骨缺损使用异种骨治疗的瓶颈及展望

骨缺损使用异种骨治疗的瓶颈及展望 　　　　骨移植是临床医生治疗骨不连、 骨缺损以及进行关节融合的重要手段。自体骨由于具有骨传导性、骨诱导性、成骨性等优点是骨移植材料的金，但由于其增加患者创伤、 加重患者痛苦等促使临床医生寻求替代材料。异种骨作为 20 世纪 50~60 年代兴起的骨移植材料，具有来源广泛、价格低廉等优点且理化特性与人骨质类似，具有广阔的发展前景。目前困扰骨科医生的主要问为怎样使异种骨由死骨变活骨，从而使其表现出类似自体骨生物力学性能。本文就异种骨免疫学特性、 异种骨材料制备及异种骨活化进行深入讨论。 　　1 异种骨免疫学特性 　　异种组织免疫原特性与人体组织免疫原特性差异很大， 因此充分掌握异种骨组织免疫学特点是进行异种骨材料研究的必要前提。 骨组织中无机成分主要是碳酸羟基磷灰石，与人骨类似，因此异种骨去除有机成分后无免疫原性且生物相容性较好。 有机成分主要为胶原蛋白，其中 95%为Ⅰ型胶原，一般认为在种系间结构组成差异不大， 其抗原部分主要为氨基末端区域，该抗原成分不引发明显免疫反应，也不影响成骨作用。 引发免疫反应的主要成分包括骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等，所有这些细胞表面均存在 MHC-Ⅰ型抗原及 α-Gal 抗原；MHC-Ⅱ抗原主要存在于骨髓细胞表面。 在异种移植由于种属间MHC 结构差异较大，T 细胞借助于受者的抗原递呈细胞，通过间接途径识别抗原引发免疫反应。 α-Gal抗原是主要存在于灵长目以外哺乳动物体内的异种抗原， 该抗原主要通过与人血清内存在的抗 α-Gal抗体结合而引发体液免疫反应[1]. 尽管目前存在多种去抗原处理方法， 但其核心均为破坏上述细胞结构完整性，去除抗原蛋白组分。轻微免疫学反应对其生物性能无不良影响， 而过分追求消除免疫反应反而可降低成骨性能， 故今后研究方向应从单纯物种间免疫反应差异向免疫反应与生物活性方面转变。 　　2 异种骨材料制备    　　由于种属间免疫学差异导致其与人体组织相容性差，直接用于人体引起强烈的免疫排斥反应，因此去除抗原物质是保证异种骨载体良好性能的前提。 　　经过去抗原处理的异种骨应具备以下特点： 良好的组织相容性， 并随本体骨组织的长入降解为可吸收组分；具有多孔结构，有利于营养物质输送、组织细胞的粘附增殖等；具有骨传导性。 为达到上述目的，研究人员设计出多种去抗原处理方法， 依据处理媒介不同主要分为物理方法和化学方法。 　　2. 1 物理方法 　　目前常用的物理异种骨脱抗原方法包括高温煅烧和冷冻冻干骨。 高温煅烧主要通过碳化作用破坏骨内有机质从而彻底消除其抗原性， 煅烧后其主要成分为羟基磷灰石。对异种骨进行高温处理时，其成分变化主要经历以下阶段： 低于 200 ℃时主要是水分 的 丧 失 ;200~300 ℃开 始 破 坏 细 胞 成 分 ;高 于300 ℃时胶原及蛋白组分开始燃火；400~900 ℃时碳酸磷灰石逐步转变为羟磷灰石， 从而引发骨材料结晶度等方面的改变。 在 300 ℃煅烧骨组织时不改变结晶度及无机组分， 在材料表面形态及理性特性等方面与人骨类似。 有证据表明在 300 ℃煅烧的 BioOss 骨材料内残留Ⅰ型胶原及表面氮， 这些物质可能有利于改善其力学特性及生物相容性。 Rokn 等[2]发现 Bio-Oss 骨的成骨能力与 β-磷酸三钙相似，但其诱发的局部组织炎症反应甚至更低且成骨性能更佳。 与上述亚高温处理相比，900 ℃以上处理异种骨时， 获得骨材料不含有机组分因此不需担心免疫反应的影响， 组织成分主要为 HA （羟磷灰石）。 Pra-manik 等[3]研究发现牛骨在 900 ℃进行煅烧时可获得纳米羟基磷灰石， 该晶体材料具有相互交通密集孔从而提升其生物相容性，且物理性能较佳。但是此种方法获得骨材料只具备骨传导性，无骨诱导性，且其置入体内后能否逐步降解尚需进一步研究。 　　冷冻骨的一般处理温度为-20 ℃， 在冰结晶颗粒缓慢形成的过程中通过力学作用、 化学损伤及酶反应而降低骨组织抗原性。 该处理方法保留了骨组织中Ⅰ型胶原及 BMP 等成骨活性成分，与煅烧相比具有物理特性更佳且置入体内后诱导成骨作用更强等优点。但是其祛除抗原作用较差，甚至引发免疫反应而影响成骨作用。 Andrade 等[4]发现-70 ℃对细胞等抗原成分破坏较-20 ℃效果更好， 但同时对胶原蛋白造成损伤程度加重，损害骨组织机械特性。与之相比， 深低温冷冻后再对异种骨进行脱水处理其祛除抗原作用较为彻底。 冷冻后的干燥脱水过程在降低免疫原性的起重要作用， 其原理在于脱水过程所伴发的细胞内钠离子浓度的增加。 