海藻酸钙固定水生假丝酵母生产耐酸性_淀粉酶

2008No.11 SerialNo.188 ChinaBrewing ResearchReport α-淀粉酶被广泛用于淀粉的降解工业中，涉及食品、 造纸、纺织等行业[1-3]。α-淀粉酶广泛存在于人、动物、植 物、真菌和细菌等各种生物体中，其中来源于微生物（真菌 和细菌）的α-淀粉酶占其中的绝大部分。目前已经可以从 芽孢杆菌属、曲霉属、链霉菌属、酵母菌等接近90种微生 物中分离获得α-淀粉酶[4]。工业上大量使用的α-淀粉酶 主要来源于枯草芽孢杆菌、水解淀粉酶芽孢杆菌、黑曲霉 和米曲霉，其中能够产生耐酸性α-淀粉酶的大多为芽孢 杆菌和曲霉[4]。耐酸性淀粉酶由于能够忍受极端酸性环境 且保持较高活性而受到研究者的注意。 目前，国内外利用水生假丝酵母菌生产耐酸性α-淀 粉酶的方法还未见报道。胡欣洁和陈远钊[5-6]对水生假 丝酵母菌发酵生产耐酸性α-淀粉酶进行了初步研究。该 菌株在固态培养基中发酵产酶能力较强，但在液体培养条 件下产酶能力很低。在发酵生产中，液态发酵比固态发酵 节省生产工序，因此能够减少生产成本。 利用固定化细胞进行液态发酵，能够明显提高菌株的 产酶能力。与游离细胞比较，固定化细胞在发酵生产产物 过程中有几个优点：分离产物相对容易、可被反复利用、减 少污染、操作稳定以及通过增加细胞密度增加反应器内细 胞产物浓度[7]。利用海藻酸钙作为载体固定细胞，有易操 作、无毒性、价格便宜等优点[8]。郭勇[9]利用光交联树脂固 定化枯草芽孢杆菌生产α-淀粉酶，产酶能力达120U/mL； 刘智敏[10]利用聚乙烯醇固定枯草芽孢杆菌生产 α-淀粉 酶，其酶活为157.90U/mL。 本研究对分离到的产耐酸性α-淀粉酶的水生假丝酵 母菌进行海藻酸钙固定化包埋，试图用细胞固定化方法提 高其在液体培养环境中的产酶能力。 1与方法 1.1材料 1.1.1菌种 ASA-UD86：从醋醅中分离纯化出的一株产耐酸性 α-淀粉酶的水生假丝酵母，通过一系列诱变后获得稳定 遗传的高产菌株，由本实验室提供并保存。一般来说，同 一菌种在固体和液体发酵中的产酶水平有所差别[8]。本实 验所使用的ASA-UD86菌株[5-6]在游离细胞液体发酵情况 下，生产酸性α-淀粉酶的能力相当低，而利用固体培养基 培养，酶活达497U/g[6]。 1.1.2培养基 斜面培养基：可溶性淀粉 1%，酵母膏 0.5%，蛋白胨 1%，琼脂2%，pH4，121℃灭菌20min； 种子培养基：可溶性淀粉 1%，酵母膏 0.5%，蛋白胨 1%，pH4，121℃灭菌20min； 增殖培养基：可溶性淀粉1%，酵母膏1%，蛋白胨1%， 海藻酸钙固定水生假丝酵母生产耐酸性α-淀粉酶 周 静1,张宿义2,胡 承1* （1.四川大学生命科学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川 成都 610064； 2.泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646000) 摘 要：介绍了以海藻酸钙为载体，对水生假丝酵母进行包埋固定处理，并利用这种固定化细胞生产酸性α-淀粉酶的方法。实验征 了固定化过程的工艺条件对海藻酸钙固定化水生假丝酵母细胞的结构、机械强度和产酶性能的影响，确定了最优的工艺条件为：在 30℃条件下，将2.8%海藻酸钠、0.6%的菌体的混合液体，通过注射器缓慢注入4%CaCl2溶液中固定4h。这种固定化细胞的产酶能力为 70.24U/mL，比游离细胞高9.45倍。 关 键 词：耐酸性α-淀粉酶；海藻酸钙；固定化小球；固定化；水生假丝酵母 中图分类号：Q814.2 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（2008）11-0034-03 Productionofacid-stableα-amylasebycalciumalginate-immobilizedCandidaaquatica ZHOUJing1,ZHANGSuyi2，HUCheng1* (1.MOEKeyLaboratoryofBio-resourcesandEco-environment,CollegeofLifeScience,SichuanUniversity, Chengdu610064,China;2.LuzhouLaojiaoCo.Ltd.,Luzhou646000,China) Abstract:Candidaaquaticacellswereimmobilizedbyentrapmentinalginategelcapsulesandtheimmobilizedbiocatalystwasusedforthe