口蹄疫病毒 VPg2基因克隆表达及VPg2-ELISA检测抗体评价

中国农业科学 2005,38(11):2344-2348 Scientia Agricultura Sinica 收稿日期: 2005-01-10 基金项目：科技部口蹄疫防治科技攻关资助项目（2004BA519A-40）资助 作者简介：田克恭（1964-），男，山西万荣人，研究员，博士，主要从事动物疫病诊断与检测工作，Tel：010-62891257；Fax：010-62893507；E-mail: tiankg@263.net。王宏伟为通讯作者，Tel：010-62891257；Fax：010-62893507；E-mail:wanghongwei@nvdc.cn 口蹄疫病毒 VPg2基因克隆表达及 VPg2-ELISA检测抗体 田克恭 1，王宏伟 1，孙 明 1，王传彬 1，陈西钊 1，遇秀玲 1，曹 振 1，金 萍 1，许燕辉 2，赵心力 2 （1农业部兽医诊断中心，北京 100094；2内蒙古自治区兽医工作站，呼和浩特 010010） 摘要：成功亚克隆了口蹄疫病毒（FMDV）太保毒株 3ABC中 VPg2基因，并将其插入 pGEX-4T-1表达载体构建 重组表达质粒，Western blotting 分析表明，表达的 VPg2 蛋白与 FMDV 阳性血清发生反应。以 VPg2 表达蛋白为 抗原建立间接 ELISA方法，对背景清楚的试验牛血清进行检测，结果 VPg2表达蛋白与空白对照组（C组）和灭活 疫苗反复免疫组（CI 组）牛血清均不发生反应，与未免疫直接攻毒组（D 组）和免疫后攻毒组（I 组）血清均发 生反应；对 D组和 I组，VPg2表达蛋白抗体持续时间最长，可达 90d，最早呈阳性反应时间为攻毒后第 10天。VPg2 表达蛋白抗体持续时间与先前测定的 3ABC表达蛋白抗体几乎相同。用 VPg2-ELISA方法检测 2 170份进口阴性牛 血清，12份出现假阳性，假阳性率为 0.55%，而用 3ABC-ELISA方法检测，48份出现假阳性，假阳性率为 2.21%。 关键词：口蹄疫病毒；非结构蛋白；VPg2-ELISA方法评价 Cloning and Expression of VPg2 Gene Fragment of Foot-and-Mouth Disease Virus and the Evaluation of VPg2-ELISA for Antibody Detection TIAN Ke-gong1，WANG Hong-wei1，SUN Ming1，WANG Chuan-bin1，CHEN Xi-zhao1，YU Xiu-ling1， CAO Zhen1，JIN Ping1，XU Yan-hui2，ZHAO Xin-li2 （1National Veterinary Diagnostic Center, Beijing 100094；2Veterinary Service of Inner Mongolia, Huhhot 010010） Abstract: VPg2 gene fragment was successfully subcloned from 3ABC gene of the foot-and-mouth disease virus（FMDV） TaiBao strain and constructed VPg2 expressing plasmid by inserting the target gene fragment into pGEX-4T-1 vector. The expressed protein was analysed by Western blotting. The result showed strong reaction with FMDV positive serum. VPg2 protein ELISA was evaluated through testing sera of 4 cattle groups i.e. control group, vaccinated group, infected group and infected after vaccination