PCR相关分子技术在皮肤黏膜微生态研究中的应用

中国真菌学杂志2008年l2月第3卷第6期ChinJMycol，December2008，Vol3，No．6·继续教育·PCR相关分子技术在皮肤黏膜微生态研究中的应用吕雪莲张晓利刘维达(中国医学科学院皮肤病研究所，南京210042)【关键词】皮肤黏膜；微生态；PCR相关技术【中图分类号】R446．5【文献标识码】B【文章编号】1673—3827(2008)06-0359-05皮肤黏膜微生态是指寄居在人体体和与外界相通腔道的微生物群落与人体相互依存相互影响，形成在皮肤黏膜结构功能中发挥重要作用的微生态环境J。微生态可对人体的疾病、健康产生不可忽视的影响，因此围绕该领域的研究不容忽视。以往的微生态研究通常基于传统的培养方法，存在诸多无法克服的缺陷和不足。随着PCR技术在生命科学研究中的广泛应用，PCR相关的各种分子技术以其各自的特点在不同的研究领域发挥着重要作用。而PCR扩增基础上的克隆文库构建、变性／温度梯度凝胶电泳(Denaturing／Temperaturegradi．entgelelectrophoresis，TGGE／DGGE)、末端限制性片段长度多态性分析(Terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism，T—RFLP)和实时定量PCR等分子技术帮助我们对皮肤黏膜的微生态产生全新的理解。对于上述PCR相关技术的深入了解，有助于我们选择更适合的方法，更有效地开展相关研究1核糖体RNA(RibosomalRNA，rRNA)基因在生物进化的漫长过程中，rRNA基因保持相对恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序，同时也存在着与进化过程相一致的突变率。其中位于基金项目：江苏省自然科学基金(BK2008091)作者简介：吕雪莲，女(汉族)，博士研究生在读，副主任医师E-mail：snowlotus．1v@gmail．con通讯作者：刘维达，E—mail：liumyco@hotmail．tom原核生物核糖体小亚基上的16SrRNA基因长约1540bp，结构和碱基排列复杂度适中，适用于序列分析和菌种鉴定，目前几乎所有的微生态研究中的分子技术均围绕该片段展开。大多数研究首先提取样本中的总DNA，再选择根据该片段序列设计的细菌通用引物进行PCR扩增，利用获得的PCR产物可以进行各种后续研究。研究者可根据研究目的、对象及方法的不同，选择适当的通用引物及理想的循环次数J。与细菌的常用片段不同，近年逐渐开展起来的皮肤黏膜表面真菌群落的研究中，通常选择18SrRNA基因和内转录间隔区(ITS)进行真菌通用引物的PCR扩增。2克隆文库构建该技术是将16SrRNA基因的扩增产物与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落即为一个DNA片段的克隆。通过分析文库中标记序列的类型和出现频率得到种群组成信息，与Genbank中的已知序列进行比对，从而确定样品中微生物群落的组成。此技术已在口腔、肠道、阴道、皮肤等部位的细菌及真菌微生物群落多样性及结构变化等研究中得到广泛应用。在对口腔微生物群落的研究中，克隆文库构建分离获得2589个克隆子中，共检测出141个优势菌种，超过60％的菌种是无法培养的_4J。口腔不同部位共可分离出34～72个优势群落，每个部位都有至少20—30种优势菌种。Wang等通过·360·中国真菌学杂志20o8年12月第3卷第6期ChinJMvcol，December2008，Vol3，No．6对人的粪便、结肠和回肠样品的16SrRNA基因建立基因克隆文库研究肠道的微生物群落的多样性，结果发现很大一部分细菌在以前的传统研究中都被忽略。一项针对rRNA基因的18S及ITS区的克隆文库构建技术对肠道内真菌群落的多样性进行了分析。与普通培养技术分离的念珠菌属为优势菌种的结果不同，克隆文库的结果表明，最常分离出的是Gloeotinia属、拟青霉属和Galactomyces属真菌，但这些寄居于肠道中的真菌的功能尚不明确。有关健康女性阴道微生物群落分布特征的研究结果显示每个个体的克隆文库可平均分离获得大约200个种系型，阴道微生物群落的分布存在较大个体差异性_6J。而采用克隆文库构建技术对人前臂屈侧皮肤表面微生物群落的多样性分析中共获得1221个克隆子，分属于8个门的182个种系型，可基本反映该部位微生物群落大约74％的种类。放线菌、厚壁菌门和变形菌门是最主要的优势群落，占所有获得的克隆子的94．6％。85．3％的序列是目前已知且能分离培养的菌种，大约有30个种系型可能属于未知的新种。在采用该方法对人体正常微生物群落进行研究的基础上，亦有很多学者采用该方法研究皮肤黏膜疾病状态下的微生物群落变化。