高效液相色谱法测定人乙肝免疫球蛋白中麦芽糖的含量

中国医院药学杂志2006年第 26卷第 6期 Chin Hosp Pharm J，2006 Jun，Vol 26，No．06 ·685 · 646—649． [11]Martin Deak，Heinz Falk．On the chemistry of the resveratrol diastereomers[J]．Monatshefte for Chemical Monthly．2003． 134：883—888． [12]李核 ，李攻科．张展霞．影响微波辅助萃取虎仗中的白藜芦醇 产率的一些重要操作参数EJ3．化学，2003，31(11)：1341— 1344． [收稿日期]2005—12—22 高效液相色谱法测定人乙肝免疫球蛋白中麦芽糖的含量 吕应年 ，蒋桂香。，吴科锋 ，朱光祖。 (1．广东医学院天然药物研发重点实验室，广东湛江524023；2．三九集团双林药 业有限公司，广东 湛江 524005) [摘要] 目的：建立高效液相色谱法，测定静脉注射用人乙肝免疫球蛋白(HBIGIV)中麦芽糖的含量。：采用氨基柱 Kro— masil1()O一5NH2(4．6 ITIITIx 250 mm)及示差折光检测器，以0．004 mo卜L 硫酸溶液做流动相，柱温 50℃，流速0．8 mL· min～。结果：麦芽糖含量的线性范围5～40 g·L～．平均回收率( =6)为99．4 ，RSD为1．13 。结论：本方法准确、简便 ，适 用于测定人 乙肝免疫球蛋白静脉注射液 中麦芽糖含量的测定。 [关键词] 高效液相色谱 ；静脉注射用人 乙肝免疫球蛋白；麦芽糖 ；含量 [中图分类号]R927．2 [文献标识码]A [文章编号]1I)I)1—5213(2006)06—0685—02 Determination of malt ose in human hepatitis B immunoglobulin for intravenous llse by HPLC LV Ying-nian，JIANG Gui—xiang，WU Ke-Feng，ZHU Guang-zu(1．Guangdong Medical College，Guangdong Zhan jiang 524023，China；2．Shuanglin medicines limited company of Shanjiu group，Guangdong zhanjiang 524005，China) ABSI ACT：OllJ『EL'rIVE To investigate a method of HPLC for the determination of the content of malt ose in human hepati— tis B immunoglobulin for intravenous use．METItODS The analytical column was the Kromasil 100-5NH，columrl(4．6 mnl× 250 mm)and the detector was refractometer，the mobile phase was 0．004 mo卜L～ sulfate acid solution，column temperature was 50℃ ，the flow rate was 0．8 mI ·min～．REsIII I The calibration curves of ma lt ose were linear in the concentration range from 5—4()g·L_。，the average recovery and RSD were 99．4 ( =6)and 1．13 ，respectively．CONCLUSION The method iS accurate，simple and can be adopted for determ ining the malt ose in HBIGIv． KEY W0RDS：HPI ；HBIGIV；ma lt ose；content 人乙肝免疫球蛋白是用于防治乙肝病毒感染的 一 种特异性免疫制剂[】· ，由含有高效价乙肝抗体的 健康人血浆中提取精制而成[3]。目前我国批准上市 的人乙肝免疫球蛋白为肌肉注射剂[4]，静脉注射用人 乙肝免疫球蛋白在欧洲药典中已有收载[5]，但我国尚 处于研究试制阶段。本实验用高效液相色谱法测定 静脉注射用人乙肝免疫球蛋白中的麦芽糖含量。 1 仪器与试药 岛津高效液相色谱，LC一10AD泵，RID一10A 示差折光检测器，CTO一10ASVP柱温箱；台式离 心机(8O一2B型，上海安亭科仪厂)；麦芽糖品 (chem．service Inc．)；静脉注射用人乙肝免疫球蛋 白 (蛋 白 含 量 5 ，批 号 20040501、20040502、 20040503，三九集团双林药业公司试制)；其他化学 试剂为分析纯。 2 方法与结果 2．1 色谱条件 采用氨基柱(Kromasil 100-5NH2， 4．6 mmX250 mm)，流动相为0．004 mol·L 的硫酸 溶液，柱温 5()℃，流速0．8 mL·min～，进样量 20 L。 2．2 溶液配制 2．2．1 标准品储备液 麦芽糖标准品经85℃干燥 恒重，精密称取5．002 8 g，放人 100 mL量瓶，加水 溶解并稀释到刻度。 2．2．2 供试品溶液 准确吸取 10 mL人乙肝免疫球 蛋白静脉注射液，置于50 mL量瓶，加入1．