productionofacid-stableα-amylase.Theresultsindicatedtheeffectsofimmobilizationtechnologyonthestructure,mechanicalstrengthand α-amylaseproductivityofimmobilizedcells.Theoptimalprocessconditionwasshowedasfollows:2.8%(w/v)sodiumalginateand0.6%Candida aquaticacellswereinoculatedinto4.0%(w/v)CaCl2for4himmobilization.Thecapabilityofα-amylaseproductionoftheseimmobilizedcellswere 70.24U/ml,whichwas9.45timeshigherthanthatofthefreelysuspendedcells. Keywords:acid-stableα-amylase;calciumalginate;capsules;immobilization;Candidaaquatica 收稿日期：2007-10-16 作者简介：周静（1983-），女，四川人，在读硕士研究生，主要从事微生物的研究工作；胡承*，通讯作者，副教授，E-mail:5123688@sohu.com。 34· · 中 国 酿 造 2008年 第11期 总第188期研究 pH4，121℃灭菌20min； 发酵培养基：可溶性淀粉3%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%， 磷酸二氢钾0.3%，硫酸铵0.25%，pH4，121℃灭菌20min。 1.2仪器与试剂 721分光光度计；试剂均为纯。 1.3固定化细胞的制作方法 ASA-UD86菌株接种到斜面培养基活化后，转入到 50mL的种子培养基中30℃振荡培养48h，菌液经4000r/min 离心后转入 50mL增殖培养基中振荡培养 24h，菌液 4000r/min离心10min后收集湿菌体，再用生理盐水洗涤 2次，最后溶于生理盐水中制成一定浓度菌悬液。将一定 浓度的菌悬液和一定浓度海藻酸钠溶液混合，用注射器缓 慢匀速地滴入放在磁力搅拌器上的CaCl2溶液中，形成直 径为2mm~3mm的固定化小球。滴完后于30℃固定数小 时，再将小球用无菌水洗涤2~3次，最后放入无菌生理盐 水中于4℃硬化24h。 1.4培养方法 1.4.1游离细胞发酵生产耐酸α-淀粉酶 ASA-UD86接种到斜面培养基上于30℃培养48h，再 接种于装有 50mL种子培养基的 250mL三角瓶中于 30℃、110r/min振荡培养48h，菌液在无菌操作下离心收集 后取湿菌体转入50mL新鲜的增殖培养基中培养24h，离 心收集湿菌体后转入装有50mL发酵培养基的250mL三 角瓶中，于30℃、110r/min振荡培养60h。 1.4.2固定化细胞发酵生产耐酸α-淀粉酶 将固定化细胞凝胶加到装有 50mL增殖培养基的 250mL三角瓶中于30℃、110r/min增殖培养24h，再转入 装有 50mL发酵培养基的 250mL三角瓶中于 30℃、 110r/min振荡发酵60h。 1.5分析方法 1.5.1耐酸性α-淀粉酶活力测定 参照TANAKA方法[12]。 1.5.2固定化小球机械能力测定 取20粒固定化小球放在2个干净的载玻片之间，一 并放在电子天平上，往上面的载玻片上加重物，直到全部 小球都被压碎为止，此时记下重物的质量w（g），求出平均 每个小球所受的压力（10-3N/小球），即为小球的机械能力。 1.5.3菌体浓度测定 发酵液中菌体浓度测定：将发酵液稀释一定的浓度， 用血球计数板计数[13]。 固定化小球内的菌体浓度测定：取5粒固定化小球，溶 解于1mL磷酸缓冲液（0.2mol/L，pH值为7.0）。菌液用血球 计数板计数[13]，稀释倍数为df，数出每mL菌液中的细胞 数N，测出每个小球的平均体积为0.0525mL。固定化小球 的菌体浓度为df×N/0.0525×5（个/mL凝胶）。 