Sakamoto等应用此方法比较了无症状和有症状牙髓感染的细菌群落特点，结果在186个克隆中鉴定出42个类群，有23种(55％)是无法培养的类群。其中最常见的包括消化链球菌属、普氏菌属、小杆菌属、Mogibacterium属、口腔毛螺菌科、龈沟产线菌、巨球型菌属、韦荣球菌属、拟杆菌属等。小杆菌属BS016／MCE7—134等克隆群落则仅见于无症状感染者。在复发性阿弗他口炎的细菌多样性研究中，研究者采用克隆文库构建技术，共分离到分属于95种细菌的535个克隆子。其中复发性阿弗他口炎中共检测到57个种系型，11个为已知菌种，Prevotella属是仅见于复发性阿弗他口炎的优势菌群。该研究证实在阿弗他口炎的口腔细菌群落多样性及优势菌种与健康人群有显著差异。还有学者采用此技术研究无法培养的细菌与痤疮及毛囊炎的相关性⋯。共分离获得5700个克隆子，结果发现在健康人毛囊内仅有单一的痤疮丙酸杆菌的定植，而痤疮患者毛囊内除了痤疮丙酸杆菌还包括表皮葡萄球菌和少量的其他几种细菌。皮肤表面的样本则复杂得多，可分离出l2～16种细菌群落。对16SrRNA基因序列的克隆文库构建及测序可以比较完整地了解微生物群落的基本组成特征，尤其是可以提供更多无法培养的微生物群落的信息。但该方法工作量大、成本高、不能定量，而且是建立在PCR基础上的，常因错配或非特异性扩增导致克隆文库出现错误信息。尽可能减少PCR的循环次数，有助于16SrRNA基因克隆文库更真实地反映样品情况¨。3TGGE／DGGEDGGE是常用的一种分子指纹技术，1993年首次被用于分析海水生态系统中的细菌组成¨。随后与该技术原理相似的TGGE亦被广泛用于其他微生物生态系统研究。DGGE／TGGE的原理是：通过对微生物自然群落的16SrRNA基因的PCR扩增，产生长度相同但序列有异的DNA片段混合物，而在碱基序列上存在差异的不同DNA双链，解链时需要不同的变性剂浓度或不同的温度，将扩增得到的等长DNA片段加入到含有变性剂梯度或温度梯度的凝胶中进行电泳，序列不同的DNA片段会在各自相应的浓度或温度下变性，发生空间构型的变化，停留在相应的浓度或温度梯度位置，染色后可在凝胶上呈现分开的条带。DGGE／TGGE带谱中每一条带可能代表一个不同的微生物种系型，电泳带谱中条带的数量即反映了环境微生物群落中优势类群的数量。通过比较指纹图谱我们可以很容易了解不同个体或者不同环境中群落的组成差异。目前，PCR—DGGE／TGGE已成功用于人体皮肤黏膜的微生物群落多样性研究。Mar．tinez-Medina等应用PCR—DGGE对Crohn’病肠黏膜微生物群落分布进行研究，结果共分离出的141个序列分属于58个种系型，其中8个是首次发现，序列比对分析结果显示74．5％的序列无法应用目前已有的培养技术分离。在另一项阴道微生物群落分布的研究中，作者则采用PCR．DGGE技术对健康女性、细菌性阴道病(bacterialvaginosis，BV)和外阴阴道念珠菌病(VulvovaginalCandidi—sis，VVC)患者阴道中群落多样性进行了比较。结果显示，健康女性阴道中最常见的是惰性乳杆菌和嗜酸乳杆菌，其次是詹氏乳杆菌和阴道乳杆菌，也可见到阴道加德纳菌。阴道加德纳菌仍是BV中最常见到的细菌。VVC人群阴道内乳杆菌的分布与正常人相似，最常见的是惰性乳杆菌，分离率中国真菌学杂志2008年l2月第3卷第6期ChinJMycol，December2008，Dl3’No．6较正常人群更高；亦可见到詹氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和阴道乳杆菌；还可见到阴道加德纳菌、脲原体、梭菌属、鲍氏志贺氏菌等。BV合并VVC人群中，惰性乳杆菌仍是优势阴道菌群，与BV有关的细菌菌种仅在部分样本中可以检出。DGGE／TGGE技术具有分辨率高、重复性好等特点，其操作过程与常见的单链构象多态性相似，实验条件更易于控制，操作也更方便。但该技术存在一定的局限性，DGGE／TGGE检测的DNA片段最适长度为200～900bp，超出此范围的片段难以检测；PCR扩增所需G—C碱基对含量至少达40％；最低能检测到占菌群总细菌数1％的细菌，提示只有微生态系统中的相对优势菌才能被研究到；DGGE／TGGE检测的基础上往往需要结合杂交技术或核酸直接测序分析来获取更详尽的菌种信息。4T．RFLP1997年，Liu等首次应用T—RFLP技术对环境微生物群落进行多样性分析。与限制性片段长度多态性(RFLP)分析技术相似，TRFLP是一种利用限制性酶切片段长度差异来检测生物个体之间差异的分子标记技术。首先对通用引物的末端进行荧光标记，再通过PCR扩增16SrRNA基因后将末端带有荧光的扩增产物经四碱基的限制性核酸内切酶消化，存在核酸序列差异的不同种群微生物的PCR产物其酶切片段的数量和大小各不相同。