group. Negative results were obtained for the control group and the vaccinated group. On the contrary, positive results were obtained for the infected group and part of the infected after vaccination group. In the infected group and infected after vaccination group, the duration of the antibody against VPg2 lasted for at least 90 days. The earliest detecting time of VPg2 antibody was 10th day after infection. The duration of the antibody against VPg2 was the same with the antibody against 3ABC tested previously. 2170 negative sera were tested using indirect VPg2-ELISA and 3ABC-ELISA. The results showed that the false positive rates were 0.55% in VPg2 ELISA assay and were 2.21% in 3ABC–ELISA assay. Key words: Foot-and-mouth disease virus; Non-structural protein; Evalulation of VPg2-ELISA 口蹄疫是国内外最受关注的动物传染病之一。灭 活疫苗免疫接种是预防和控制口蹄疫的主要措施之 一。但目前商品化的灭活疫苗都是用完整病毒加工制 备的，不仅存在安全隐患，而且无法鉴别免疫动物与 隐性感染动物，从而影响了传统疫苗的普遍应用和国 际贸易。 1994年以来，世界上先后有 7个国家的实验室开 展了区分口蹄疫免疫动物和感染动物的研究工作。在 11期 田克恭等：口蹄疫病毒 VPg2基因克隆表达及 VPg2-ELISA检测抗体评价 2345 口蹄疫病毒感染动物的过程中，除产生针对结构蛋白 的抗体外，还产生相当数量的非结构蛋白抗体，商品 化的灭活疫苗主要含有口蹄疫病毒结构蛋白，非结构 蛋白含量很少。因此，未感染口蹄疫病毒的免疫动物 不应有非结构蛋白抗体。据此，可将检出非结构蛋白 抗体作为动物曾经感染过口蹄疫病毒的标志。十多年 来研究人员以口蹄疫病毒非结构蛋白 3ABC、3AB、 3A、3C、2BC、2B、2C、L等为抗原，建立了多种检 测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的 ELISA方法，其中较 理想的是以 3ABC为抗原的抗体检测方法[1~5]。 但是，3ABC 抗原针对国内所有口蹄疫灭活疫苗 是否会产生非特异性反应？分段克隆表达的 3ABC基 因是否敏感性更高、特异性更强？为此，笔者在成功 克隆表达口蹄疫病毒 3ABC 基因的基础上[6]，进一步 克隆了口蹄疫病毒 3B基因的 VPg2基因片段，以其表 达蛋白为抗原建立了 ELISA方法，并用试验牛血清和 进口阴性牛血清进行了评价。 1 材料与方法 1.1 病毒重组质粒和血清 用pGEM-T-Easy载体克隆的3ABC重组质粒由本 中心提供，其基因序列见参考文献[6]。FMDV 阳性牛 血清由中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠。 空白对照牛血清（C 组）、灭活疫苗反复免疫牛 血清（CI组）、未免疫直接攻毒牛血清（D组）和免 疫后攻毒牛血清（I 组）由农业部兽医诊断中心和内 蒙古自治区兽医工作站制备[5]。 阴性牛血清：来自美国、加拿大、澳大利亚等无 FMD国家的进口牛血清 2 170份，由北京出入境检验 检疫局和珠海出入境检验检疫局提供。 