浅谈木犀草素对对乙酰氨基酚诱导的L02肝细胞损伤的保护作用

浅谈木犀草素对对乙酰氨基酚诱导的L02肝细胞损伤的保护作用　　木犀草素，多以糖苷的形式存在于多种植物中，这些植物以全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、紫苏含量较高。具有镇咳和祛痰作用。据最新研究，呼吸道症状咳嗽、咳痰、喘息，均与气道慢性炎症有关。如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、慢性咽炎、变应性鼻炎等引起咳嗽、咳痰、喘息，均被认为与局部的炎症浸润有关，炎症的存在，使得气道的免疫应答混乱，患者常出现气道反应性增高。　　[摘要]探讨木犀草素(luteolin，Lut)对对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)诱导的L02肝细胞损伤的保护作用。CCK8法检测Lut对L02细胞活性的影响;筛选APAP诱导L02细胞损伤的浓度及作用时间;细胞形态学、CCK8实验和流式细胞术检测分析Lut对APAP诱导的L02细胞凋亡的影响;比色法检测细胞上清液中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)活性;RTPCR检测凋亡相关基因Bax，Bcl2，caspase3的达。结果显示Lut在2.5～40μmol・L-1不影响L02细胞活性;12mmol・L-1APAP作用于L02细胞12h可用于建立肝细胞损伤模型。与模型组相比，Lut组细胞状态明显改善，胞体增大，贴壁能力恢复明显;细胞凋亡率明显下降;MDA含量显著下降(P<0.05或P<0.01)，GSH和SOD活性显著提高(P<0.05或P<0.01)，同时能够上调Bcl2及下调Bax，caspase3mRNA的表达(P<0.05或P<0.01)。该实验了Lut对APAP诱导的L02细胞损伤有保护作用，其机制可能与其减轻氧化应激反应和抑制细胞凋亡有关。　　[关键词]木犀草素;L02细胞;氧化应激;细胞凋亡;对乙酰氨基酚　　对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是一种常见的解热镇痛药，APAP在治疗剂量下安全，但过量使用会造成急性肝损伤[1]。APAP过量服用在许多国家已成为故意或意外死亡的原因之一[23]。目前，有证据证实细胞内氧化应激是APAP引起急性肝损伤的重要生物学机制之一[47]，因此，探讨能够有效预防或缓解APAP引起的急性肝损伤途径具有积极的临床意义。　　木犀草素(luteolin，Lut)属于黄酮类化合物，主要存在于菊花、忍冬花、金银花、紫苏叶等植物中，近年研究表明木犀草素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种作用[811]。本文通过预防性给药，研究给药后氧化应激损伤相关生理指标变化，探讨Lut的细胞保护和抗凋亡作用，为对乙酰氨基酚肝损伤的防治提供进一步的实验依据。　　一、材料　　1.1细胞正常人肝细胞株(L02)为本实验室保存。用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基在37℃，5%CO2且饱和湿度条件下进行常规培养。　　1.2药品与试剂DMEM(高糖)培养基购自Hyclone公司;胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素均购自GIBCO公司;CellCountingKit8(CCK8)购自东仁化学科技(上海)有限公司;木犀草素(luteolin，Lut)、五味子乙素(schizandrinB，SchB)均购自成都普菲德生物技术有限公司;APAP购自中国食品药品检定研究院;AnnexinVFITC/PI试剂盒购自Sigma公司;谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒均购自南京建成生物研究所;逆转录和PCR反应试剂盒购自ThermoFisherScienfitic公司;Bax，Bcl2，caspase3引物均购自Invitrogen公司。　　1.3仪器酶标仪(BioTekSynergyH1H1MFD，美国);DMILHC型倒置相差显微镜(Leica，德国);流式细胞仪(BDFACSCantoⅡ)。　　二、方法　　2.1细胞培养L02细胞培养按照常规培养的方法，含10%胎牛血清、100kU・L-1青霉素和100g・L-1链霉素的DMEM(高糖)培养基，37℃，5%CO2培养箱培养。　　2.2CCK8检测Lut对L02细胞活性的影响将L02细胞以7×104个/mL接种于96孔板，每孔100μL，接种12h细胞全部贴壁后，分别给予0，2.5，5，10，20，40，80，160μmol・L-1的Lut，实验设阴性对照孔和空白对照孔，每个浓度设3个复孔。在37℃，5%CO2的培养箱中培养8h后CCK8检测L02细胞的存活率。实验重复3遍。