5 磺基水 杨酸至刻度，沉淀后离心(3 000 r·min～，10 min)，上 清液用0．45 tan的微孔滤膜过滤，取续滤液。 2．2．3 阴性对照溶液 按工艺制备免疫球蛋 白液，不加麦芽糖，取此空白蛋白液 10 mL，置于 50 mL量瓶，加入1．5 9／6磺基水杨酸至刻度，沉淀后离 [作者简介]吕应年，男．硕士，讲师，电话：0759—2388405，E-mail：lyn7591@hotmail．corn 维普资讯 http://www.cqvip.com · 686 · 中国医院药学杂志 2006年第 26卷第 6期 Chin Hosp Pharm J，2(H)6 Jun，Vol 26，No．06 心(3 000 r·rain～，10 rain)，上清液用0．45 m的微 孔滤膜过滤，取续滤液。 2．3 系统适应性及专属性试验 分别取对照品溶 液、供试品溶液及阴性对照品溶液各 2() L进样色 谱仪，色谱图如图 1。在上述色谱条件下麦芽 糖出峰时间 4 rain，供试品在麦芽糖峰相应位置有 一 显著峰，无其他杂峰，阴性对照品在麦芽糖峰相应 位置无吸收。试验结果表明人乙肝免疫球蛋白溶液 经沉淀离 fl,除蛋白后不含有麦芽糖检测的干扰物 质，色谱系统的适应性及专属性良好。 4 5 6 4 5 6 4 5 timin t／rain t／rain 图 1 高效液相色谱图 A麦芽糖标准品；＆供试品；C．阴性对照品 Fig 1 HPLC chromatograms A refe-rence substance；13．sample；C．negative control 2．4 线性关系考察 精密吸取标准品储备液1．()， 2．0，4．0，6．(J，8．()mL，分别放人 10 mL量瓶，加水 到刻度，摇匀即得系列浓度的对照品溶液。分别取 配制好的各浓度对照品溶液 2() L，进样高效液相 色谱。以峰面积 A为纵坐标，麦芽糖浓度 C为横坐 标回归 计算，得 回归方 程：Y = 一6 484．2 X + 10 033．0，r=0．999 5。表明本法检测麦芽糖含量 在 5～4()g·L 范围内线性关系良好。 2．5 精密度试验 精密吸取麦芽糖对照品溶液，按 照上述色谱条件和检测方法连续进样，每次进样量 2() L，进样 6次，以峰面积计算相对标准 偏差 RSD。计算得 RSD为0．65 9／6，表明试验方法精密度 良好。 2．6 重复性试验 取同批号供试品6份，按供试品 溶液配制方法制样，每份进样 2() L，测定麦芽糖含 量，计算相对标准偏差 RSD。计算得麦芽糖平均含 量100．6 g·L‘。，RSD为0．35 9／6，表明试验重复性 良 好 。 2．7 加样回收率试验 取 1()mL相同批号的供试 品 6份，准确称重 6份麦芽糖标准品，分别加人供试 品中，按供试 品溶液配制方法制样，每份进样 1() L，计算样品麦芽糖含量平均回收率。计算结果如 表 I，平均回收率99．4％，RSD为1．13 。 2．8 样品含量测定 按照“2．2．2供试品溶液配 制”的方法制样，取 20 L进样，测定，根据峰面积 表 1 麦芽糖回收率试验结果( =6) Tab 2 Results of recovery of malt ose( 6) 计算麦芽糖含量。本品为蛋白含量 5 9／6的人乙肝免 疫球蛋白静脉注射溶液，其中麦芽糖含量应控制在 (100±10)g·L～。测定并计算结果批号分别为 20040501，20040502，20040503的样品麦芽糖含量 分别为100．6，10()．7，101．7 g·L～。 3 讨论 麦芽糖在静注人乙肝免疫球蛋白制剂中作为蛋 白质的稳定剂，具有维持蛋白质活性结构、防止蛋白 质沉淀变性的作用。麦芽糖含量是该制剂的一项重 要质控指标，麦芽糖含量过低不能有效起到蛋白质 保护剂的作用，含量过高可能对接受输液的糖尿病 患者不利，因此准确控制制剂中麦芽糖含量十分重 要。 由于麦芽糖分子没有共扼结构，不能产生紫外 吸收，本方法中不采用常见的紫外检测器。在示差 折光检测中麦芽糖有明显的吸收峰，响应灵敏，因此 高效液相色谱分析采用示差折光检测器。 作者在实验研究中曾采用水作为流动相，样品 中的磺基水杨酸在水中电离，对氨基柱的使用寿命 不利，而在酸性条件下磺基水杨酸的电离被抑制，经 多次实验比较最后选定用0．004 tool·L 的硫酸溶 液作流动相，可保护氨基柱，延长柱的使用寿命。 蛋白质的存在会影响麦芽糖含量的测定，供试 批号的蛋白制剂中麦芽糖的含量大约 100 g·L～， 高效液相色谱分析时先要进行稀释。因此在制备供 试品溶液时，加人 4倍体积1．5 9／6的磺基水杨酸溶 液，不仅可以将供试品中的蛋白质沉淀除去，而且将 麦芽糖含量稀释到20 g·L 左右，在 HPLC测定的 线性范围内，所得结果准确可靠。 参考文献： [1] 朱启容，吕晴，顾新焕，等．阻断乙型肝炎病毒宫内传播的初步 研究[J]．中华儿科杂志，1995，33(2)：93． [2] 戴晓君．乙肝免疫球蛋白预防乙型肝炎病毒宫内感染 86例 口]．医药导报，2()04，23(8)；535． 1-31 中国生物制品标准化委员会．中国生物制品规程Is]．北京： 化学工业出版社，2000．338． [4] 中国药典．二部Is]．2005．183． [5] European pharmeuropa 3 ，1 997．2328． r收稿日期]2005-08—1 9 维普资讯 http://www.cqvip.com