黄曲霉毒素及其分析方法

null黄曲霉毒素及其方法黄曲霉毒素及其分析方法中国疾病预防控制中心营养与食品安全所 杨大进真菌毒素真菌毒素真菌毒素（mycotoxins）是真菌的次级代谢产物，是农产品的主要污染物之一，目前已知的真菌毒素有200多种，其中研究较为深入的有十几种。根据真菌毒素作用的靶器官或真菌毒素引起的病理改变，可将真菌毒素分为肝脏毒、肾脏毒、神经毒、震颤毒等。 真菌毒素对农业及人类健康的危害程度和对社会经济发展影响的重要性真菌毒素对农业及人类健康的危害程度和对社会经济发展影响的重要性对世界上30多个国家和地区进行了调查，结果明，危害程度排在第一位的是黄曲霉毒素（aflatoxins, AF，包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1），其次为赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、桔青霉素(citrinin)、杂色曲霉素(sterigmatocystins，ST)、展青霉素(patulin，Pat)、圆弧偶氮酸 (cyclopiazonic acid, CPA)等。进行这项调查时伏马菌素(fumonisin，FM)还未被发现。 污染对象及其后果污染对象及其后果真菌毒素污染最严重的农产品是玉米、花生和小麦，人类和动物摄入被真菌毒素污染的农产品后可导致急慢性中毒，称为真菌毒素中毒症。 后果后果历史上由真菌毒素导致的中毒事件层出不穷，即使是今天，特别是亚热带发展中国家，真菌毒素仍是某些疾病甚至死亡的主要原因。 真菌毒素对我国农产品的影响真菌毒素对我国农产品的影响我国是一个农业大国，小麦、玉米、大米及花生等是居民的主要食品原料，各类粮油食品均不同程度地被真菌及其毒素污染，几乎所有的真菌毒素在我国农产品中均可检出。我国每年约有2%的（二千五百万公斤）的粮食因受真菌毒素污染而不能食用。真菌毒素对我国农产品的影响真菌毒素对我国农产品的影响真菌毒素污染粮油食品还严重影响我国的对外出口贸易。花生是我国大宗出口农产品之一，年创汇约4亿美元，而欧盟是主要出口市场。但自2000年，欧盟实施国际上最严格的黄曲霉毒素限量和检验要求（AFB1为2g/kg，总黄曲霉毒素为4g/kg）以来，欧盟以我少量花生检出黄曲霉毒素超标时有发生为由，不断加强入境检验，并启动对我国出口花生产地的调查程序，公布调查，多次发布禁令，并于2002年2月对我花生采取特殊严检措施，不仅使我输欧花生严重受限，而且极大影响了欧盟消费者对我花生安全质量的信任，导致我花生出口贸易竞争力急剧下降。仅2000年一年就有四十多个批次的花生被销毁或降低等级。黄曲霉毒素黄曲霉毒素是真菌毒素的重要代表之一，是由黄曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉产生的一组结构类似，对肝脏剧毒，并有致畸、致突变和致癌作用的天然污染物。已发现AF的衍生物有20多种，其中，被国际癌症研究机构列为I级致癌剂的AFB1毒性最大，低剂量长期摄入或大剂量一次暴露均可引发多种动物肝脏发生癌变或急性中毒。 国际上以黄曲霉毒素、苯并毒性作用作为10，000，别的物质与之相比。 黄曲霉毒素黄曲霉毒素原发性肝细胞癌在美国及西欧一些国家非常罕见，却是非洲及东南亚地区常见的恶性肿瘤。在我国，原发性肝细胞癌年发病人数为110200人，占世界总病例数的45%。其地理分布资料显示，高发区位于江苏、浙江、福建、广东及广西等气候条件适于黄曲霉生长繁殖、具有亚热带气候特点的东南沿海岸线。 黄曲霉毒素黄曲霉毒素迄今为止，该病的病因尚未明了， 其发病与多种因素有关，其中膳食暴露AFB1作为一重要的危险因子已引起世界的广泛注意。来自中国、肯尼亚、莫桑比克、瑞典、泰国及菲律宾的研究结果表明，膳食低剂量长期暴露AFB1与人类原发性肝细胞癌呈正的剂量反应关系。与城区相比，该病的发生在以谷物为膳食主要来源的农村更为常见，且有年轻化的趋势，严重威胁居民的身体健康。 