2结果与讨论 2.1海藻酸钙固定化条件对固定化细胞的机械强度以及 产酶性能的影响 海藻酸钠浓度、CaCl2浓度、初始菌体包埋量以及固定 化时间都能够影响固定化小球的机械强度和通透性，最终 影响固定化细胞产酶能力。 2.1.1海藻酸钠浓度对海藻酸钙固定化细胞的机械强度以 及产酶性能的影响 表1海藻酸钠的浓度对固定化细胞的机械强度及产α-淀粉酶能力的影响 Table1.Effectofalginatesodiumconcentrationonmechanical strengthofimmobilizedcellsandα-amylaseproductivity 由表1可以看出，当CaCl2浓度为4%，钙化时间为4h 时，海藻酸钠浓度从2.2%增大为3.0%，固定化小球的机 械强度从37.88×10-3（N/小球）增加为136.00×10-3（N/小 球）。但是，海藻酸钠浓度不是越高越好，较高浓度的海藻 酸钠溶液影响固定化小球内细胞的增殖，使细胞数量 减少，进而影响其产酶能力。当海藻酸钠浓度为3.0%时， 固定化小球内细胞浓度降低为0.52×109个/mL，发酵培 养液中细胞浓度降低为2.48×108个/mL；因为细胞浓度 降低，固定化细胞产酶活力也随之降低为21.47U/mL。 随着海藻酸钠浓度增大，固定化小球内的细胞浓度降 低，发酵液的菌体浓度也随之减小，酶活力下降。这可能 是由于海藻酸钠浓度增高，所制得的固定化小球交联度和 机械强度增大，不利于氧气、养分的传输以及菌体细胞的 增殖和扩散，最终导致固定化细胞淀粉酶生产能力降低。 从产酶能力和固定化细胞机械强度以及传质上考虑，使用 2.8%的海藻酸钠固定化细胞较为适合。 2.1.2CaCl2浓度对固定化机械强度以及产酶性能的影响 表2CaCl2的浓度对固定化细胞的机械强度及产α-淀粉酶能力的影响 Table2.EffectofCaCl2concentrationonmechanicalstrengthof immobilizedcellsandα-amylaseproductivity CaCl2浓度/（g·100mL-1） 海藻酸钠浓度/（g·100mL-1） 菌体量（湿重）/（g·100mL-1） 固定化时间/h 小球机械强度/（10-3N·个-1） 固定化小球细胞浓度/（109个细胞·mL-1） 发酵液中细胞浓度/（108个细胞·mL-1） α-amylase酶活/（U·mL-1） 2 2.8 1.0 4 87.48 1.91 9.02 76.43 3 2.8 1.0 4 95.30 1.83 8.93 73.29 4 2.8 1.0 4 107.05 1.77 8.55 70.16 5 2.8 1.0 4 114.50 1.10 7.32 65.75 海藻酸钠浓度/（g·100mL-1） CaCl2浓度/（g·100mL-1） 菌体量（湿重）/（g·100mL-1） 固定化时间/h 小球机械强度/（10-3N·个-1） 固定化小球细胞浓度/（109个·mL-1） 发酵液中细胞浓度/（108个·mL-1） α-amylase酶活/（U·mL-1） 2.2 4 1.0 4 37.88 1.98 9.92 78.21 2.5 4 1.0 4 51.10 1.89 8.90 76.83 2.8 4 1.0 4 105.14 1.65 8.41 69.86 3.0 4 1.0 4 136.00 0.52 2.48 21.47 35· · 2008No.11 SerialNo.188 ChinaBrewing ResearchReport 由表2可以看出，CaCl2浓度是影响固定化小球机械 强度及产酶能力的另一因素。当海藻酸钠浓度不变时， CaCl2浓度从2%增加为5%，固定化小球机械强度增强了 30.89%，但是酶活却下降了25.75%。 从实验中发现，在发酵培养时，发酵液的菌体浓度随 着强化剂CaCl2浓度的增加而减小，酶活下降。这可能是 因为海藻酸钙固定化小球交联增多，致密度和机械强度也 增加，不能为细胞的生存提供较大的空间，也不利于氧气 和养分的传输以及细胞的增殖和扩散。从产酶能力和 固定化小球的机械强度及传质上考虑，强化剂的浓度 选用4%CaCl2。 2.1.3包埋菌体量对海藻酸钙固定化细胞产酶性能的影响 表3菌体包埋量对固定化细胞的机械强度及产α-淀粉酶能力的影响 Table3.Effectofimmobilizedcellscontentonmechanicalstrength ofimmobilizedcellsandα-amylaseproductivity 由表3可以看出，在一定的范围内，海藻酸钠固定化 细胞的产酶能力随着包埋菌体量的增加而增加，包埋的菌 液浓度为0.4%~0.8%时，固定化细胞的产酶能力较好。