三亲交配法

三亲（含有不同质粒的三种细菌）交配法将中间载体质粒导入根癌农杆菌 用三亲交配法将中间质粒转入农杆菌的过程需要三种细菌，即含有中质粒的大肠杆菌供体菌，含有游动质粒pRK2013的大肠杆菌“协助”菌(helper)和根癌农杆菌受体菌。当这三种菌混合时，协助质粒pRK2013游动进入大肠杆菌内，提供游动(mol)和转移(tra)功能，把供体的中间质粒转移进根癌农杆菌内。 关键词：质粒 HYPERLINK "http://www.ebioe.com/tag.php?tag=%BD%BB%C5%E4" 交配 HYPERLINK "http://www.ebioe.com/tag.php?tag=%B8%CB%BE%FA" 杆菌 HYPERLINK "http://www.ebioe.com/tag.php?tag=%C8%FD%C7%D7%BD%BB%C5%E4%B7%A8" 三亲交配法 HYPERLINK "http://www.ebioe.com/tag.php?tag=%D6%D0%BC%E4%D4%D8%CC%E5%D6%CA%C1%A3" 中间载体质粒 HYPERLINK "http://www.ebioe.com/tag.php?tag=%B8%F9%B0%A9%C5%A9%B8%CB%BE%FA" 根癌农杆菌 HYPERLINK "http://www.ebioe.com/tag.php?tag=%B8%F9%B0%A9" 根癌 HYPERLINK "http://www.ebioe.com/tag.php?tag=%C5%A9%B8%CB%BE%FA" 农杆菌 HYPERLINK "http://www.ebioe.com/tag.php?tag=%D4%D8%CC%E5%D6%CA%C1%A3" 载体质粒 一、原理 用三亲交配法将中间质粒转入农杆菌的过程需要三种细菌，即含有中质粒的大肠杆菌供体菌，含有游动质粒pRK2013的大肠杆菌“协助”菌(helper)和根癌农杆菌受体菌。当这三种菌混合时，协助质粒pRK2013游动进入大肠杆菌内，提供游动(mol)和转移(tra)功能，把供体的中间质粒转移进根癌农杆菌内。该系统中中间质粒需要带有一个特定的转移起始点(ori)和活化位点(bom)，以使协助质粒的游动和转移基因对它起作用，被驱动转移。三亲结合使用的受体根癌农杆菌一般带有染色体抗性标记，如抗利福平(Rif)，供体质粒（中间质粒）常带有抗Km, St, Tc或Ap标记，这样利用Rif+Km选择转移接合子。受体农杆菌所含的Ti质粒应是解除武装的卸甲Ti质粒。 二、目的 了解Ti质粒和根癌农杆菌的特征及植物基因转化中制备转化载体的原理，通过三亲交配法将中间质粒转入根癌农杆菌。 三、材料、试剂 1、受体菌：农杆菌LBA4404（Rifr） 2、协助菌：大肠杆菌HB101（pRK 2013）。 3、供体菌：带有中间达载体pBI 121的大肠杆菌(Kmr)。 4、MGL固体培养。 5、LB液体、固体培养基。 6、利福平贮备液。 7、卡那霉素贮备液。 四、操作 1、接种受体农杆菌在含有100mg/ml利福平的MGL固体培养基上，28℃培养，等单菌落长出后，挑选一个单菌落接种在MGL液体培养基中，28℃振荡过夜。 2、接种协助菌在固体LB培养基上，37℃培养，等菌落长出后，挑选一个单菌落接种在LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。 3、挑选带有中间载体如pB I 121的大肠杆菌（供体菌）的单菌落接种在含有50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。 4、当三种菌生长到OD260为0.5左右时，等体积混匀，涂布于不含任何抗生素的MGL固体培养基上，28℃过夜培养。 5、用接种针将长出的菌落转接到含有100mg/ml利福平和50mg/ml卡那霉素的固体MGL培养基上，28℃培养3－4天，长出单菌落。 6、将长出的单菌落再次转接到含有100mg/ml利福平和50mg/ml卡那霉素的MGL固体培养基上，28℃培养3－4天，直至长出菌落。此时的受体农杆菌中带有中间质粒。通过进一步扩增，即可用于植物的转化。