黄曲霉毒素黄曲霉毒素结构类似的一组化合物，均为二呋喃香豆素（difuranocoumarin）的衍生物。虽然AF的衍生物有20多种，目前已分离鉴定出的AF包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFP1、AFQ、AFH1、AFGM、AFB2a和毒醇等12种，但天然污染粮油食品的AF是B组和G组两大类，即AFB1、AFB2 、AFG1和AFG2。 黄曲霉毒素黄曲霉毒素奶牛摄食被AFB1和AFB2污染的饲料后，在牛奶和尿中可检出其羟基化代谢产物AFM1和AFM2。AFM1除了随乳汁排出外，还有部分存留在肌肉中。饲料中的AFB1约有1-6%在奶牛体内转化成AFM1出现在牛奶中。 黄曲霉毒素黄曲霉毒素AFB1难溶于水，易溶于甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性及酸性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在pH 9-10的强碱溶液中分解迅速，但此反应可逆，即在酸性条件下又能恢复原来结构。 黄曲霉毒素黄曲霉毒素AFB1对热非常稳定, 268-269℃方可破坏, 故一般烹调温度不破坏其毒性。某些化学试剂如5%次氯酸钠和丙酮可使AFB1完全分解，因此在实验室中用此方法对接触过AFB1的器皿作解毒处理。但在紫外线照射可使之分解。 黄曲霉毒素黄曲霉毒素AFB1和AFB2在紫外光下可产生蓝紫色荧光, AFG1和AFG2则产生黄绿色荧光，该特性是检测粮油食品中黄曲霉毒素的重要依据。 黄曲霉毒素黄曲霉毒素AF分子中的二呋喃环是产生毒性的重要结构基础，而香豆素可能与致癌作用有关，AF的毒性、致突变及致癌作用由强到弱的顺序依次为AFB1 AFG1AFM1AFB2AFG2。 黄曲霉毒素黄曲霉毒素黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素黄曲霉毒素黄曲霉毒素B2黄曲霉毒素黄曲霉毒素黄曲霉毒素G1黄曲霉毒素黄曲霉毒素黄曲霉毒素G2黄曲霉的生长黄曲霉的生长自然条件下，黄曲霉生长繁殖及产生AF所需要的温度范围为12℃~42℃，最适温度为25℃~32℃，最低相对湿度为80%左右。该数值相当于小麦、玉米和高粱中水分含量为18.0%~18.5%、稻谷为16.5%、大米为17.5%、大豆为17%~18%、花生及其他树果为9%~10%。 黄曲霉的生长黄曲霉的生长黄曲霉生长所需的条件决定了该菌是全世界分布最广的菌种之一，在我国各省均有分布。而寄生曲霉从美国夏威夷、阿根廷、巴西、荷兰、印度、印度尼西亚、日本、约旦、波兰、期里兰卡、土耳其、乌干达等国的农作物中分离出。 黄曲霉的生长黄曲霉的生长我国广西、江苏、江西、湖北、黑龙江、山东、安徽、湖南、陕西、吉林、辽宁、河南、河北、四川、浙江和甘肃共17个省粮食中分离到的黄曲霉菌株的产毒性能进行了研究，结果表明，除甘肃省外，其他16个省均分离出产AFB1菌株，分布情况是，华中、华南和华东地区产毒菌株多，产毒量也高，产毒在10 mg/kg 以上的强毒株占10%以上。东北和西北地区产毒株较少，产毒量也低，可能与当地寒冷的气候条件有关。 黄曲霉的生长黄曲霉的生长在实验的1660株黄曲霉中，来自广西的145中有86株（59.3%）产毒，其中23（15.9%）株为强毒株,产毒量最高者达400 mg/kg，从产毒菌株数和产毒量上均为全国之最。该研究结果与17省区粮油食品中AFB1的污染水平和原发性肝癌的发病率呈正相关关系。Gabal等报道，产毒的黄曲霉中有40％的菌株可同时产生AFB1、、AFB2、AFG1和AFG2。 黄曲霉的毒性黄曲霉的毒性许多学者证明黄曲霉毒素不但引发动物急性中毒症，而且长期少量膳食暴露可引起实验动物的癌症。这一结果的发现极大地推动了对食品中常见真菌代谢产物的研究，并在食品毒物学方面开辟了新领域。 黄曲霉的急性毒性黄曲霉的急性毒性各种动物对AFB1的敏感性依动物的种类、年龄、性别、营养状况等不同而异。