细胞存活率=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%，式中Ac为对照孔吸光度，As为实验孔吸光度，Ab为空白孔吸光度。　　2.3APAP诱导L02细胞肝损伤模型的建立将浓度为7×104个/mL的L02细胞接种到96孔板，每孔100μL，接种12h细胞全部贴壁后，设0，6，12，18，24，30mmol・L-1浓度梯度的APAP进行造模，实验设阴性对照孔和空白对照孔，每个浓度设3个复孔，分别在造模3，6，12，24，48h后弃上清液，用CCK8检测L02细胞的存活率。实验重复3遍。　　2.4Lut对APAP诱导L02细胞损伤的影响实验分6组，分别是对照组、模型组(APAP，12mmol・L-1)、3个实验组(Lut，浓度分别为2.5，5，10μmol・L-1)和阳性对照组(五味子乙素[12]，SchB，5μmol・L-1)。取对数生长期L02细胞，调整细胞数为7×104个/mL，接种于96孔板中，37℃，5%CO2培养箱中培养12h，实验组和阳性对照组更换为相应的含药培养液，对照组和模型组更换新的完全培养液，继续培养8h后，除对照组外，其余各组加入APAP12mmol・L-1造模，造模12h，于倒置显微镜下观察细胞形态后弃上清液，用CCK8检测L02细胞的存活率。实验重复3遍。　　2.5AnnexinVFITC/PI双标记法检测细胞凋亡将L02细胞按照1×105个/mL接种到6孔板中，每孔2mL，分组、给药及造模同2.4项，造模12h后，将L02细胞消化下来，按照AnnexinVFITC/PI说明书方法对细胞进行染色，利用流式细胞仪检测L02细胞凋亡情况。　　2.6培养液MDA，GSH及SOD水平的检测将L02细胞按照1×105个/mL接种到6孔板中，分组、给药及造模同2.4项，造模12h后收集细胞培养上清，严格按照试剂盒说明书进行操作，检测细胞培养上清中MDA含量、GSH及SOD活性。　　2.7RTPCR检测Bcl2，Bax和caspase3mRNA表达分组、加药及造模同2.2项。每组设3个复孔。造模12h后收集细胞，应用Trizol试剂提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以βactin为内参进行扩增，检测细胞中Bcl2，Bax和caspase3mRNA的表达量。Bcl2，Bax和caspase3引物序列见表1。实验操作按试剂盒说明书进行。　　2.8统计分析所有数据均采用SPSS17.0应用软件进行统计学分析。计量资料数据用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。　　三、结果　　3.1CCK8检测Lut对L02细胞活性的影响为了寻找合适的Lut反应浓度，本实验考察了Lut(2.5，5，10，20，40，80，160μmol・L-1)对L02细胞活性的影响。研究发现Lut浓度在2.5，5，10μmol・L-1时活性最强，故本实验采用2.5，5，10μmol・L-1的浓度梯度进行后续试验，见图1。　　3.2APAP诱导L02细胞损伤模型的建立本研究首先考察APAP浓度和刺激时间对L02细胞损伤的影响，结果显示随着APAP浓度的增加，L02细胞的存活率逐渐降低;随着造模时间的延长，相同APAP浓度下的L02细胞的存活率逐渐降低。综合考虑造模时间和造模浓度，以IC50为原则，实验中12mmol・L-1APAP造模12h的抑制率为(49.64±3.30)%，因此，本研究选择造模时间为12h和造模浓度为12mmol・L-1的APAP进行后续试验，见图2。　　3.3Lut对APAP诱导L02细胞损伤的影响形态学观察发现，对照组细胞生长良好、背景清晰，细胞贴壁牢固，单个细胞呈扁平的梭形，透明度大、遮光性均匀;模型组(APAP，12mmol・L-1)细胞出现明显的凋亡，细胞数量减少，胞体缩小呈圆形。与模型组相比，Lut组和阳性药五味子乙素(SchB)中的细胞状态明显改善，贴壁能力恢复明显，胞体增大，多数细胞呈梭形。从L02细胞形态变化上可见，Lut在一定程度上可显著减轻APAP的损伤作用，提高细胞存活率，表明Lut对APAP损伤的L02细胞具有一定的保护作用，见图3。　　CCK8检测结果显示，模型组中细胞存活率显著降低(P<0.01)，约为对照组的50%，Lut组(2.5，5，10μmol・L-1)和SchB组细胞活力较模型组均有升高的趋势(P<0.05或P<0.01)，尤以10μmol・L-1Lut组效果最为明显，表明Lut对于APAP诱导的细胞损伤具有保护作用，这与细胞形态学结果一致，见图3。　　3.4Lut对L02细胞凋亡的影响凋亡流式检测结果显示，与对照组相比，模型组(APAP，12mmol・L-1)细胞凋亡率显著升高(P<0.05);与模型组相比，Lut组(2.5，5，10μmol・L-1)凋亡率显著降低(P<0.05或P<0.01)，其中10μmol・L-1Lut组效果最为明显，见图4。结果表明，Lut可显著抑制APAP诱导的L02细胞凋亡。细胞凋亡率=早期细胞凋亡率+晚期细胞凋亡率。　　