1.2 载体和菌株 pGEM-T-Easy载体，购自 Promega公司。pGEX- 4T-1 表达载体购自 Amersham Pharmacia Biotech 公 司。E.coli BL21由厦门大学肿瘤与细胞工程实验室惠 赠。 1.3 主要试剂 Taq DNA聚合酶，dNTP，购自 Promega公司。 辣根过氧化酶标记羊抗牛 IgG 购自 Sigma 公司。胶 回收试剂盒购自华舜公司。 1.4 目的基因克隆 1.4.1 引物设计 VPg2 基因 5′端加入 Bgl Ⅱ 和 ATG，3′端引物加入终止密码子 TAA和 Sal I位点。 上游引物： 5′-AGA TCT ATG GGA CCC TAC GCT GG-3′ 下游引物： 5′-GTC GAC TTA TTC CTT CAC GAC CGG GG-3′ 1.4.2 PCR扩增 ddH2O 8µl，dNTP（2.5mmol·L-1） 2µl，MgCl2 (15 mmol·L-1) 2µl，目的基因上、下游引物 混合引物（8pmol·µl-1）2µl，10×PCR Buffer 2µl，Taq DNA聚合酶(0.5U·µl-1) 2µl，3ABC重组克隆质粒 2µl。 混匀后进行 PCR扩增，反应程序：96℃ 30s，50℃ 30s， 72℃ 60s，35个循环，72℃ 5min。 1.4.3 PCR 扩增产物电泳、克隆 PCR 扩增产物进 行琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用华舜公司回收试剂盒回 收 PCR产物，克隆到 pGEX-T-Easy载体中，PCR鉴 定重组质粒。 1.5 重组表达质粒的构建 BglⅡ和 SalⅠ双酶切 pGEX -4T-1表达载体。Bgl Ⅱ和 SalⅠ分别双酶切 VPg2基因重组质粒，回收目的 基因片段，与 pGEX -4T-1 表达载体连接。连接产物 转化到 BL21大肠杆菌。 1.6 诱导表达 用 PCR方法鉴定重组表达质粒，同时进行诱导表 达，将单克隆菌落接种于 2ml LB培养基（Amp+）中， 37℃振荡培养。当菌摇至适当浓度时，即培养液 OD=0.6～1.0时，加入 IPTG（1 000 mmol·L-1）至终浓 度 1 mmol·L-1，37℃、200r/min振荡培养 6h，收菌。 1.7 表达抗原的鉴定 按常规方法 [7]进行 SDS-PAGE 和 Western- Blotting。Western-Blotting的封闭液为含 0.2%酪蛋白， 10%马血清，2%明胶的 PBS溶液。 1.8 表达抗原纯化 表达菌离心收集菌体，超声波处理后，用电洗脱 方法纯化。 1.9 确定间接 ELISA反应条件 用方阵滴定方法分别确定表达抗原包被浓度、血 清稀释倍数、辣根过氧化酶标记羊抗牛 IgG浓度及反 应时间。 1.10 试验牛血清的检测 用表达抗原 VPg2间接 ELISA方法对背景清楚的 试验牛血清进行检测，以样品 OD450nm值/阴性对照血 清OD450nm值≥2.0为判定阳性的标准。分析检测结果， 绘制不同牛检出表达抗原的抗体持续时间条形图，了 解表达蛋白抗体持续时间。并与 3ABC 表达抗原的 ELISA检测结果进行比较[6] 。 1.11 阴性牛血清的检测 2346 中 国 农 业 科 学 38卷 分别用表达抗原 VPg2间接 ELISA方法和表达抗 原 3ABC间接 ELISA方法对 2170份阴性牛血清进行 检测，以样品 OD450nm值/阴性对照血清 OD450nm值≥ 2.0为判定阳性的标准。分析检测结果。 2 结果与分析 2.1 VPg2基因 PCR扩增结果 用设计的引物以 3ABC重组克隆质粒为模板进行 PCR扩增，扩增的 VPg2基因为 90bp，与预期大小一 致。结果见图 1。 1.扩增的 VPg2基因；2.PCR DNA标准分子量 Lane1.VPg2 gene PCR product; Lane2.PCR Marker 图 1 VPg2基因 PCR扩增产物电泳结果 Fig.1 Electrophoresis of PCR product of VPg2 2.2 VPg2基因重组克隆质粒鉴定 用设计的引物对 VPg2基因与 pGEX-T-Easy载体 连接产物转化的菌落进行 PCR扩增鉴定，结果表明已 成功的亚克隆了 VPg2基因。 