高效迎头分析法测定药物-人血清白蛋白混合液中游离药物浓度

　　收稿日期 :2000211227 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (编号 :29975018) 作者简介 :乔明曦 (19762) ,男 ,硕士研究生。 通讯联系人 :李发美 ,教授 ,博士生导师 ,电话 : (024) 2384371123336 ,E2mail :fameili @ihw1com1cn。 高效迎头分析法测定药物2人血清白蛋白混合液中游离药物浓度 乔明曦 , 　郭兴杰 , 　李发美 (沈阳药科大学 , 辽宁 沈阳 110016) 摘要 :用高效迎头分析法 ( HPFA)测定了药物2人血清白蛋白 ( HSA) 混合液中游离药物的浓度。样品溶液不经任何 处理直接进样到装有内表面反相固定相的色谱柱中 ,用 67 mmol/ L 磷酸盐缓冲液 (p H 714 , I = 0117 mol/ L) 作流动 相。当进样体积足够大时 ,游离药物以平顶峰的形式被洗脱出来 ,平顶峰区域洗脱液中的药物浓度等于样品溶液 中游离药物的浓度。收集平顶峰区域的洗脱液 ,然后将一定体积的洗脱液注入到反相色谱柱中 ,测定游离药物的 浓度。用该法测定酮基布洛芬2HSA 和头孢哌酮2HSA 两种混合液中游离药物的浓度 ,并与超滤法进行了比较 ;考 察了进样体积和流速对平顶峰形成的影响。结果表明 ,获得平顶峰所需的最小进样体积随药物不同而不同 ;流速 对平顶峰的形成没有影响。高效迎头分析法与超滤法测得的游离药物浓度相同 ,并且具有相似的精密度。 关键词 :高效迎头分析法 ;超滤法 ;游离药物浓度 ;头孢哌酮 ;酮基布洛芬 ;人血清白蛋白 中图分类号 :O658 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :100028713 (2001) 0420329203 1 　前言 　　大多数药物在血液中都不同程度地与血浆蛋白 (如白蛋白、α2酸性糖蛋白等) 结合。这种结合一般 多是迅速的可逆性结合。被结合的药物由于不能通 过生物膜而无生理活性 ,只有游离药物才能由体循 环转运到作用部位发挥药效 ,因此游离药物浓度和 药物活性、毒副作用的关系较之药物总浓度更加密 切。测定血浆中游离药物浓度最常用的方法有平衡 透析法、超滤法、超速离心法等。近年来 ,Shibukawa 等[1 ,2 ]研究了在平衡条件下测定游离药物浓度的新 方法 高效迎头分析法 ( HPFA) 。该法具有如下 优点 : (1)能避免平衡透析法和超滤法的不足 ,即药 物易被膜吸收和膜可能使结合药物泄漏 ; (2)尤其适 合于药物蛋白结合率高、游离药物浓度低的样品的 测定 ; (3)血浆样品不需预处理可直接进样 ,易于实 现样品分析自动化。本文用 HPFA 测定了酮基布 洛芬2人血清白蛋白 ( HSA)和头孢哌酮2HSA 混合溶 液中游离药物的浓度 ,并与超滤法的测定结果进行 了比较。 2 　理论部分 　　1985 年 , Pinkerton 等[3 ]首次合成了内表面反 相固定相 ( ISRP) 。这种固定相具有亲水的外表面 和疏水的内表面。蛋白质由于分子尺寸太大而不能 进入固定相颗粒微孔的内部 ,而且不被固定相的外 表面吸附 ,因此 ,在色谱分离中不被保留或变性。小 分子的药物及其代谢产物等可以进入到固定相颗粒 微孔内部 ,并在疏水的内表面上进行分配 ,因而在色 谱分离中被保留和分离。因此 ,血浆样品在这种固 定相上可不经预处理直接进样。药物2人血清白蛋 白混合液刚进入色谱柱时 ,样品立即被流动相稀释 , 药物与蛋白的结合平衡被破坏 ,被结合药物得以释 放出来 ,进入固定相颗粒微孔中得到保留。如果进 样体积很小 ,所有被结合的药物都被释放出来 ,然后 被洗脱出色谱柱 ,这时测得的是样品溶液中的药物 总浓度。随着进样体积的增大 ,流动相中游离药物 的浓度逐渐升高。当足够量的样品溶液进入色谱柱 时 ,在色谱柱的顶端 ,游离药物浓度达到稳定状态 , 从而产生一平衡区带。在这一平衡区带中 ,固定相 间隙中药物与蛋白的结合平衡与原样品中相同 ,因 此 ,微孔内流动相中的药物浓度与原样品中的游离 药物浓度相等。当进样结束以后 ,蛋白质由于不被 保留而被先洗脱出柱 ,药物则以平顶峰的形式被洗 脱。平顶区域是由于平衡区带中的游离药物被洗脱 而产生的 ,因此 ,可以通过测定平顶峰的峰高 ,或与 普通 HPLC 法联合测定游离药物的浓度。 3 　实验部分 311 　仪器和试剂 　　Jasco PU2980 高效液相色谱仪、Jasco UV2975 紫外2可见分光光度检测器 (日本分光公司 ) ; CKChrom 色谱工作站 ( Scientific System Inc1 ) 。 HSA( Sigma 公司) ;头孢哌酮 ( CP) 和酮基布洛芬 第 19 卷第 4 期 2001 年 7 月 色 谱 CHIN ESE J OURNAL OF CHROMA TO GRAPHY Vol. 19 No. 4 J uly 2001 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. ( KP)对照品由中国药品生物制品检定所提供。乙 腈和甲醇为色谱纯 (山东禹王实业有限公司禹城化 工厂) ,其余试剂为分析纯 (沈阳化学试剂厂) 。 312 　色谱条件 31211 　测定酮基布洛芬的条件 (1) HPFA 条件 　色谱柱 : Pinkerton GFF2S52 80 (150 mm × 416 mm i. d. ,5μm , Regis Chemical Company ,USA) ;流动相 :67 mmol/ L 磷酸盐缓冲液 (p H 714 , I = 0117 mol/ L) ,流速 :015 mL/ min ;检测 波长 :258 nm。 (2) HPLC 条件 　色谱柱 :BDS C18 (250 mm × 416 mm i. d. , 5 μm , Shandon , U K) ; 流动相 : 50 mmol/ L 醋酸钠缓冲液 (p H 610)2甲醇 (体积比为 50 ∶50) ;流速 :018 mL/ min ,检测波长 :258 nm。 31212 　测定头孢哌酮的条件 (1) HPFA 条件 　与测定酮基布洛芬的 HPFA 条件相同。 (2) HPLC 条件 　色谱柱与测定酮基布洛芬的 HPLC 所用柱相同。流动相 : 10 mmol/ L 醋酸钠缓 冲液 (p H 410)2乙腈 (体积比为 80∶20) ;流速 : 110 mL/ min ;检测波长 :254 nm。 313 　样品溶液的配制 　　精密称取适量的 HSA ,用 67 mmol/ L 磷酸盐缓 冲液 (p H 714 , I = 0117 mol/ L ) 配制成 30μmol/ L HSA 溶液。用甲醇配制适当浓度的 KP 和 CP 溶 液。取各药物溶液适量 ,置于具塞试管中 ,N2 气流 下挥干甲醇。加入适当体积的 HSA 溶液 ,配制含 10 μmol/ L KP 和 30 μmol/ L HSA 的溶液及 2 μmol/ L CP 和 30μmol/ L HSA 的溶液。于 (25 ±1) ℃下放置 1 h 以上 ,直至分析。 314 　HPFA2HPLC测定游离药物浓度 　　分别进样 900μL KP2HSA 和 CP2HSA 样品溶 液 ,按上述 HPFA 条件分离 ,收集平顶峰区带的洗 脱液。分别取洗脱液 20μL ,进样 ,按上述 HPLC 条 件测定。 精密称取 KP 和 CP 对照品适量 ,分别用 67 mmol/ L 磷酸盐缓冲液 (p H 714 , I = 0117 mol/ L) 配 制成 7. 87μmol/ L和 2. 76μmol/ L的对照品储备液。 精密量取 KP 和 CP 储备液 1 mL ,2 mL ,3 mL ,4 mL 和 5mL 于 10mL 量瓶中 ,定容至刻度 ,即得对照品 溶液。分别取对照品溶液 20 μL ,进样 , 按上述 HPLC 条件测定 , 测得 KP 和 CP 分别在 0. 787 μmol/ L～ 3. 93 μmol/ L 和 0. 276 μmol/ L ～ 1. 38 μmol/ L范围内 ,线性方程为 : KP , Y = 3193 ×104 X - 1120 ×103 , r = 01999 5 ; CP , Y = 2109 ×104 X + 1132 ×102 , r = 01999 9。 315 　超滤2HPLC测定游离药物浓度 　　用超滤法作为对照方法测定药物2HSA 混合液 中游离药物浓度。超滤管为 NANOSEPTM ( Pall Filt ron Co ,USA) ,其可截留相对分子质量为10 000 的物质。精密移取 600μL 样品溶液置于超滤管中 , 以7 100 r/ min 的速率离心 3 min ,得到超滤液 100 μL 。为避免超滤膜对药物的吸附 ,取第二次超滤液 进行 HPLC 测定。HPLC 条件见“312”项下。 4 　结果和讨论 411 　HPFA与超滤法的比较 　　采用 HPFA2HPLC 和超滤2HPLC 测定相同样 品溶液中的游离药物浓度 ,测得的结果列于表 1。 由表 1 数据可见 ,两种方法测得的游离药物浓度一 致 ,两者的精密度也比较接近。 表 1 　HPFA2HPLC和超滤2HPLC测定游离酮基布洛芬 和头孢哌酮浓度 (平均值±SD , n = 3) Table 1 　Concentrations of unbound drugs determined by HPFA2HPLC and ultraf iltration2HPLC(mean ±SD , n = 3) Sample Total concentration of drug (μmol/ L) Concentration of unbound drug mean ±SD(μmol/ L) HPFA ultrafiltration Ketoprofen 10100 1114 ±0101 1112 ±0102 Cefoperazone 2100 0197 ±0102 0196 ±0102 　　为了保证高效迎头分析中的平顶区带内流动相 中药物的浓度与原样品中游离药物的浓度相等 ,必 须使流动相的组成、p H 及离子强度等与生理条件相 近。本试验采用的流动相为 67 mmol/ L 磷酸盐缓 冲溶液 (p H 714 ,离子强度 0117 mol/ L) ,而且不含 有任何有机溶剂 ,从而使样品溶液中药物2HSA 的 结合平衡能在色谱柱内的平衡区带得以维持。因 此 ,本法完全能够用于直接测定人体或动物血浆中 的游离药物浓度。 412 　进样体积对平顶峰形成的影响 　　如前所述 ,只有进样体积足够大时 ,HPFA 才能 获得平顶峰 ,从而测定游离药物的浓度。进样体积 对 CP 平顶峰形成的影响见图 1。从图 1 可见 ,对于 2μmol/ L CP230μmol/ L HSA 混合溶液 ,进样 500 μL 时开始有平顶峰形成 ;进样体积增加 ,平顶峰变 宽 ,但峰高不再增加。进样体积为 900μL 时 ,平顶 峰从 23. 1 min 持续到 2815 min。类似地 ,对于 10 μmol/ L KP230μmol/ L HSA 混合溶液 ,进样 900μL 时 ,平顶峰从 2018 min 持续到 2518 min。 413 　流速对平顶峰形成的影响 　　实验中发现 ,改变流动相流速不影响平顶峰区 ·033· 色 谱 第 19 卷 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 域洗脱液的体积。在样品的洗脱时间不过长的情况 下 ,用低流速流动相运载样品 ,可避免由于蛋白质吸 附在色谱柱入口端或筛板上而引起的柱压过高。如 果样品保留时间过长 ,可以在进样后 ,先以低流速流 动相洗脱蛋白质 ,待蛋白质峰洗脱后 ,再加大流动相 流速 ,以便在较短的时间洗脱药物。 