人参皂甙Rb1对香烟烟雾诱导大鼠神经
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现代预防医学2011年第38卷第8期ModernPreventiveMedicine,2011,Vol.38,NO.8
文章编号:1003-8507(2011)08-1500-04中图分类号:R34文献标识码:A
【实验技术及其应用】
人参皂甙Rb1对香烟烟雾诱导大鼠神经细胞损伤的
保护作用
庄严1,柳忠兰2,王丹丹1,李欣1,陈丽丽1,曹亦宾1
摘要:[目的]探讨人参皂甙Rb1(GRb1)对香烟烟雾诱导大鼠神经细胞损伤的保护作用和机制。[
]制
备烟灌注大鼠模型,吸烟量分别为8、20、40支/d,12周后腹腔注射不同剂量的GRb1(10、20、40mg/kg)。各组大鼠同时制备皮层神经细胞培养液,24h后应用AnnexinV联合流式细胞仪检测细胞凋亡率和坏死率,Western-Blot检测存活素(Survivin)的
达水平,Fura-2/AM负载及荧光标记检测神经细胞内游离Ca2+浓度。
[结果]香烟烟雾刺激诱
导神经细胞发生凋亡和坏死,与对照组相比凋亡率和坏死率显著增高。与对照组相比,8支/d香烟烟雾刺激使Survivin表达增强34%,20、40支/d香烟烟雾刺激使Survivin表达分别下降48%和67%;20、40mg/kg的GRb1使细胞凋亡率分别下降30.6%和40.3%,细胞坏死率分别下降32.5%和39.4%,Survivin表达水平上调45.1%和54.8%。香烟烟雾可使神经细胞内游离Ca2+浓度显著升高,GRb1使神经细胞内Ca2+浓度显著下降(P﹤0.01)。
[结论]GRb1通过抑制细胞内
Ca2+超载,调节Survivin表达,减轻香烟烟雾对神经细胞的损伤。
关键词:人参皂甙Rb1;香烟烟雾;细胞凋亡;存活素;钙
PROTECTIVEEFFECTSOFGINSENOSIDERB1AGAINSTRATNEURONALINJURYIN-DUCEDBYCIGARETTESMOKEZHUANGYan,LIUZong-lan,WANGDan-dan,etal.(Depart-mentofNeurology,TheAffiliatedTangshanWorkers’Hospital,HebeiMedicalUniversity,Tangshan063000,China)
Abstract:
[Objective]ToinvestigatetheeffectsofGinsenosideRb1(GRb1)onratneurotoxicityinducedbycigarette
smoke.[Methods]MaleWisterratswerepreparedundercigarettesmokingfor12weeks.Theamountofcigaretteswas8,20and40perday,respectively.GRb1(10,20and40mg/kg)wasadministeredintra-peritonealtoratsafterratsmokingfor12weeks.Cerebralcortexneuronalcellswerepreparedfromtheseratsinvitro.After24hofGRb1treatment,flowcytometricanal-ysisofAnnexinV(marksapoptosis)andPI(propidiumiodide,marksnecrosis)labelingcells.Western-BlotexperimentwasusedtodetecttheexpressionofSurvivin.ThecontentsoffreeCa2+weredeterminedineachgroup.[Results]Cigarettesmokeinducedcerebralcortexneuronalapoptosisandnecrosis,apoptosisandnecrosisratesweresignificantlyincreasedcomparedwithcontrolgroup.Comparedwithcontrolgroup,8rami/dcigarettesincreased34%inthelevelofSurvivin,20or40rami/dcigarettesdecreased48%and67%inthelevelofSurvivin.However,GRb1markedlyreducedapoptosisandnecrosisduetotoxicityof20rami/dcigarettescomparedwiththevehicle-treatedcigarettesmokegroup,theapoptosiswasreducedby30.6%and40.3%,andnecrosiswasreducedby32.5%and39.4%,aftertreatmentbyGRb1of20and40mg/kg.Meanwhile,GRb1obviouslyreversedthedown-regulationofSurvivinexpressioninducedbycigarettesmoking(up-regulationby45.1%and54.8%whencomparedwiththatofthevehicle-treatedcigarettesmokinggroup).ACa2+probeshowedanobviousincreaseintheintra-cellularCa2+duringcigarettesmokingtreatment,andGRb1of20or40mg/kgsignificantlyshoweddowncigarette-inducedCa2+influx(P﹤0.01).[Conclusion]TheneuroprotectiveeffectofGRb1againstcigarettesmoketoxicitywasassociatedwithinhi-bitionoftheaccumulationofintracellularCa2+andup-regulationofSurvivinexpressionincerebralcortexneurons.