2.3 VPg2基因重组表达质粒鉴定 用设计目的基因引物对构建的重组表达质粒进行 PCR扩增鉴定。结果证实成功地构建了 VPg2基因的 重组表达质粒。 2.4 VPg2表达蛋白 SDS-PAGE鉴定 对 VPg2重组表达菌进行 IPTG诱导，菌体处理后 进行 12% SDS-PAGE。结果如图 2所示，表达的 VPg2 蛋白为 28.6kD。 2.5 VPg2表达蛋白 Western blotting鉴定 将 VPg2表达菌体裂解后进行 SDS-PAGE电泳， 并转移到 NC膜上，进行Western blotting分析。结果 显示，表达的 VPg2蛋白在 28.6kD位置出现阳性条带, 阴性对照菌仅有少数菌体蛋白呈非特异性反应。 2.6 间接 ELISA反应条件 经方阵滴定方法确定 VPg2表达抗原包被浓度为 1.蛋白电泳标准分子量；2. 阴性表达菌对照；3. VPg 2基因阳性菌； Lane 1.standard protein molecular weight marker； 2.Negative control; 3.Expressed VPg2 protein; 图 2 VPg2表达产物的 SDS-PAGE分析 Fig.2 SDS-PAGE of expressed VPg2 antigen 0.1µg ml-1、血清稀释倍数为 10 倍稀释、辣根过氧化 酶标记羊抗牛 IgG 工作浓度为 1∶10 000。反应时间 分别为：血清样品反应 30min、酶标记物反应 30min， 显色 10min。 2.7 VPg2表达蛋白 ELISA检测试验牛 FMDV非结构蛋 白抗体 2.7.1 空白对照组（C组） 用VPg2表达蛋白 ELISA 检测空白对照组不同时间采集的牛血清, 结果全部为 阴性。 2.7.2 灭活疫苗反复免疫组（CI组） 用 VPg2表达 蛋白 ELISA 检测灭活疫苗反复免疫组不同时间采集 的牛血清, 9 次反复免疫后，每次检测结果全部为阴 性。 2.7.3 未免疫直接攻毒组（D组）和疫苗免疫后攻毒 组（I 组） 用 VPg2 表达蛋白 ELISA 检测 D 组和 I 组牛最早检出时间为攻毒后第 10天。可检出 VPg2抗 体的持续时间最长可达 90d。用 VPg2蛋白检出抗体的 持续时间与 3ABC表达蛋白[6]基本相同(图 3)。 2.8 用 VPg2蛋白建立的 ELISA和用 3ABC蛋白建立的 ELISA对阴性牛血清的检测 用 VPg2蛋白建立的 ELISA方法对 2 170份进口 牛血清进行检测。结果 12份为阳性，占总数的 0.55%， 其 OD450nm值在 0.2～1.7之间。 用 3ABC蛋白建立的 ELISA方法对 2 170份进口 11期 田克恭等：口蹄疫病毒 VPg2基因克隆表达及 VPg2-ELISA检测抗体评价 2347 图 3 牛血清中 VPg2、3ABC蛋白抗体持续时间（其中 3ABC蛋白抗体持续时间参见文献[6]） Fig.3 Persistence time of antibody against VPg2,3ABC in the bovine sera 牛血清进行检测。结果 48份为阳性，占总数的 2.21%， 其 OD450nm值在 0.2～2.1之间。 3 讨论 3.1 3ABC基因的组成、功能以及分段克隆表达 在口蹄疫病毒非结构蛋白基因 3ABC中,包含 3A、 3B、3C 3 个基因片段。3A 基因表达的蛋白被认为 是小 RNA病毒复制复合体与膜结构结合的锚定蛋白， 与病毒诱导的细胞病理效应和阻断细胞内蛋白的分泌 有关，似乎与口蹄疫病毒的致病性有密切的关系，不 同血清型口蹄疫病毒 3A 编码区的改变或缺失均会减 弱其对牛的致病力。3B基因表达的蛋白是由编码区 3 个串联重复的非等同的基因编码的，因而可以产生 3 种不同的 3B蛋白（VPg），是 RNA病毒中少有的信 息丰余的例子。VPg 基因的拷贝数与 RNA 病毒的感 染力有关[8]，是病毒 RNA 合成时的引物蛋白。