3.5木犀草素对APAP诱导的L02细胞中MDA，GSH及SOD的影响实验结果显示，与对照组相比，APAP组MDA含量明显升高，而GSH和SOD活性明显降低(P<0.05或P<0.01);与模型组相比，不同浓度的Lut及SchB可明显降低MDA含量(P<0.05或P<0.01)，同时明显提高GSH和SOD活性(P<0.05或P<0.01)，其中10μmol・L-1Lut组效果最为明显，见表2。　　3.6Lut对凋亡相关基因Bcl2，Bax和caspase3表达的影响实验结果显示，与对照组相比，APAP组Bax和caspase3mRNA表达明显升高(P<0.01)，同时Bcl2mRNA表达明显降低(P<0.01);与模型组相比，Lut组Bax和caspase3mRNA表达明显降低(P<0.05或P<0.01)，同时Bcl2mRNA表达明显升高(P<0.05或P<0.01)，尤以10μmol・L-1Lut组效果最为明显，提示Lut具有明显的抑制L02细胞凋亡的作用，见表3。　　四、讨论　　近年研究表明Lut具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种作用。本研究通过建立APAP诱导的肝损伤模型，探讨Lut对APAP诱导的L02细胞损伤的保护作用。APAP诱导建立的肝损伤模型是目前较为常用的肝损伤模型，此模型造模时间短、易复制、稳定性好，是筛选保肝药物的理想模型[1315]。本实验发现，APAP(12mmol・L-1)能明显抑制L02细胞活性，Lut干预后，与模型组比较，L02细胞活性明显改善，其中10μmol・L-1Lut的药效最为明显。　　氧化应激在APAP诱导的肝损伤中起着重要作用[16]。MDA是脂质过氧化反应的产物，其高低常常可以反映脂质过氧化的程度，间接反映出细胞受自由基攻击的严重程度。SOD是平衡机体氧化与抗氧化的关键酶，能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。SOD活性也是判断细胞损伤程度的相关指标。GSH可直接通过供H+拮抗氧自由基毒性，清除体内的超氧离子及其他自由基，防止肝细胞损伤。GSH是机体内最重要的非酶性抗氧化物，其水平的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。因而本实验测定三者水平来反映细胞氧化应激水平。本研究显示，与模型组相比，Lut组氧化指标MDA含量明显降低，抗氧化指标GSH和SOD活性则显著提高(P<0.05或P<0.01)，研究初步表明木犀草素可通过减轻氧化应激反应而达到抑制APAP诱导的肝损伤。　　氧化应激损伤可以引起细胞凋亡，本实验中细胞形态观察发现，与对照组相比，模型组细胞出现明显的凋亡，细胞数量减少，胞体缩小呈圆形;而Lut组细胞状态较模型组明显改善，贴壁能力恢复明显，胞体增大。CCK8检测结果显示，模型组中细胞存活率显著降低(P<0.01)，而Lut组(2.5，5，10μmol・L-1)的细胞活力较模型组均有升高的趋势(P<0.05或P<0.01)，尤以10μmol・L-1Lut组效果最为明显。凋亡流式结果表明，APAP可明显诱导L02细胞凋亡，Lut预给药后的各组细胞凋亡数量与模型组相比明显减少(P<0.05或P<0.01)，以上结果表明Lut能够抑制APAP诱导的细胞凋亡。　　细胞凋亡是一种由多种基因参与调控的程序性死亡的过程，现已知多种基因与细胞凋亡的信号转导相关，包括Bcl2家族基因(Bcl2，Bclxl，Bax，Bad等)，p53，Fas，FasL等都参与了凋亡的调控[17]。Bcl2家族基因能抑制或激活凋亡，其中Bax和Bad等基因可促进凋亡，而Bcl2和Bclxl等基因能抑制细胞凋亡[18]，Bax则通过抑制Bcl2的活性诱导细胞凋亡[19]。caspase3属于半胱氨酸蛋白酶家族一员，在细胞凋亡中发挥重要作用。caspase3表达的增加、激活是外源性的死亡受体途径和内源性的线粒体途径凋亡信号通路共同的关键环节，因此是凋亡发生的标志酶[20]。RTPCR结果显示，木犀草素是通过下调Bax和caspase3mRNA及促进Bcl2mRNA的表达而抑制APAP诱导的细胞凋亡。　　综上所述，木犀草素通过抑制氧化应激和细胞凋亡实现其对APAP诱导的L02细胞损伤的保护作用。其机制可能与抑制脂质过氧化，增强GSH和SOD活性，同时下调Bax和caspase3mRNA及上调Bcl2mRNA的表达有关，但详细机制还有待进一步探讨。　　[]　　[1]JaeschkeH，WilliamsCD，RamachandranA，etal.Acetaminophenhepatotoxicityandrepair：theroleofsterileinflammationandinnateimmunity[J].LiverInt，2012，32：8.　　[2]ChunLJ，TongMJ，BusuttilRW，etal.Acetaminophenhepatotoxicityandacuteliverfailure[J].JClinGastroenterol，2009，43：342.　　