动物的AF中毒主要表现为食欲不振、体重下降、生长迟缓、繁殖能力降低、产蛋及产奶量减少等。中毒病变主要在肝脏，表现为肝细胞变性、坏死、出血、胆管增生等。急性中毒后期，动物出现体温升高、血性腹泻、心脏出现出血瘀点和淤斑、胆囊壁增厚、门脉周围纤维化、肝淋巴结节形成及空泡形成、胆管增生等。此外动物抵抗力降低，对细菌、病毒及寄生虫疾病更敏感。 黄曲霉的生殖毒性黄曲霉的生殖毒性 Ankrah等(1993)每日经饲料给妊娠小鼠0.8 ng/kg bw的AFB1和4.8ng/kg bw的AFG1或同时给与AFB1和AFG1 , 出生后的仔鼠继续给相同剂量的毒素直至6月龄。AFG1实验组动物肝脏中性脂肪显著蓄积, 血清甘油三酯稍稍升高, 肝和肾出现严重炎症、坏死和胆管增生；而AFB1可引起肝脏中性脂肪和脂肪酸蓄积，显示AFB1对肝和肾细胞的毒性作用。虽然AFG1的水平是AFB1的6倍，试验结果显示AFB1对肝肾的毒性作用比AFG1严重得多。 黄曲霉的遗传毒性黄曲霉的遗传毒性 Marquez-Marquez（1993）通过检测周围血中的微核和姊妹染色体交换两项指标对经氨处理的AFB1的基因毒性进行。实验中分别给大鼠和小鼠一次剂量为0.01µg/kg bw至1.0µg/kg bw的AFB1，结果显示, 给予0.1µg/kg bw以上水平AFB1 的大鼠，骨髓染色体畸变率和微核率明显升高，而小鼠仅最高剂量组(1.0µg/kg bw)染色体畸变率稍有升高。在AFB1最高剂量组中，大鼠染色体畸变率比小鼠高10倍，说明大鼠对AFB1明显比小鼠敏感。 黄曲霉的致癌性黄曲霉的致癌性 由于黄曲霉毒素具有基因毒性，可使基因发生突变，由此导致动物细胞发生畸变、诱变及癌变，AF是目前已知的最强的致癌物。大量研究表明，长期低剂量或短期摄入较大剂量的AF均可诱发大鼠、小鼠、豚鼠、雪貂、鸭雏、狗、猫、兔、猴等动物原发性肝癌，其中以大鼠和鳟鱼最敏感。 黄曲霉的致癌性黄曲霉的致癌性 动物实验已证明AFB1可诱发多数动物发生原发性肝癌。大量的流行病学调查表明，AFB1暴露量与肝癌发病的增加有相关性。 在肝癌发病率高的地区如非洲、东南亚及中国南方某些地区，当地食品严重污染AFB1。AFB1在人和实验动物体内被代谢成一种环氧化物，这种环氧化物被认为是最终反应的中间体。有一些证据表明对人的实际危险性比实验动物低，JECFA通过流行病学调查发现并, AFB1只有在其他因素（例如乙型肝炎病毒感染）存在的情况下才能造成危害。目前正在连续进行的研究可以进一步提高评估摄入AFB1对人类造成危害的可靠性，最值得注意的是上海、泰国和启东的研究以及冈比亚、台湾和启东进行的乙型肝炎疫苗的试验，这些研究项目完成后，委员会可能要对AFB1对人类的危害重新评价。 null黄曲霉的致癌性黄曲霉的致癌性 有一些因素影响原发性肝癌的危险性, 其中最明显的是经确定血清中含有乙肝病毒表面抗原的携带乙肝病毒者，在同时患有乙型肝炎病人,AF的作用明显增强。这种相互作用的现象，使流行病学研究很难把AF看作是单一的主要的危险因素。 对农作物的污染对农作物的污染 AF对农作物的污染以花生及其制品（如花生油、花生酱）、玉米、大米和棉籽为重。除此之外，坚果类如核桃、杏仁、椰肉、奶及奶制品、动物肝脏、干咸鱼及辣椒等也不同程度地受到黄曲霉毒素的污染。 黄曲霉毒素的分析—微柱法黄曲霉毒素的分析—微柱法萃取液经过氟罗里硅土微柱，用三氯甲烷—丙酮（9：1）洗脱，被吸附的黄曲霉毒素在紫外灯下有蓝紫色的荧光。 与标准柱对照进行半定量分析。黄曲霉毒素的分析—薄层色谱法黄曲霉毒素的分析—薄层色谱法多年来广泛用于黄曲霉毒素的分析。 半定量分析。黄曲霉毒素的分析—液相色谱法黄曲霉毒素的分析—液相色谱法近年来广泛用于黄曲霉毒素的分析，常用的反相色谱柱均可使用。如Shim—Pak，hypersil, Radialpak, Bondapak,TSK_GEL ODA 80TS等。 提取提取乙腈—水或甲醇－水，比例为84—85+15—16 即可。 