碱性磷酸酶Km值的测定

碱性磷酸酶Km值的测定【实验目的】1.了解酶的Km值测定原理和方法2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性测定的原理和方法【实验原理】在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加，但当底物浓度增大到一定极限时，则反应速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示，即：Vmax•[S]V=Km+[S]其中Km为米氏常数，Vmax为最大反应速度，当V=Vmax/2时，则Km=[s]。Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶的一种方法将米氏方程变形为双倒数方程，以l/v－1／[s]作图，将各点连线，在横轴截距为-／km，据此可算出Km值。1/V=Km/Vmax•[S]+1/Vmax本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。其反应式如下：磷酸苯二钠+H2OAKPOH-苯酚苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6醌衍生物（红色）管号12345678底物液(0.04M)碳酸缓液(pH=10)蒸馏水0.050.150.250.300.400.600.800.000.900.900.900.900.900.900.900.900.950.850.750.700.600.400.201.00混匀后37℃水浴，预温5分钟左右【实验操作】酶液0.10.10.10.10.10.10.10.1加入酶液后立即混匀（保持37℃水浴），反应开始。从加入酶液起计时至下一步加入碱性溶液停止反应，各管反应时间应准确一致，为15分钟。碱性溶液1.01.01.01.01.01.01.01.04-氨基安替比林铁氰化钾1.01.01.01.01.01.01.01.02.02.02.02.02.02.02.02.0混匀，室温放置10分钟左右,以8号管为空白，于5l0nm比色，记录各管的光密度结果记录12345678OD底物浓度mmol/L13568121601/[S]1/OD10.3330.2000.1670.1250.0830.063-【实验结果】1、原始数据2、作图以[s]为横轴，OD510为纵横作图，观察曲线形状；查Km值以1／［s]为横轴，1／OD510为纵轴作图，观察曲线形状；查Km值比较两个值的差异.[S]底物浓度与反应速度关系曲线双倒数曲线比较两个值的大小,分析实验误差产生的原因比较两种Km测定方法各自的优缺点【实验讨论】