[3]HinsonJA，RobertsDW，JamesLP.Mechanismsofacetaminopheninducedlivernecrosis[J].HandbExpPharmacol，2010，196：369.　　[4]BauerI，VollmarB，JaeschkeH，etal.Transcriptionalactivationofhemeoxygenase1anditsfunctionalsignificanceinacetaminopheninducedhepatitisandhepatocellularinjuryintherat[J].JHepato，2000，33(3)：395.　　[5]JaeschkeH.Reactiveoxygenandmechanismsofinflammatoryliverinjury[J].JGastroenterolHepatol，2000，15(7)：718.　　[6]JaeschkeH，KnightTR，BajtML.Theroleofoxidantstressandreactivenitrogenspeciesinacetaminophenhepatotoxicity[J].ToxicolLett，2003，144(3)：279.　　[7]SongZ，McClainCJ，ChenT.SAdenosylmethionineprotectsagainstacetaminopheninducedhepatotoxicityinmice[J].Pharmacology，2004，71(4)：199.　　[8]SeelingerG，MerfortI，SchemppCM.Antioxidant，antiinflammatoryandantiallergicactivitiesofluteolin[J].PlantaMed，2008，74(14)：1667.　　[9]WuW，LiD，ZongY，etal.Luteolininhibitsinflammatoryresponsesviap38/MK2/TTPmediatedmRNAstability[J].Molecules，2013，18(7)：8083.　　[10]KapoorS.Luteolinanditsinhibitoryeffectontumorgrowthinsystemicmalignancies[J].ExpCellRes，2013，319(6)：777.　　[11]ChengWY，ChiaoMT，LiangYJ，etal.LuteolininhibitsmigrationofhumanglioblastomaU87MGandT98GcellsthroughdownregulationofCdc42expressionandPI3K/AKTactivity[J].MolBiolRep，2013，40(9)：5315.　　[12]李丽波，高涵，孙超，等.五味子乙素诱导的HSP27和HSP70对小鼠肝损伤的保护作用[J].齐齐哈尔医学院学报，2010，31(8)：1177.　　[13]TaiM，ZhangJ，SongS，etal.Protectiveeffectsofluteolinagainstacetaminopheninducedacuteliverfailureinmouse[J].IntImmunopharmacol，2015，27(1)：164.　　[14]BajtML，KnightTR，LemastersJJ，etal.Acetaminopheninducedoxidantstressandcellinjuryinculturedmousehepatocytes：protectionbyNacetylcysteine[J].ToxicolSci，2004，80(2)：343.　　[15]SalasVM，CorcoranGB.CalciumdependentDNAdamageandadenosine3′，5′cyclicmonophosphateindependentglycogenphosphorylaseactivationinaninvitromodelofacetaminopheninducedliverinjury[J].Hepatology，1997，25(6)：1432.　　[16]张华年.对乙酰氨基酚肝毒性研究进展[J].中国医院药学杂志，2006，26(10)：1284.　　[17]YipKW，ReedJC.Bcl2familyproteinsandcancer[J].Oncogene，2008，27：6398.　　[18]周永列，胡惟孝，吕亚萍，等.四嗪二甲酰胺对肺癌细胞株A549的体内外作用[J].药学学报，2007，42(1)：26.　　[19]王海燕，蔡兵，崔承彬，等.蔓荆子活性成分vitexicarpin诱导K562细胞凋亡的机制[J].药学学报，2005，40(1)：27.　　[20]KrollA，PillukatMH，HahnD，etal.Currentinvitromethodsinnanoparticleriskassessment：limitationsandchallenges[J].EurJPharmBiopharm，2009，72(2)：370.