提取方法提取方法样品与提取溶剂一同搅拌，超声提取或样品粉碎后振荡提取均可。 提取方法和时间要根据具体情况定，不能一概而论。 霉菌毒素的提取效果与粒径大小密切相关，粒径越小效果越好。 净化净化硅胶 C18 氟罗里硅土 氧化铝 免疫亲和柱 多功能净化柱 透析衍生化衍生化TFA柱前衍生是目前使用最广泛的方法。 碘、溴柱后衍生电化学柱后衍生化法相对柱前衍生化法更简单可靠，但需要专门的设备。 null检测器检测器荧光检测器通常被用于分析，激发波长Ex364-375nm，荧光波长Em418-455nm。注意事项注意事项方法中使用的乙腈其蒸气具有一定的刺激性，如不能在通风条件良好的环境中操作可能会引起一定程度的上呼吸道症状，长期接触不排除引起降低白血球水平和肾脏损伤。 注意事项注意事项使用的三氟乙酸具有一定的腐蚀性。实验过程中注意带上防护手套，避免皮肤与试剂接触。 注意事项注意事项实验应在通风橱中完成操作，当毒物处于干燥状态时因为静电作用会导致其分散在空气中，所以应进行必要的防护。 注意事项注意事项如果黄曲霉毒素不小心溅出，可用次氯酸钠漂白剂处理。 对接触过黄曲霉毒素的所有玻璃器皿用1％次氯酸钠和丙酮清洗。 注意事项注意事项操作时应戴一次性手套，使用完毕后应丢弃接触过可能含有毒物的手套。如果手被污染了，应先用未稀释漂白剂洗再用肥皂清洗。 在处理粉末状物质和干燥粉末状标准时应戴防毒面具。 方法说明方法说明如果购买的标准溶液中含有苯需要先将其吹干，再用乙腈定容。 加标实验一定注意将加入的标准全部吹干并被提取溶剂所提取。 方法说明方法说明从离心或过滤后的提取液中吸取上清液至净化柱的玻璃管内，将净化柱的填料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管，净化液就被收集到净化柱的收集池中（注意：手不可接触净化柱的收集池内壁）。 方法说明方法说明从净化柱的收集池内转移2mL净化液到衍生瓶中，在60℃水浴下氮气吹干，注意不要使液体鼓泡、飞溅。 方法说明方法说明加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸，混匀30sec后，在40℃±1℃干燥箱中衍生15min。室温下蒸发后以200μL水—乙腈（85+15）溶解，混匀30sec，高速离心后，取上清液至带内衬管的自动进样样品瓶中，供液相色谱仪测定用。 null黄曲霉毒素操作流程图 移取标准工作液2.00mL 具塞三角瓶（250mL） 称取样品（豆奶粉）20.0g 加80mL乙腈—水（82+16） 在振荡器上振荡、提取30min 提取 定性滤纸过滤（于25mL比色管），收集滤液。 移取约8mL提取液至多功能净化柱的玻璃管内 null 净化 将多功能净化柱的填料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管， 净化液收集到多功能净化柱的收集池中 （注意：手不可接触多功能净化柱的收集池内壁）。 移取标准工作液10μL、20μL、 移取上净化液2mL 40μL 、80μL、 100μL、 200μL 分别至4mL衍生瓶 4mL衍生瓶 衍生null 60℃水浴下氮气吹干 （注意不要使液体鼓泡、飞溅，造成损失） 取下，加入正己烷200μL，三氟乙酸100μL 混匀器上混匀1min 40℃±1℃恒温培养箱中衍生15min 取出， 氮吹仪吹干 加入乙腈—水（15+85）溶液150μL溶解，混匀1min，离心 取出上清液至自动进样的样品瓶（内带插瓶） 测定 上机分析质量控制环节质量控制环节 衍生化最好避光。 标准曲线的相关系数r大于0.995。 需要对空白样品进行加标实验，如果有阳性样品最好。 每检测10个样品均要进行一次加标回收和检测一个重复样品。在试验开始和结束时都应检测标准，以此来检察标准曲线。每一批样品均要检测一个空白。 质量控制环节质量控制环节 分析条件可以根据各单位实际情况加以调整。 关键控制关键控制 衍生化前必须彻底干燥。 加标过程，固相萃取后取样液的体积必须准确。