Keywords:GinsenosideRb1;Cigarettesmoke;Apoptosis;Survivin;Ca2+
吸烟是威胁人类健康的重要公共卫生问题,许多神经系统疾病如帕金森病、脑缺血等都与香烟烟雾的神经毒性有关[1]。细胞凋亡在香烟烟雾介导的神经细胞损伤中起重要作用,香烟烟雾可触发神经细胞Ca2+内流,致使细胞内Ca2+超载,通过一
基金项目:河北省唐山市科学技术研究与发展指导计划项目(09200251c)作者简介:庄严(1976-),女,硕士,研究方向:脑血管病
作者单位:1.河北医科大学附属唐山工人医院神经内科,唐山,063000;
系列酶促反应导致神经细胞发生凋亡。存活素(Survivin)基因是近年新发现的凋亡抑制基因,在线粒体水平参与抗凋亡过程[2]。最近的研究发现,激活Survivin过表达可减轻脑缺血损伤后内皮细胞的凋亡[3],提示细胞内Survivin水平对脑损伤后神经元存活意义重大,可作为神经细胞保护的靶点。
人参皂甙Rb1(GinsenosideRb1,GRb1)是人参中提取的二醇类皂甙,近年研究表明GRb1对受损的脑细胞具有保护作用,但其具体机制还不甚清楚[4]。本研究中,我们建立了烟灌注大鼠动物模型,在此基础上观察GRb1对香烟烟雾导致的脑
2.中国医科大学附属第一医院神经内科
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损伤的保护作用,并探讨其作用机制。闭后,加入兔抗人Survivin多克隆抗体(1︰200)4℃过夜,相应二抗(1︰2000)室温孵育1.5h,辣根过氧化物酶-DAB法显色,可观察到特异性抗原条带。兔抗大鼠β-actin为内参照。特异性抗原条带的定量分析:用凝胶成像分析系统测定每例标本Survivin条带及相应β-actin条带的灰度值。设对照组
1材料与方法1.1材料
8周龄雄性Wistar大鼠由中国医科大学实验动物部提供。AnnexinV凋亡试剂盒(CaltagLabomtories公司);Fura-2/AM(Sigma公司);B27和Neurobasal培养液(Gibco公司);兔抗
人Survivin多克隆抗体、β-actin兔抗大鼠多克隆抗体、羊抗兔二抗(SantaCruz公司);试验用香烟为市售某品牌香烟,尼古丁含量1.2mg/支,焦油含量16mg/支;人参皂甙Rb1由中国药品生物制品检定所提供,批号0704-2005。其余试剂均为国产分析纯。
survivin条带灰度值为1,其余各组survivin条带灰度值用其与
对照组相比所得的相对值来表示。
1.6大鼠皮层神经细胞内游离Ca2+的测定
取2ml培养的神经细胞悬液,置于37℃水浴中预温5min
后加入Fura-2/AM(终浓度为5μmol/L),37℃水浴中恒温振荡45min,负载后的细胞用含0.2%牛血清清蛋白的Hanks夜冲洗2次,再将细胞浓度调整到每毫升2×106个细胞,然后进行荧光测定。采用日立MPE-4型荧光分光光度计,激发光波长为340nm和380nm,发射光波长为500nm,测定时依次
静息、加入TritonX-100和EGTA后340n、380nm荧光比值,利用公式计算:细胞内游离Ca2+浓度=kd×(R-Rmin)/(Rmax-R),其中kd=224nmol/L,R为静息状态测定值,
1.2动物分组及细胞悬液的制备
Wistar大鼠随机分组:对照组、8支/d吸烟组、20支/d
吸烟组、40支/d吸烟组。对照组不做任何处理,吸烟组香烟烟雾灌注12周,其中20支/d吸烟组大鼠于烟灌注12周后腹腔注射GRb1(10、20及40mg/kg)。各组大鼠在24h后断头取大脑皮层神经细胞,经0.25%胰蛋白酶37℃消化20min,轻柔吹打分散细胞,离心后以磷酸盐缓冲液悬起,植入培养皿,置于36.5℃的培养箱(含5%CO2)内培养,4h后神经细胞贴壁,换上添加2%B27的Neurobasal培养液继续培养。24h后进行细胞凋亡和Western-Blot检测。
Rmin为加入EGTA后340n、380nm荧光比值,Rmax为加入TritonX-100后340n、380nm荧光比值。1.7
统计学处理
所有数据以±s表示,采用SPSS11.0统计学分析软件对数据进行单因素方差分析q检验,组间比较用SNK-q检验,以α=0.05为检验水准。
1.3吸烟动物模型的制备
参照Chow等[5]烟灌注模型的建立方法,稍加改进。以角
