四种常用的人中性粒细胞分离方法的比较

第 28卷第4期 2008年 8月 国际病理科学与临床杂志 International Journal of Pathology and Clinical Medicine V01．28 No．4 Aug． 2008 四种常用的人中性粒细胞分离方法的比较 李金凤 ，刘文礼，史小娟，刘伟，汉建忠，万静，罗自强 (中南大学湘雅医学院生理学教研室，长沙410078) · 论 著 · [摘要] 目的：比较 Percoll非连续密度梯度离心法、Ficoll—Hypaque密度梯度离心法、裂解红细胞法和 Dextran 作用下红细胞自然沉降法四种常用的人中性粒细胞分离方法。方法：取健康人外周静脉血，分别采用以上四种方 法进行中性粒细胞分离，对其细胞纯度、回收率、存活率进行 比较。结果：Percoll非连续密度梯度离心法与 Ficoll- Hypaque密度梯度离心法分离得到的细胞纯度均大于90％，两者间比较无统计学差异(P>0．05)；裂解红细胞法和 Dextran作用下红细胞 自然沉降法分离得到的细胞纯度略低于 Percoll非连续密度梯度 离心法(P<0．01)与 Ficoll— Hypaque密度梯度离心法(P<0．05)。Dextran作用下红细胞 自然沉降法的回收率低于 Percoll非连续密度梯度 离 心法(P<0．01)、Ficoll—Hypaque密度梯度离心法(P<0．01)和裂解红细胞法(P<0．05)；Percoll非连续密度梯度 离 心法回收的中性粒细胞存活率明显高于 Ficoll—Hypaque密度梯度 离心法(P<0．05)，裂解红细胞法(P<0．01)和 Dextran作用下红细胞 自然沉降法(P<0．01)。结论：Percoll非连续密度梯度离心法分离中性粒细胞，纯化程度好， 回收率高，是一种简单、高效的中性粒细胞分离方法，适于临床和科研 中广泛应用。 [关键词] 中性粒细胞； Percoll非连续密度梯度 离心法； Ficoll—Hypaque密度梯度 离心法； 裂解红细胞 法： Dextran红细胞 沉降法 [中图分类号] R331．1 [文献标识码] A [文章编号] 1673—2588(2008)04-0277-05 Comparison of 4 popular methods for neutrophil isolation from human peripheral blood LI Jin-feng，LIU Wen—li，SHI Xiao-juan，LIU wei，HAN Jian—zhong，WAN Jing，LUO Zi—qiang (Department ofPhysiology，Xiangya School ofMedicine，Central South University，Changsha 410078，China) [Abstract] Objective Percoll density gradient centrifugation，Ficoll—Hypaque density gradien centrifugation，red blood cells cracking and natural erythrocyte sedimentation method with Dextran， which are 4 frequently used methods for neutrophil separation from human peripheral blood，were corn— pared．Methods Respectively using the 4 methods to separate neutrophil from same healthy human pe— ripheral blood，the purity，recovery rate，and cell survival rate were compared．Results Among the 4 separation methods，the neutrophil purity from Percoll density gradient centrifugation and Ficoll—Hypaque density gradient centrifugation were more than 90％ ，but there was no significant difference between them (P>0．05)；the cell purity from red blood cells cracking and the natural erythroeyte sedimentation meth— od with Dextran was lower than the Percoll density gradient centrifugation(P<0．01)，Ficoll—Hypaque density gradient centrifugation(P<0．05)；the neutrophil recovery rate from Percoll density gradient cen— trifugation，Ficoll—Hypaque density gradient centrifugation and red blood cells cracking were significantly higher than that from the natura1 erythrocyte sedimentation method with Dextran(P<0．