冻干骨残留水分为 3%~5%,保存时间可达 4~5 年。 冻干异种骨具有生物力学特性较佳、经济方便等优点。 刘玉增等[5]以兔桡骨缺损作为实验模型， 对冻干异种冻干与冻干同种骨治疗骨缺损效果进行对比， 结果发现术后 12 周两组组织学分析无明显差异，置入异种骨大部为骨小梁替代，部分动物出现部分骨髓组织、髓腔再通。 Long 等[6] 　　对冻干骨进行扫描电镜观察发现尚有少了细胞组分残留，T 细胞增殖试验亦证实其引发的免疫反应较其他处理方式更加强烈。 尽管冻干骨物理特性较佳且有骨诱导特性但残留抗原物质较多，因此最好与其他处理方式联合应用，从而在保持其良好理化特性的同时最大限度的去除免疫原性。 　　2. 2 化学方法 　　该法主要利用化学试剂对异种骨进行脱脂、脱蛋白、 脱细胞以及去除矿物质等处理获得部分脱蛋白骨、完全脱脂脱蛋白骨及脱细胞骨基质等。传统脱脂方法主要为氯仿、甲醇等有机溶剂浸泡，但其脱脂作用不完全且容易残留从而危害人体健康。 超临界CO2作为一种较为成熟工业萃取剂最先应用于生物工程领域， 该物质具有类似气体的扩散性及液体的溶解能力，同时兼具低黏度，低表面张力的特性，使得超临界流体能够迅速渗透进入微孔隙的物质。 田家亮等[7]利用超临界 CO2对猪骨进行脱脂处理，发现脱脂效果优于传统脱脂方法， 且保存了骨组织微多孔结构和合适的孔隙率。 但是超临界 CO2对设备要求高，增加工艺成本，尚难大规模应用于工业生产。 　　异种骨脱蛋白媒介包括次氯酸钠、双氧水、乙醇等，其中 H2O2应用最多，其作用机制为通过强氧化作用使蛋白质变性， 消除或减弱抗原性。 高浓度H2O2浸泡可部分消除异种骨的抗原性， 且浸泡时间越长抗原性消除越彻底， 但浸泡时间增加以及 H2O2浓度越高必然会损害骨组织机械强度， 合适的处理时间目前较大争议。 高中礼等[8]通过研究发现异种骨经 30% H2O2处理 8 h 为最佳处理时间可使抗原性降至最低，最大程度地保留生物力学强度。但同时利用 30 % H2O2对骨组织进行脱蛋白处理，发现 12~36 h 后有机物含量无明显改变且细胞等抗原成分已基本祛除，超过 30 h 对胶原蛋白及羟基磷灰石破坏加重，推荐处理时间在 12~30 h 内为宜[9]. 　　通过把上述化学处理剂综合利用， 研究人员探索出了 BioCleanse 骨组织处理系统： 将骨组织冲洗后依次浸乙醇、双氧水、洗涤剂及清洗液，同时在正负压交替的环境下进行组织震荡漂洗[10]. 该技术首先用于处理同种异体骨，可有效祛除骨中脂肪组织、细胞成分及其他抗原成分， 在祛除抗原成分的同时可较好的保持理化特性且具有消毒灭菌效果。 Katz等[11]以 BioCleanse 处理的牛骨作为实验组，以同种异体羊骨作为对照组，置入羊胫骨缺损模型，结果发现经 BioCleanse 处理异种骨所引发的免疫反应与同种异体骨相似，且与受体骨组织融合较佳，周围组织无明显纤维化反应。目前此类异种骨研究相对较少，其实际临床效果有待进一步研究。 　　3 重组异种骨 　　异种骨在经上述脱抗原处理时， 成骨作用相关的活性成分亦遭到破坏， 所制备的异种骨支架近具备骨传导性能或微弱的骨诱导性能，无成骨性能。单纯异种骨材料置入体内后依靠两端骨组织爬行替代，因此需要修复骨缺损作用缓慢甚至不能修复。而异种骨支架与成骨活性物质或细胞结合后可获得成骨性能，临床效果得到一定提升。 　　3. 1 异种骨与细胞重组 　　重组细胞来源包括胚胎干细胞、 骨髓间充质干细胞以及脂肪间充质干细胞等。 理论上胚胎干细胞性能最佳，但社会伦理问题等使其应用受限。骨髓间充质干细胞相关研究最为充分， 其多能干细胞具有分离培养简单、 体外扩增迅速及有向成骨细胞分化趋势等优点， 动物及临床实验均证明其与骨支架材料复合后成骨性能极佳[12]. 但以下问题限制其在临床的广泛应用：数量较少，约 100 000 个骨髓细胞中含有 1 个骨髓间充质干细胞； 随体外扩增系数增加成骨性能下降； 提取骨髓细胞时对身体局部伤害较大。作为骨髓间充质干细胞的潜在替代细胞，脂肪间充质干细胞相关研究近来逐渐增多。 该细胞在细胞表面标志物、 基因表达序列及分化潜能方面等与骨髓间充质干细胞相似，因此该细胞可发挥成骨作用。 　　Arrigoni 等[13]以羟磷灰石做为支架材料与脂肪间充质干细胞复合用于修复兔胫骨骨缺损， 结果发现与对照组相比脂肪间充质干细胞可明显改善骨组织产生速度。 但骨间充质干细胞及脂肪间充质干细胞与支架材料复合后何者成骨性能更强目前仍未达成一致。 Han 等[14]以兔颅骨缺损为实验模型对两者成骨性能进行对比，发现两者成骨性能相当。 Niemeyer等[15]以羊胫骨缺损作为实验模型对两者进行对比，得出了骨髓间充质细胞成骨性能高于脂肪间充质细胞的结论。