钢、有机玻璃及钢丝制成600mm×400mm×300mm吸烟鼠箱,于鼠箱侧面斜对两侧各打双孔(直径=10mm,间距=10
22.1
结果
人参皂甙Rb1对香烟烟雾诱导大鼠神经细胞死亡的作用香烟烟雾刺激对大鼠神经细胞凋亡和坏死均产生影响。小
mm),一侧双孔接双腔空气泵,分别输入烟雾及空气,一侧双
孔通外界,确保箱内空气中氧浓度与外界相同。
量吸烟(8支/d)对皮层神经细胞的毒性作用小,可见少量凋亡细胞。当吸烟量增加到20支/d时,细胞的凋亡率和坏死率分别比对照组上升162%和117%(P﹤0.01);当吸烟量增加到
1.4流式细胞仪检测皮层神经细胞凋亡
对各实验组培养的神经细胞,按产品说明
介绍的方法用
AnnexinV凋亡试剂盒联合流式细胞仪检测细胞凋亡率和死亡率。AnnexinV标记凋亡细胞,P标记坏死细胞。1.5Western-blot检测大鼠脑内Survivin的表达
取待测脑组织100mg,加入组织裂解液1ml,匀浆。取上清液测定蛋白浓度。取80μg蛋白加入缓冲液,煮沸变性45min,迅速低温冷却后行琼脂糖凝胶电泳。经过转膜和膜封40支/d时,细胞的凋亡率和坏死率分别升高295%和358%(P﹤0.01),可见香烟烟雾对神经细胞的损伤作用随吸烟量增加而加大。但在吸烟12周后加入人参皂甙Rb1,细胞的损伤程度减轻;特别是20和40mg/kg的人参皂甙Rb1分别使细胞凋亡下降30.6%和40.3%(P﹤0.01),使细胞死亡率下降32.5%和39.4%(P﹤0.01)。见表1、图1。
1 Survivinn = 6
!"’(&)*&&)"*&&&)"+
2.2人参皂甙对香烟烟雾影响Survivin表达的作用表达上升了21.5%、45.1%和54.8%(P﹥0.05,P﹤0.01,P﹤
Western-Blot结果显示,香烟烟雾使皮层神经细胞凋亡抑
制基因Survivin表达发生明显变化,其变化模式随吸烟量改变而不同。与正常对照组相比,小量吸烟(8支/d)使神经细胞Survivin表达增强34%(P﹤0.05),而较大量吸烟则使Survivin表达减弱,并且存在浓度依赖关系,吸烟量越大,Survivin表达下调越显著。人参皂甙Rb1可剂量依赖性地抑制20支/d香烟烟雾引起的神经细胞Survivin表达的下调。与20支/d吸烟
组相比,10、20及40mg/kg的人参皂甙Rb1分别使Survivin
0.01)。见表1、图2。
2.3人参皂甙Rb1对香烟烟雾诱导神经细胞内游离Ca2+水平
变化的影响
正常情况下,大脑皮层神经细胞内Ca2+水平稳定,但香烟烟雾(20支/d)吸入后神经细胞内游离Ca2+水平发生明显变化,其水平升高到对照组的2.4倍。人参皂甙Rb1可剂量依赖性地抑制香烟烟雾引起的Ca2+内流,在10、20及40mg/kg的人参皂甙Rb1作用下,香烟烟雾诱导的神经细胞内Ca2+水平分
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别升高到正常对照组的2.1、1.6和1.42倍,均低于香烟烟雾处理组(P﹥0.05,P﹤0.01,P﹤0.01)。见表2
。
3讨论
香烟烟雾中有许多有害化学成分,进入机体后可严重干扰
其正常生理功能,继而对机体产生多方面的损害。香烟烟雾产生的神经毒性作用是脑卒中发病的重要机制。然而,由香烟烟雾引起的细胞死亡方式目前存在争议。有人认为香烟烟雾只引起神经细胞快速的坏死性死亡[6];也有人认为细胞的坏死和凋亡均参与香烟烟雾介导的细胞损伤过程,并且香烟烟雾的浓度、作用时间以及作用的细胞类型是决定细胞死亡方式的主要因素[7]。本研究实验结果支持后一种观点:香烟烟雾可引起神经细胞凋亡,又可引起细胞坏死。相对较低浓度的香烟烟雾主要引起细胞凋亡,随香烟烟雾浓度的提高,神经细胞坏死率的上升要明显快于细胞凋亡率的升高。
Ca2+超载是引起细胞凋亡的重要原因。在不良因素刺激下,
注:a:对照组;b吸烟组(20支/d);cGRb1(10mg/kg)组;d:
细胞内游离Ca2+增多激活钙调蛋白分解酶、Ca2+/钙联蛋白调节的钙调神经磷酸酶等,通过线粒体途径导致细胞凋亡[8]。本研究结果发现,20支/d香烟烟雾刺激后神经细胞内游离Ca2+水平发生明显变化,其水平升高到对照组的2.4倍,由此认为
GRb1(20mg/kg)组;eGRb1(40mg/kg)组
图1人参皂甙Rb1
对吸烟大鼠神经细胞死亡的作用