01，P<0．01，and 收稿 日期：2008-04一l5 修回日期：2008-05-29 作者简介：李金凤 (1978一)，女，河南商丘人，硕士，主要从事急性肺损伤的机制研究。 通讯作者：罗自强，E—mail：luozq1962@163．com 基金项目：国家自然科学基金(30400190，30670770)；湖南省重点学科建设资助项 目 This work was suppoded by the Nafiohal Science Foun． dation of China(30400190，30670770)and the Construct Program of the Key Discipline in Hunan Province． 277 维普资讯 http://www.cqvip.com 第4期 国际病理科学与l临床杂志 第 28卷 P<0．05，respectively)；Cell survival rate from Percoll density gradient centrifugation was significantly higher than Ficoll—Hypaque density gradient centrifugation(P<0．05)，red blood cells cracking (P<0．01)，and the natural erythrocyte sedimentation method with Dextran(P<0．01)．Conclusion Percoll density gradient centrifugation provides the most simple and efficient approach for isolation of hu- man blood neutrophil with the high purity and viability，which is suitable to utilize in the clinical work an d scientific research． [Key words] neutrophil； Percoll； Ficoll—Hypaque； cells cracking； Dextran [Int J Pathol Clin Med，2008，28(4)：0277-05] 中性粒细胞(neutrophil)在机体非特异性免疫 防御反应中起着十分重要 的作用，是机体抵御微 生物病原体，特别是化脓性细菌入侵的重要吞噬 细胞。外周血白细胞以中性粒细胞为主，正常情 况下 中性粒细胞 占人外周血 白细胞 的 50％ ～ 70％。急性感染或 炎症 、广泛 的组织损伤或坏 死、急性溶血和失血、急性中毒 以及恶性肿瘤等 情况时，外周血中性粒细胞 的数量增高⋯。随着 对全身炎症反应综合征 (systemic inflammatory re— sponse syndrome，SIRS)研究 的不断深入 ，对中 性粒细胞在炎症过程中的作用又有 了新的认识 ， 对其数量、功能及在组织 中的转归进行研究成为 临床和科研的重要内容。从血液中分离中性粒细 胞是在细胞水平研究其生物学特性及功能的第 一 步。 目前国内外已经报道多种分离人和动物中性 粒细胞的方法，其中 Percoll非连续密度梯度离心 法、Ficoll-Hypaque密度梯度离心法 、Dextran作用 下红细胞 自然沉降法和裂解红细胞法是最常应用 的中性粒细胞分离方法。但目前尚未见到同时比 较这四种方法分离效果的报道。本文通过采用四 种不同方法对同一血样的中性粒细胞进行分离，比 较各方法收获细胞的纯度、回收率、存活率，旨在寻 找一种简单、高效的中性粒细胞的分离方法。 1 材料与方法 1．1 材料 人中性粒细胞分离液和淋巴细胞分 离液购 自天津灏洋生物制品科技有限责任公司， Percoll原液和 Dextran T-500购 自Pharmacia公司， 红细胞裂解液购 自BD公司，小牛血清(BSA)购 自 278 北京鼎国生物技术有限公司，PBS磷酸盐缓冲液 (0．15 moL／L，pH 7．4)。人外周肘静脉血液由健康 成年志愿者提供。 1．2 方 法 1．2．1 Percoll非连续密度密度梯度 离心法 刮 中性粒细胞分离液的配制 J：将 Percoll原液与 8．77 g／L的氯化钠溶液以9：1(v／V)的比例混合，定 为 100％ 的Percoll，再用灭菌生理盐水配制 60％及 75％的Percol1分离液(V／V)，其中60％ Percoll密度 为 1．079，75％Percoll密度为 1．090。 操作方法：取 EDTA抗凝血2 mL，1 500 r／min 水平离心 15 min。先吸取上层血浆，离心获得无血 小板血浆(PPP)用以重悬粗提的白细胞。再吸取富 含白细胞的“云雾细胞层”，用 PBS液 2 mL稀释。 在另一离心管中，依次加入2 mL的75％与2 mL的 60％ Percoll液和 1 mL的PPP重悬液，将稀释的细 胞小心缓慢地加于此离心管中，注意保持液体界面 的完整性，2 000 r／min离心 20 min。吸取 60％与 75％ Percoll液的界面层中中性粒细胞，用 PBS充分 洗脱 Percoll胶粒。然后加入含有 10％小牛血清的 RPMI 1640 200 L待用。 1．2．2 Ficoll—Hypaque密度梯度 离心法 ED— TA抗凝全血 2 mL，以 PBS液作 1：1稀释后，按 1：1 的体积比轻轻叠加在中性粒细胞分离液上，使两者 形成一个清晰的界面，2 000 r／min水平离心 2O min，离心管中由上至下细胞分 4层 ：第 1层是稀释 的血浆，第2层是环状乳白色的单个核细胞层(包括 单核细胞和淋巴细胞)，第 3层是分离液与中性粒细 胞混合层，第4层是红细胞层。