消化后的样品加入DNA基因分析仪中，其中仅有那些带有荧光标记末端的酶切片段(Terminalrestrictionfragments，T．RFs)才可通过基因分析仪被检测识别。理论上每一个检测到的峰值即代表一种微生物，峰值的数目可反映该样本中群落的多样性，而计算每一个峰值下的面积即可分析群落中不同微生物的相对构成比。T．RFLP具有比依赖于普通电泳系统的RFLP及PCR．DGGE／TGGE等方法更可靠的精确性¨，且比16SrRNA基因克隆文库构建简便易行，同时可进行高通量分析，具有较高的可重复性，并可实现对群落构成的半定量分析。因此，近年用于医学微生态相关领域的研究已越来越多。目前该技术主要用于黏膜及其相关疾病微生物群落的多样性分析，比较适合进行微生物群落结构的动态变化研究。在采用T—RFLP技术对口腔内微生物的构成的研究中发现不同人群唾液中优势T—RFs的丰度存在明显差异。在不同年龄段婴儿粪便内微生物群落分布特征的研究中显示婴儿在母乳喂养期间粪便内的微生物群落保持基本稳定，而在断奶后则发生显著改变。微生物群落的分布特征具有明显的个体差异性。肠杆菌和拟杆菌是婴儿母乳喂养期间的优势群落，在断奶后肠杆菌的数量显著减少而梭菌属的数量明显增加。Dicksved等应用T-RFLP技术研究了10对患Crohn’S病的同卵孪生子的肠道微生态结构，并以8对健康孪生子做对照。结果健康人微生物群落的多样性明显高于患病个体，且健康个体中孪生子肠道菌群的相似性明显高于患病孪生子。回肠Crohn’S病的微生物群落结构与健康人及结肠Crohn’S病个体明显不同。Crohn’S病个体中单形拟杆菌数量明显减少而卵形拟杆菌和普通拟杆菌明显增多。该研究证实遗传和(或)环境因素一定程度上影响了肠道微生物群落的构成。另有研究采用T-RFLP技术针对成人异位性皮炎(Atopicdermatitis，AD)的肠道微生物群落及代谢物的变化进行了探讨。结果发现病情顽固迁延的成人AD可能与肠道内T-RFs为368bp或389bp的肠杆菌科为优势的B组群落有关，且该群落的粪精脒浓度明显低于A组。该研究提示由肠内微生物群落产生的低浓度肠道内多胺可能是影响顽固性成人AD的重要因素。在对5O例BV和20例健康人阴道微生物群落变化分析研究中发现，BV阴道中可分离出l7属的23种细菌，主要包括阴道阿托波菌、巨球菌属、惰性乳杆菌、阴道加德纳菌以及3种梭菌属细菌。每个样本可检出2～14(平均6．3)种菌种，惰性乳杆菌分离率较正常增加，几乎见不到卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌。而在正常人群中，仅可检出卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌和詹氏乳杆菌。T—RFLP的影响因素包括通用引物及荧光染料的选择、核酸内切酶的选择及假性片段的有效去除等。有研究显示，当群落的多样性超过100种时，单个酶切可能只能识别不到50％的群落。因此如果拟对较复杂群落进行多样性分析时，宜选择2～4个内切酶进行多重酶切。当需要对样本的优势群落变化进行分析时，则可考虑选择单一的核酸内切酶以减少非优势群落的干扰。内切酶的筛选可借助REPK(RestrictionEndonucleasePicker)软件进行(http：／／rocaplab．ocean．washing．ton．edu／tools／repk)，通过输入拟分析的任意序列，中国真菌学杂志2008年l2月第3卷第6期ChinJMycol，December2008，Vol3，No．6利用一系列筛选条件确定理想的内切酶。对T—RFLP数据进行多样性比较和其他的下游分析时，可借助网络提供的MiCA(MicrobialCommunityA—nalysis)微生物群落分析系统完成。该系统可提供模拟T—RFLP和APLAUS两个专业化程序及一个专门的16SrRNA基因序列的标准数据库。APLAUS是根据用户提供的T．RFLP的数据推测最可能的群落构成。该程序可估测群落的相对构成比，显示与数据一致的种系型列表。MiCA可通过http：／／mica．ibest．uidaho．edu／进入。T．RFLP具有高通量、可重复性、准确性及快速性等优势，但对原始的群落特征分析仍存在一定程度的偏差，而且片段回收困难，与克隆文库相比，精确性略差。由于该方法的高通量性使试验易于重复，因此结合克隆文库构建等其他常用分子技术具有更明显的优势。5实时定量PCR实时定量PCR能监测整个PCR过程中的产物含量，真实反映产物含量与浓度的直接关系，因而具有很高的准确度。尤其该技术在很低模板浓度下就能进行准确定量，这一特点是其他方法无法比拟的，可对微生物群落的变化进行准确地定量分析。在一项采用多重实时定量PCR进行银屑病皮肤马拉色菌群落分布的研究中，研究者设计了针对4种马拉色菌和2种未知种群的双重标记引物和1个属特异性引物，发现实时定量PCR的结果与他们以前的克隆文库分析结果有较高的一致性。