包 埋菌体量不足，由于菌体难以增殖到足够的浓度，因此产 酶能力不高。包埋菌体量过多，细胞增殖过密，氧气和营 养供应不足，导致固定化细胞产酶能力下降。从产酶能力 看，0.6%的菌体包埋浓度最佳。 2.1.4固定化时间对海藻酸钙固定化细胞产酶能力的影响 表4固定化时间对固定化细胞的机械强度及产α-淀粉酶能力的影响 Table4.Effectoftimeofimmobilizationonmechanicalstrengthof immobilizedcellsandα-amylaseproductivity 由表4可以看出，在一定范围内，固定化细胞的机械 强度随着固定化时间的增长增加，酶活随着细胞浓度增加 而增加。当固定化时间为4h~7h，固定化细胞机械强度增 加不明显，细胞浓度和酶活力变化较小。基于固定化细胞 机械强度与产酶能力考虑，选择固定化时间为4h。 2.2海藻酸钙固定化细胞与游离细胞产酶性能比较 将优化后的固定化细胞与游离细胞分别进行半连续 发酵培养，进行产酶性能比较。由附图A可以看出，在游 离细胞培养过程中，发酵前10h内，细胞增殖很快；发酵到 60h时，细胞浓度达到6.60×108个/mL；在固定化细胞培 养过程中，固定化细胞在24h的增殖培养中细胞增长较 快，在发酵过程中，细胞继续增长，12h后细胞数目减少。 在发酵前期，固定化细胞被包埋，因此在液体培养将中游 离的细胞较少。但是，在发酵过程中，固定化细胞会发生 细胞泄漏，因此导致在发酵过程后期，培养基中的细胞比 游离细胞发酵中细胞明显增多。 从附图B可以看出，在初始接种量均为0.12%（w/v）条 件下，经过 48h发酵，利用固定化细胞发酵产酶能力为 70.24%，比游离细胞培养提高了9.45倍。 固定化细胞发酵液的菌体浓度随着发酵时间增加而 增加，且比游离细胞发酵液菌体浓度高。由于固定化使菌 体细胞集聚，固定化细胞凝胶内菌体浓度远远高于游离细 胞发酵液菌体浓度。这样，通过增大单位体积的菌体量， 固定化细胞培养的产酶能力较游离细胞培养也大大提高。 刘智敏[10]用海藻酸钙固定化芽孢杆菌进行淀粉酶发酵，比 游离细胞发酵产酶能力提高了28%。本实验所用菌株经 海藻酸钙固定化后产酶能力提高更为显著，可能是该菌株 固定化时间/h 海藻酸钠浓度/（g·100mL-1） CaCl2浓度/（g·100mL-1） 菌体量（湿重）/（g·100mL-1） 小球机械强度/（10-3N·个-1） 固定小球内细胞浓度/（109个·mL-1） 发酵液中细胞浓度/（108个·mL-1） α-amylase酶活/（U·mL-1） 2 2.8 4 0.6 28.89 1.97 9.80 74.36 3 2.8 4 0.6 67.88 1.95 9.96 73.44 3.5 2.8 4 0.6 82.85 1.92 9.63 72.13 4 2.8 4 0.6 108.5 1 1.88 8.56 5 2.8 4 0.6 109.2 6 1.84 8.42 6 2.8 4 0.6 109.7 8 1.78 8.34 7 2.8 4 0.6 109.9 5 1.75 8.04 菌体量（湿重）/（g·100mL-1） 海藻酸钠浓度/（g·100mL-1） CaCl2浓度/（g·100mL-1） 固定化时间/h 固定小球内细胞浓度/（109个·mL-1） 发酵液中细胞浓度/（108个·mL-1） α-amylase酶活/（U·mL-1） 0.05 2.8 4 4 0.54 2.03 20.13 0.2 2.8 4 4 1.69 8.62 55.78 0.4 2.8 4 4 1.85 9.24 69.42 0.6 2.8 4 4 1.98 9.78 71.28 0.8 2.8 4 4 1.91 9.70 70.54 1.0 2.8 4 4 1.61 8.05 65.10 (下转第58页) 细 胞 浓 度 /（ 10 9 个 · m L -1 ） 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 12 24 48 60 时间/h 附图 游离细胞发酵（A）与固定化细胞发酵（B）细胞增殖和产酶能力比较 Attachedfigure.Comparisonofcellgrowthandamylaseactivity