图 1 　各种进样体积的头孢哌酮2HSA的 HPFA洗脱曲线 Fig11 　Elution prof ile of cefoperazone2HSA with various injection volumes in HPFA a2d. 2μmol/ L cefoperazone230μmol/ L HSA mixture ,injection volumes : a. 200μL , b. 500μL , c. 800μL , d. 900μL ; e. 30μmol/ L HSA ,injection volume : 800μL ; f . 2μmol/ L cefoperazone ; injection volume , 100μL . 参考文献 : [1 ] 　Shibukawa A , Nakagawa T , Nishimura N , et al1 Chem Pharm Bull ,1989 ,37(3) :7022706 [2 ] 　Shibukawa A , Terakita A , He J Y , et al1 J Pharm Sci ,1992 ,81 (7) :7102715[3 ] 　Hagestam I H , Pinkerton T C1 Anal Chem , 1985 ,57 :1 75721 763 Determination of Unbound Concentration of Drug in Drug2Human Serum Albumin Mixture by High Performance Frontal Analysis Q IAO Ming2xi , GUO Xing2jie , L I Fa2mei ( S henyang Pharm aceutical U niversity , S henyang 110016 , China) Abstract: A high performance frontal analysis ( HPFA) method was developed to determine the unbound concentration of drugs in drug2human serum albumin ( HSA) mixture under binding equilibrium1 The sample was injected directly onto an internal2surface reversed2phase silica column ( ISRP) 1 The mobile phase was 67 mmol/ L phosphate buffer (p H 714 , I = 0117 mol/ L) 1 When a large volume of sample solution under drug2HSA binding equilibrium was directly injected , the drug was eluted as a trapezoidal peak with a plateau , and the drug concentration in this region was the same as that of the unbound drug in the sample solution1 The eluate of plateau region was collected and a small volume was injected onto a reversed2phase HPLC column1 This HPFA2 HPLC method was employed in the determination of unbound concentration in both ketoprofen ( KP)2HSA and cefoperazone (CP)2HSA mixtures1 The unbound concentrations of drugs obtained by using HPFA2HPLC were compared with those determined with ult rafilt ration2HPLC1 The effects of sample volume and flow rate of mobile phase on the plateau formation were investigated1 It was found that the minimum injection volume to achieve a trapezoidal peak varied with drugs1 The flow rate showed no effect on the trapezoidal peak formation1 The unbound concentrations of KP and CP obtained were about the same by using HPFA2HPLC or ult rafilt ration2HPLC and precisions were similar for both methods1 Key words : high performance frontal analysis ; ult rafilt ration ; unbound concentration of drug ; cefoperazone ; ketoprofen ; human serum albumin ·133·　第 4 期 乔明曦等 : 高效迎头分析法测定药物2人血清白蛋白混合液中游离药物浓度 © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. 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