限制性马拉色菌是最主要的种群，球形马拉色菌亦有较高的比例，未知种系型1虽然检出的数量较少，但存在于绝大多数的样本中。群落特征具有宿主特异性及时间上的相对稳定性，健康皮肤和银屑病皮损表面的群落分布没有显著性差异。Kalliomaki等应用实时定量RT—PCR进行肥胖儿粪便微生态分析。结果样本中双岐杆菌属的数量明显少于正常儿，且金葡菌的数量明显增多。另有学者对8个过敏症婴儿出生后前2个月粪便中6种细菌数量变化进行了实时定量PCR分析。结果表明过敏症患儿生后1个月和2个月时的拟杆菌属数量显著增高，而肠杆菌、双岐杆菌、肠球菌、乳杆菌和产气荚膜梭状杆菌的数量没有显著性差已[31]升0由于实时定量PCR技术是在设计种属特异性探针的基础上进行，可对16SrRNA基因序列已知的微生物进行检测。但对于序列未知的微生物则无能为力，只能用来检测事先估计到其存在、已知其目标基因序列并为之设计好引物的类群。如果对可能存在的微生物缺乏了解，则严重影响微生物群落多样性的系统。因此，结合DGGE／TGGE、T．RFLP等其他群落多样性研究方法，有助于对群落分布及动态变化进行更为准确地评价。6小结综上所述，基于16SrRNA基因的PCR相关分子技术与传统培养技术相比，在微生物群落多样性及结构变化的研究中具有不可比拟的优势，给皮肤黏膜微生物群落的研究构建了美好未来。然而分子生物学技术并非完美，各种方法或多或少都存在一些缺陷和不足。因此，在研究中，应根据不同对象、不同目的，有效采用不同的研究技术手段并相互结合，以期从不同的角度帮助我们更好地理解微生物群落的分布变化及在疾病中的作用。参考文献[1]李兰娟．感染微生态．中华感染控制杂志，2005，4(1)：1-3．[2]HayashiH，SakamotoM，BennoY．Evaluationofthreedifferentforwardprimersbyterminalrestrictionfragmentlengthpolymor-phismanalysisfordeterminationoffecalbifidobacteriumspp．inhealthysubjects．MicrobiolImmunol，2004，48(1)：l-6．[3]ScanlanPD，MarchesiJR．Micro-eukaryoticdiversityofthehu—mandistalgutmicrobiota：qualitativeassessmentusingculture—dependentand—independentanalysisoffaeces．ISMEJ．2008Jul31．[Epubaheadofprint][4]AasJA，PasterBJ，StokesLN，eta1．Definingthenormalbacte—rialfloraoftheoralcavity．JClinMicrobiol，2005，43(11)：572l-5732．[5]WangX，HeazlewoodSP，KrauseDO，eta1．Molecularcharac—terizationofthemicrobialspeciesthatcolonizehumanilealandcolonicmneosabyusing165rDNAsequenceana1)sis．JApplMicrobiol，2003，95(3)：508-520．[6]ZhouX，BentSJ，SchneiderMG，eta1．Characterizationofva．ginalmicrobialcommunitiesinadulthealthywomenusingculti-vation·independentmethods．Microbiology，2004，150(Pt8)：2565-2573．[7]GaoZ，TsengCH，Peiz，eta1．Molecularanalysisofhumanforearmsuperficialskinbacterialbiota．ProcNatlAcadSciUSA，2007．104(8)：2927-2932．[8]SakamotoM，R6~asIN，SiqueiraJFJr，eta1．Molecularanaly—sisofbacteriainasymptomaticandsymptomaticendodonticin—fections．OralMicrobialImmunol，2006，21(2)：112-122．[9]MarchiniL，CamposMS，SilvaAM，eta1．Bacterialdiversityin2008年12月第3卷第6期ChinJM~C0l，December2008，Vol3，No．6aphthousulcers．