Ca2+超载引起细胞凋亡是香烟烟雾导致神经细胞损伤的重要机
制之一。
人参是传统中药,其主要成分是人参皂甙,具有清除氧自由基、对抗氧化损伤等活性,对人体各系统的保护作用研究日渐增多。RadadK等[9]发现人参皂甙可以通过阻断Ca2+内流以对抗谷氨酸毒性,显著增加培养液中多巴胺能神经元轴突的表达和数量,促进神经细胞存活;JiangQS等报道,人参皂甙
Rb1可降低肥厚型心肌病大鼠细胞内游离钙浓度[10]。本研究结
果表明,人参皂甙Rb1可减弱香烟烟雾诱导的神经细胞Ca2+浓度升高,有效降低香烟烟雾引起的神经细胞死亡。
存活素是1997年由耶鲁大学的Ambrosini等利用效应细胞蛋白酶受体-1(EPR-1)的cDNA,在人类基因组文库中筛选克隆出来的一个新基因,具有抗细胞凋亡能力。近年来,尽管
Survivin与恶性肿瘤的关系研究得非常深入[11],但是在脑血管
疾病方面的研究却比较少见。我们研究发现,香烟烟雾影响大脑皮层神经细胞内Survivin表达,低剂量的香烟烟雾使Sur-
vivin表达上调,而较大剂量的香烟烟雾使Survivin表达剂量依赖性地下调。同时还发现Survivin表达水平与细胞凋亡率、死亡率呈负相变化,提示Survivin表达改变参与香烟烟雾诱导的
神经细胞损伤过程,是神经细胞耐受伤害性刺激的一个重要保护因子;人参皂甙Rb1可剂量依赖性地逆转香烟烟雾诱导的
Survivin基因表达的下调,该结果与其对香烟烟雾引起神经细
胞损伤的保护作用相一致。
注:a:对照组;b吸烟组(20支/d);cGRb1(10mg/kg)组;d:
综上所述,人参皂甙Rb1可以通过降低细胞内Ca2+超载,提高Survivin的表达,对香烟烟雾致大鼠神经细胞损伤起保护作用,这可能是人参皂甙Rb1减轻缺血性脑损伤作用的机制之一。考虑到香烟烟雾成分的复杂性,人参皂甙Rb1是否还通过其他途径对香烟烟雾所致的脑细胞损伤发挥保护作用,还有待于更为深入的研究。参考文献:
[1]QiaoD,SeidlerFJ,SlotkinTA.Oxidativemechanismscontribut-
GRb1(20mg/kg)组;eGRb1(40mg/kg)组
图2人参皂甙Rb1对吸烟大鼠神经细胞Survivin表达的影响
2 GRb120/d
Ca2+
n = 6
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n
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(下转第1505页)
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2 Eca109 ×10Án = 3
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CyclinD1的表达,这与流式细胞分析的结果一致,表明核黄3 Eca109 cyclin D1
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×10n = 3 素可能未对食管癌细胞G1/S期的调控产生影响。核黄素加入
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后则延长了G2期进程,表现为细胞发生G2/M期阻滞。表明核黄素可选择性地作用于Eca109的G2/M期,并参与其细胞周期的调整。核黄素对肿瘤细胞M期的阻滞作用,可能对周期特异性化疗药物合用协同抗肿瘤有重要的理论意义。参考文献:
3讨论
本研究结果显示核黄素对Eca109细胞生长并不具有抑制
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作用,随时间积累,各组的增殖率差别不大。肿瘤的发生是细胞增殖和分化失调的结果,而细胞增殖和分化的调控,是由多个基因在多环节上控制的复杂过程,受多种因素影响。细胞周期不同时相间存在关键的调控点。真核生物细胞的增生被控制在细胞周期的一个特定阶段,特别是G1期到S期,G2期到M期转化过程中,细胞周期的转化依赖于一系列的细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶的表达和激活。G1/S期的调控
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