betweenfreecellcultivationandimmobilized cellcultivation 酶 活 力 /（ U· m L -1 ） 80 70 60 50 40 30 20 10 0 12 24 48 60 时间/h 胶囊内细胞浓度 固定化发酵液 细胞浓度 游离发酵液细胞浓度 A B 游离细胞产生的 淀粉酶活力 固定化细胞产生 的淀粉酶活力 36· · 2008No.11 SerialNo.188 ChinaBrewing ResearchReport (上接第36页) 值处于最佳值，从而为青霉素的合成创造出更好的环境。 仿人智能模糊控制算法具有超调小、振荡小、参数容 易整定、容易推广等一系列优点。但需要指出的是总控制 表要经过严格的实践检验和反复修改，才有满意的控制效 果，否则，将呈现典型的棒棒控制（bandbandcontrol）效 果，系统难以稳定。 采用变速率补料控制时比恒定补料速率时pH值更 接近理想值，使得青霉素发酵过程中的pH值得到了很好 地控制，为青霉素发酵创造了良好的环境，从而更有利于 提高青霉素的产量。 4结束语 青霉素发酵是复杂的生物化学反应过程，具有高度的 非线性、时变性和不确定性。就补料过程而言，随着发酵 的进行，微生物的生长和生物代谢都要求连续不断地补充 营养物质，使微生物沿着优化的生长轨迹生长，以获得高 产的微生物代谢物。一般的发酵工业生产过程是依据实 验室大量的实验结果，从而得出一个近似的补料轨迹线并 用此指导补料过程，但是这种方法指导下的补料控制效果 还要受到其他不确定因素的影响，就目前而言，精确的理 化参数测量、执行机构稳定的工作状态和智能优化算法的 合理使用会使发酵工艺朝着理想的方向发展。仿人智能 模糊控制实现了对青霉素发酵过程中补氨水量的控制，进 而达到了发酵过程的优化控制目的。将仿人智能模糊控 制用于青霉素发酵生产过程中，克服了以往由于人工操作 所带来的控制效率低、精度低的弊端，具有重要的意义。 参考文献： [1]王树青，元英进.生化过程自动化技术[M].北京：化学工业出版社， 1999：5. [2]吴晓苏.基于神经网络的头孢菌素发酵控制系统研究[J].中国酿造， 2007（3）：35-39. [3]王耀南.智能控制系统[M].长沙：湖南大学出版社，1996. [4]徐亲民.生物合成调控的青霉素发酵数学模型与过程优化[J].中国抗 生素杂志，2003（6）：328-333. [5]CUTHRELLJE,BIEGLERLT.Simultaneousoptimizationandsolution methodsforbatchreactorcontrolprofiles[J].ComputChemEng,1989， 13（1）：49-62. [6]薛定宇.控制系统计算机辅助设计[M].北京：清华大学出版社，2006：6. 在游离细胞发酵过程中受产物抑制作用影响较大之故。 利用固定化细胞发酵，产物酶从微囊不断中释放出来，这 样降低了抑制作用的影响，从而大大提高了液体发酵中的 产酶量。 3结论 海藻酸钠浓度、CaCl2浓度、菌体包埋量和固定化时 间，都能够影响固定化水生假丝酵母细胞产酶的能力。其 中海藻酸钠浓度、菌体包埋量这2个因素对固定化细胞发 酵产酶能力的影响较大，CaCl2浓度改变和固定化时间对 该菌株产酶能力的影响较小。 通过对固定化工艺条件的优化，确定了利用海藻酸钠 固定化水生假丝酵母细胞发酵产生耐酸性α-淀粉酶的最 优条件为30℃、2.8%海藻酸钠、0.6%菌体的混合液经注射 器缓慢注入4%CaCl2中固定4h。固定化工艺形成的凝胶小球 直径约2mm~3mm。经过优化后的这种固定化细胞生产耐 酸性α-淀粉酶酶活为70.24U/mL，比游离细胞高9.45倍。 利用固体培养基发酵生产耐酸性α-淀粉酶，先需要 用缓冲液浸取粗酶液，再进行分离纯化，从而增加了生产 工序和成本[11]。本实验利用细胞固定化技术，提高了菌株 在液体培养下的产酶能力，能够在一定程度上减少生产工 序和降低生产成本，这为该菌株通过液体发酵进行工业生 产提供可能性依据。 参考文献： [1]NIGAMP,SINGHD.Enzymesandmicrobialsystemsinvolvedinstarch processing[J].EnzymeMicrobTech,1995，17：770-778. 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