3C 基 因表达的蛋白为 Gln-Gly 特异的蛋白酶，催化大部分 聚蛋白的裂解，也参与组蛋白 H3 的裂解，可能对宿 主细胞的基因转录有阻抑作用。 理论上讲，非结构蛋白抗体在注射灭活疫苗时是 不能产生的。但有时由于灭活疫苗的生产工艺不同， 有些灭活疫苗中含有一部分与病毒复制有关的成份， 也可能会因多次反复免疫而产生非结构蛋白抗体，使 得通过检测这类抗体来判定口蹄疫病毒感染与否比较 困难，这就对检测用抗原提出了更高的要求：一是这 种抗原必须与病毒复制有关；二是在市售口蹄疫灭活 疫苗中没有或含量极低，不能刺激机体产生抗体；三 是要了解这种抗原在各种不同情况下动物产生相关抗 体的规律。综合分析笔者认为，表达小片段多肽仅有 少数的抗原决定簇，是有效区分感染动物与免疫动物 的单决定簇抗原或寡决定簇抗原，能检测到免疫动物 与感染动物产生口蹄疫抗体的细微差异。因此，通过 对口蹄疫病毒 3B基因中 VPg2片段进行 PCR扩增、 克隆，在大肠杆菌中高效表达出具有抗原活性的 VPg2 表达蛋白是行之有效的技术方法。 3.2 试验牛血清检测结果分析 用 VPg2表达蛋白 ELISA检测空白对照组（C组） 和灭活疫苗反复免疫组（CI组）不同时间采集的牛血 清，结果全部为阴性。表明该抗原具有很强的特异性。 用 VPg2表达蛋白 ELISA检测未免疫直接攻毒组 （D 组）牛血清，均显示抗体阳性，抗体最早检出时 间为感染后的第 10 天，抗体阳性可持续至感染后 3 个月试验结束。说明可检出抗体的最长时间为 3个月 以上，但大多数感染动物的非结构蛋白抗体将在 1年 左右消失，因为比非结构蛋白免疫应答程度更强的结 构蛋白，在大多数 FMD 自然感染动物中，抗体在一 周左右出现后，最长也只能维持 1～2年左右。少数动 物感染后几年仍可查出抗体，可能与病毒持续感染或 再次隐性感染有关。为此笔者认为，VPg2-ELISA 在 敏感性方面也是可以接受的。 用 VPg2表达蛋白 ELISA检测疫苗免疫后攻毒组 （I组）牛血清，情况比较复杂。7头试验牛中只有 1 头未查出 VPg2 抗体，其余 6 头均为抗体阳性。抗体 转阳的最早时间除 1头较早外，其余在感染后 20～60d 之间，较 D组牛抗体阳转时间推迟，但抗体阳性持续 时间仍可持续到感染后 3个月试验结束。该结果说明， 2348 中 国 农 业 科 学 38卷 尽管试验牛注射了疫苗，但攻毒后仍发生了一定程度 的病毒复制，因为只有在 FMDV 复制过程中才产生 NS蛋白。Moonen等[8]发现，FMD灭活疫苗免疫可保 护免疫动物不发病，但不能保证免疫动物再次受到 FMDV攻击时不被感染。本项研究不仅证明了上述结 论，还进一步发现，疫苗接种可降低再感染病毒的复 制速度。因此，高质量的 FMD疫苗接种仍是降低 FMD 疫情严重程度和蔓延速度的有效措施。 3.3 进口阴性牛血清检测结果分析 分别以 VPg2表达抗原和 3ABC表达抗原建立的 间接 ELISA 方法，对 2 170 份进口阴性牛血清进行 ELISA 检测。结果 3ABC 抗原检测阳性 48 份，占总 数 2.21%，VPg2抗原检测阳性 12份，占总数 0.55%。 由于这些国家长期以来既无口蹄疫疫情，也不进行口 蹄疫免疫接种，因此，上述检测为阳性的结果应该是 非特异性反应造成的假阳性反应。笔者认为，非特异 性反应出现的机率大小可能与检测试剂中抗原的纯 度、抗原片段大小或包含的抗原决定簇不同有关。除 检测试剂外，非特异反应还与被检动物的免疫史有关， 年龄越大的动物，假阳性发生的可能性越大。可以说， 任何血清学方法都存在非特异性反应，VPg2-ELISA 出现 0.5%左右的假阳性是可以接受的。 4 结论 利用在大肠杆菌中高效表达的具有抗原活性的 FMDV VPg2 蛋白建立的 VPg2-ELISA 方法适用于我 国 FMDV感染动物与灭活疫苗免疫动物的鉴别诊断。 References [1] Mezencio J M S, Babcock G D, Meyer R F, Lubroth J, Salt J S, Newman J F E, Brown F. 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