OralMicrobialImmunol，2007，22(4)：225-231．[10]Bek—ThomsenM，LomholtHB，KilianM．Acneisnotassociat—edwithyetunculturedbacteria．JClinMicrobiol，2008Aug20．[Epubaheadofprint][11]BonnetR，SuauA，DoreJ，eta1．DifferencesinrDNAlibrariesoffaecalbacteriaderivedfrom10一and25-cyclePCRs．IntJSystEvolMicrobial，2002，52(Pt3)：757-763．[12]MuyzerG，dewaalEC，UitterlindenGA．Profilingofcomplexmicrobialpopulationsbydenaturinggradientgelelectrophoresisanalysisofpolymerasechainreaction—amplifiedgenescodingfor16SrRNA．ApplEnvironMicmbiol，1993，59(3)：695-700．[13]MuyzerG．DGGE／TGGEamethodforidentifyinggenesfromnaturalecosystems．CurrOpinMicrobiol，1999，2(3)：317—322．[14]Martinez-MedinaM，AldeguerX，Gonzalez—HuixF，eta1．Ab-normalmicrobiotacompositionintheileocolonicmucosaofCrohngdiseasepatientsasrevealedbypolymerasechainreac—tion-denaturinggradientgelelectrophoresis．InflammBowelDis，2006，12(12)：1136-1145．[15]VitaliB，PuglieseC，BiagiE，eta1．Dynamicsofvaginalbac-terialcommunitiesinwomendevelopingbacterialvaginosis，candidiasis，ornoinfection，analyzedbyPCR—denaturinggradi—entgelelectmphoresisandreal—timePCR．ApplEnvironMicro—biol，2007，73(18)：5731-5741．[16]LiuWT，MarshTL，ChengH，eta1．Characterizationofmicro-bialdiversitybydeterminingterminalrestrictionfragmentlengthpolymorphismsofgenesencoding16SrRNA．ApplEnvironMi—crobiol，1997，63(11)：45164522．[17]HartmannM，WidmerF．ReliabilityfordetectingcompositionandchangesofmicrobialcommunitiesbyT—RFLPgeneticprofi-ling．FEMSMicrobialEcol，2008，63(2)：249-260．[18]SakamotoM，TakeuchiY，UmedaM，eta1．Applicationofter-minalRFLPanalysistocharacterizeoralbacterialflorainsalivaofhealthysubjectsandpatientswithperiodontitis．JMedMicro—biol，2003，52(Pt1)：79-89．[19]TakeshitaT，NakanoY，KumagaiT，eta1．Theecologicalpro—portionofindigenousbacterialpopulationsinsalivaiscorrelatedwithoralhealthstatus．ISMEJ，2008，2(10)．[Epubaheadofprint][20]WangM，Ahrn~S，AntonssonM，eta1．T—RFLJ)combinedwithprincipalcomponentanalysisand16SrRNAgenesequencing：aneffectivestrategyforcomparisonoffecalmicrobiotaininfantsofdifferentages．JMicrobiolMethods，2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