元计算，年末羊只新增资产44000元，淘汰羊每只按100元估价（仅皮价），共计年末新增资产44200元。死亡率按5%计算，淘汰率按7%计算。 2014年8月25日至年末饲养成本为：单价：元 成本/费用人工费饲料水电费检疫消毒费 数量1（4月）4482 总 计 单价30003837.610010 小计1200015350.440082028570.4 新增收益实际收益 4420015629.60 30 注：实际收益为减去人工费、饲料费、电费及检疫消毒费用后，用年新增资产减去成本费用。即：2014年实际收益为15629.60元。 2015年出栏、存栏及年销售收入情况 年内增加 品名 成年种公羊成年母羊羊羔 2015年1月-12月31日 年内减少 转出 销售34 8 3535 34 8 246 淘汰 死亡 年末37758138 年初35269124 淘汰/销售单价 外购生产育成3435 销售收入40800 120000 620 62 合计100048800 注：2015年收入为销售收入48800元，淘汰羊只按照每只1000元计算。新增存栏羊14只，每只按市场价估价为1500元，共计21000元。羊绒：5952元，待产羊羔62只，按照每只500元计算，共计2015年待产羊羔总价为：31000元，2015年新增资产为106752元。 2015年饲养成本为：成本/费用 数量 单价 小计 新增收益 单价：元 实际收益 31 人工费 饲料 水电费 检疫消毒费1（12月）1212124 总计30003837.6100103600046051.21200124084491.2销售：48800新增养只：58新增：2100022260.822260.8 注：实际收益为用年新增资产减去成本费用。即：106752-84491.2=22260.8元。 32 6.4财务评价结论 综上分析，项目财务效益较好，投资回收能力较强，可以说项目经济合理，财务效益可行。但是通过不确定分析可看出，营业收入降低会使项目效益大幅度下降，对项目效益影响较大，因此项目也存在一定的风险，建议在实施过程中，采取有效措施注意防范风险。 6.5财务效益 本项目达年销售收入为1060万元，总成本为430万元，年新增利润为630万元；财务内部收益率24%，财务净现值245万元，静态投资回收期4年，动态投资回收期5年，投资利润率146%，销售收入利润率110%，总成本利润率23.8%，从财务效益方面分析该项目盈利能力较强。 第七章存在的问题及解决手段 7.1存在的问题 我国限制胚胎移植技术推广应用的因素及解决措施胚胎移植技术已有100多年的历史，并且该技术也已日趋完善，但在我国一些地区实际应用推广中效果并不理想，主要原因体现为以下几点。 1、规模饲养集约化程度低 与国外相比我国的集约化饲养程度低，多为养殖户散养，疫病防治、饲养管理的水平很低，致使群体的状况差异很大，繁殖疾病比较普遍，而胚胎移植技术对供受体的要求又很高，这就导致了胚胎移植妊娠率低，效果不理想，也使养殖户对该项技术产生了怀疑，因此制约了胚胎移植技术的推广应用。要解决这一问题必须提高集约化生 33 产程度，提高群体的健康水平，减少疾病，尤其是繁殖疾病的发生，提高胚胎移植效果，使养殖户对该项技术有积极性，才能更好的推广该项技术。 2、胚胎移植技术还需要进一步的完善胚胎移植技术的发展已有l00多年的历史，在这期间胚胎移植技术不断得到提高和完善，但仍然存在很多问题，如妊娠率低、操作烦琐、技术环境条件要求高胚胎移植费用高等，另外加之我国集约化饲养程度低，移植现场条件较差，致使胚胎移植妊娠率偏低，效果差，这些都不利于胚胎移植技术的推广和应用．应结合当地的条件和群体的状况，并结合其它生物技术不断的改进和完善胚胎移植技术的各个环节，简化操作，降低胚胎移植费用，使养殖户乐于接受该项技术。 3、掌握胚胎移植技术的人员少，推广面积小真正掌握该项技术的人员相对较少，实际推广应用的范围小，有些养殖户甚至不了解该项技术。因此应该积极开展胚胎移植技术的培训工作，培养大量的胚胎移植操作人员，大范围的开展胚胎移植技术的应用，才能有效地改变我国畜牧业发展中存在的良种覆盖率低的问题。 7.2胚胎移植的未来展望 胚胎移植技术作为现代生物技术中的一项重要的应用技本，日趋成熟。该技术将会加快牛等牲畜繁殖选育的速度，缩短其生产性能改良所需时间及世代间隔，充分发挥优秀母畜的遗传和繁殖潜力,快速扩大优秀种畜后代群体，培育出更多符合人们需要的理想的品种。随着活体采卵、体外成熟等技术的完善及借助克隆、转基因等技术，将使得胚胎移植更深入的研究以促进各相关学科的协同发展，使人们更加深入地了解生殖机理，这反过来又会对胚胎移植技术的进一步发展起促进作用。动物胚胎移植技术的前景广阔，相信不久的将来定能推动 34 我国畜牧产业的快速发展。 第八章效益分析 8.1社会效益分析 胚胎细胞培养和移植及冻精制作属于有弹性或有单位弹性的产品，产量的增加造成的价格下跌不会造成总收益的下降，因此扩大的生产能力将增强种马场经济规模和实力。 该项目研发成功后将促现代畜牧业种群的品种改良工作，加快畜牧业经济的快速、高效的发展。 项目的顺利实施，将促进马品质的全面提高，实现畜群在有限的自然资源基础上增产增值，提高农牧区人民群众的生活水平、促进少数民族地区的安定团结和民族经济的可持续发展具有深远的社会意义。 8.2风险分析 本项目存在的主要风险有疫病风险、市场风险、自然灾害风险等，在运行中要注意防范，采取应对措施，将风险降到最低限度。动物疫病的预防、控制难度大，风险大。特别是恶性疫病的发生，会给项目带来无法挽回的损失。对此，项目一开始就要把安全体系研发放在重要的位置，严格卫生防疫制度，养、防、检、治有机结合，建立定期检疫制度，加强马厩卫生消毒工作，发现疫病及时处理，把疫病降到最低限度。 8.3市场风险 随着产品的国际化销售，国内胚胎移植和繁育正在向国际化发展， 35 与国际化产品的碰撞不可避免。宁夏花儿生物科技工程有限公司牛、羊、马繁育基地能否发挥优势，将受到严峻的挑战，对此要有足够的心理准备，不断捕捉市场信息，分析市场动态，以高质量、品牌取胜为营销策略，在牢牢占领区内市场的基础上，向区外和国际市场发展，有力的控制风险。 第九章结论与建议 9.1建议 本项目符合国家及自治区产业发展政策。项目研发紧密结合国家和自治区发展现代化畜牧业的总体目标和农业集约化生产方针，充分利用宁夏独有和优势资源，引进先进设备，扩大冻精生产规模，有利于自治区调整畜牧业产业结构，从而促进现代畜牧业健康稳定发展。 项目以技术领先为目标，以市场为导向，以经济效益和社会效益为中心。突出重点，综合配套，规模适度，技术方案合理，经济效益、社会效益、生态效益良好。 坚持高起点、高档次、高标准、高效益的原则，科技含量高，产品附加值大，产品市场需求量大，项目发展前景广阔，可以作为宁夏农牧业发展示范项目，对促进宁夏农村经济的可持续发展具有重要作用。 9.2结论 项目研发符合现代畜牧业相关政策，农业部《关于加快西部地区特色农业发展的意见》指出，发展特色农业是实施西部大开发战略的重点任务，发展特色农业是西部地区农业结构战略性调整的主攻方向，发展西部地区特色农业，要因地制宜，立足当地农业资源优势，选择 36