用毛细吸管吸取第2 层和第 3层细胞至另一试管内，加入足量的 PBS，充 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 李金风 ．等 ：四种常用的人中性粒细胞分离方法的比较 第 28卷 分混匀，1 000 r／rain离心 10 min。吸去上清液，用含 1％BSA的 PBS液重新混悬沉淀的细胞，将得到的细 胞悬液置于比重为 1．077 g／mL的淋巴细胞分离液 上，2 000 r／rain离心20 rain，沉于离心管底的即为中 性粒细胞，沉淀经 PBS溶液反复洗两次，加入含有 10％小牛血清的 RPMI】640 200／xL待用。 1．2．3 裂解红细胞法分离中性粒细胞。。 取 EDTA抗凝血2 m【 ，于无菌条件下加入 I：3(V／V)的 红细胞裂解液，混匀后摩温静置 15 rain。1 000 r／ rain水平离心 5 rain。吸去 } 清，重复裂解红细胞 1次，留管底 白细胞，加入含 l％BSA的 PBS液 2 mL，充分混匀后加于预置4 mL 60％ 的 Percoll离心 管的液面上，2 000 r／rain离心 20 min。留管底中性 粒细胞，用含有 1％BSA的 PBS洗 2次，将所获中性 粒细胞稀释至200 txL后待用。 1．2．4 Dextran作用下红细胞 自然沉降法 取 EDTA抗凝血 2 mL，加入 400 IxL的 60 g／L Dex— tran，在 37 cc水浴中静置 45 rain，使红细胞沉淀。 将上层白细胞加于预置的4 mL 60％Percoll的试 管中(保持界面清晰)，2 000 r／rain水平离心 20 min，底层为中性粒细胞和少量红细胞。弃去上 清，加入红细胞裂解液 3 mL充分混匀后室温静置 15 min，再加入 PBS 5 mL混匀，1 000 r／min离心 5 min，用含有 1％ BSA的 PBS洗 2次，将所获中性粒 细胞稀释至200 ILL后待用。 1．2．5 中性粒细胞的纯度、回收率和存活率的测 定 引 从分离得到的中性粒细胞混悬液中取出 50 L，用咀细胞计数板于显微镜下计 数分离后中性 粒细胞数；并推片后进行瑞一吉染色，显微镜下计数 1O0个细胞，计算分离得到的中性粒细胞的纯度；再 取 10 L中性粒细胞悬液进行台盼蓝染色后镜下观 察，根据正常细胞胞体完整，透明不着色，死细胞着 蓝色的原理随机计数 200个细胞后，计算出细胞存 活率。中性粒细胞回收率根据公式计算：中性粒细 胞回收率 =(分离后细胞数／分离前细胞数)× 100％。其中，分离之前中性粒细胞总数在静脉采血 之后进行血常规检查得到。 279 1．3 统计学处理 实验结果以均数 4-标准差 ( ±S)示，采用 SPSS 13．0 for windows统计软件，组 间比较采用方差分析，P<0．05为差异有统计学意义。 2 结 果 2．1 四种方法分离得到的中性粒细胞纯度的比较 分离得到的中性粒细胞经过瑞一吉染色后显 微镜下可见 ，分离纯化的中性粒细胞形态较好， 细胞核多为两叶或j叶，少数为杆状核或四、五 叶核，经过染色后呈紫红色 ，镜下未见到红细胞， 可以看到散在的少数的淋巴细胞(图 1)。细胞计 数统计后发现，Percoll非连续密度梯度离心法与 Ficoll—Hypaque密度梯度离心法分离得到的细胞纯 度均 大 于 90％，两 者 间 比 较 无 统 计 学 差 异 (P>0．05)。裂解红细胞法和 Dextran作用下红细 胞自然沉降法所得细胞纯度略低于 Pereoll非连续 密度梯度离心法(P<0．01)和 Ficoll—Hypaque密度 梯度离心法(P<0．05)(表 1)。此外，Percoll非连续 密度梯度离心法在分离中性粒细胞的过程中可以同 时得到纯度较高的淋巴细胞(图2)。 2．2 四种方法分 离纯化的 中性粒细胞回收率的比 较 Percoll非连续密度梯度离心法与 Fieoll— Hypaque密度梯度离心法分离得到的细胞回收率均 大于90％，两者问比较无统计学意义(P>0．05)。 四种分离方法中，Dextran作用下红细胞自然沉降法 所得的细胞的回收率最低，均低于 Percoll非连续密 度梯度离心法(P<0．O1)、Ficoll—Hypaque密度梯度 离心法(P<0．01)和裂解红细胞法(P<0．05)，裂解 红细胞法的回收率低于 Pereoll非连续密度梯度离 心法(P<0．05)(表 1)。 2．3 四种方法分离所得中性粒细胞存活率的比较 四种分离方法所得中性粒细胞存活率均大于 90％，其中Percoll非连续密度梯度离心法分离纯化 所得的中性粒细胞活性最高，明显高于裂解红细胞 法(P<0．01)、Dextran作用下红细胞 自然沉降法 (P<0．01)和 Fieoll—Hypaque密 度 梯 度 离 心 法 (P<0．05)(表 1)。 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 国际病理科学与临床杂志 第 28卷 表1 4种分离方法分离中性粒细胞回收率、细胞活性、纯度的比较f ± ，n=3) Tab·1 Comparison of the purity。recovery rate。and cell survival rate of neutrophils of4 kind of separation methods( ± ，，l=3) 与Percoll法比较，}P