蛋鸡卵黄与血清中禽流感H5N1HI抗体相关性研究

实验研究 今日畜牧兽医 蛋鸡卵黄与血清中 禽流感H5N1 HI抗体相关性研究 胡自然 ，吴秀楼 ，韩庆安 ，刘红 ，许玉静 ，郑丽丽 ，李志民 ，李同山 ，胡晓悦 ，孟艳 ，杨秀女 ， 武秋双 ．段 占启 ．张芳 (1．河北省动物疫病预防控制 中心，河北保定 071000；2．河北省畜牧兽医研 究所，河北保定 071000；3．保定市动物疫病预防控制 中心 ，河北保定 071051) 摘要：用鸡蛋蛋黄(直接稀释和经萃取两种方法)和血清监测禽流感 H N (Re．1株)HI抗体，对三种 方法监测结果进行相关性研究。选择免疫抗体处于临界状态的产蛋鸡群进行加强免疫．然后将鸡群分为随 机采样组和固定采样组跟踪疫苗#说明书#规定的免疫期进行免疫抗体监测。结果表明：两组试验在免后 21 天抗体达到高峰 ，卵黄抗体和血清抗体 HI值接近，在 21天前卵黄抗体的上升滞后血清抗体的上升。免疫 抗体达到高峰后三种方法监测结果呈强相关．个值血清与卵黄相差一个滴度以内的占绝大多数．均值 经t检验有不同程度的差异，但差异不超过半个滴度。因此，用卵黄进行禽流感HI抗体监测是可行的。 关键词：蛋鸡；卵黄；血清；禽流感；免疫抗体；相关性 近年来，我国各级兽医防疫部门已将高致病 性禽流感免疫监测作为一项长期性和化工作 来抓．建立了一套禽流感疫情预测预报体系。按照 国际通用方法和我国，禽流感免疫抗体监测 样本是血清，用血清进行免疫抗体监测存在以下 几方面问 ，一是在抓禽采血产生应激会 给养禽 生产造成一定影响，养殖户产生很大抵触情绪，给 ^ 我们的监测工作带来阻力；二是养殖户采血技术 _ 不过关，甚至不会采血，必须由兽医亲自来完成， 兽医在养殖户中往来活动易造成疫病传播 ；三是 收集血样有时出现作弊现象，一份分为多份，造成 监测结果失实。为此，我们设想通过监测禽蛋卵黄 中禽流感免疫抗体来代替血清监测．解决血清样 本监测存在的问题。 1材料与方法 1，1疫苗 重组禽流感病毒灭活疫苗 (H N。亚型，Re一1 株，禽用)，哈尔滨维科生物技术有限公司生产，批 号 20060428。 1．2血凝抑制试验用抗原和血清 禽流感 H5亚型抗原和禽流感 H 亚型血清， 哈兽研生产，批号2005ll 13。 1 1 ．3试验 动物 保 定市满城 县满子 营养鸡场 现养 140日龄 一 一 ⋯ ～ ～ 一 ～ ⋯ ～ ⋯ 一 — — ⋯ ⋯ ⋯ ～ ～ ． ． ～ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ～ ～ o 9 2007年 第 8期 939蛋鸡2000只。该鸡群已于70日龄用哈尔滨维 科生物技术有限公司生产的H N。(Re—1)油苗进行 免疫，剂量为 0．5毫升／只，免疫后70天(140日龄) 产蛋率达 30％，健康状况良好，我们对鸡群随机采 集 10份血清进行免疫抗体监测，其效价为 4、6、4、 4、4、5、6、6、6、6，合格率为 60％，按照农业部办公 厅农办医(20o6)12号文件“免疫抗体≥25判为免 疫合格，合格率≤70％要及时进行补免”的要求，于 141 Et龄对鸡群接种禽流感 H N。(Re一1)油苗，剂量 为 0．7毫升／只。 1．4主要仪 器 900V型血 凝板 、移液器 、微量 振荡器、离心机、液体快速混合器等。 1．5主要试剂 1％鸡红血球 ．0．1摩 尔／升 PBS (PH值 7．2)。 2试验程序 2．1鸡群分组 将鸡群分为两组．一组为固定 采样组，即单笼饲养 15只鸡并编号为 1 15号，其 余为随机采样组。 2．2样品采集 按以下进行采血和收集鸡 蛋。 2．2．1随机采样组：注苗后每 5 10天随机选择 20只产蛋鸡，对应采集血清和鸡蛋进行 HI抗体监 测(每次被采样鸡只不重复)。 2．2-2固定采样组：注苗后每 10 20天对应采 Eo0．9N P@ ∞E)cJ喜 E．山 维普资讯 http://www.cqvip.com 今 日畜牧兽医 实验研究 集血清和鸡蛋进行 Hl抗体监测，每次不少于 lO 份。 2．3血凝抑制价(HI)测定 2．3．1血清 ：严格按照国家标准(GB厂rl8936) “禽流感血凝 (HA)和血凝抑制 (HI)试验方法 ”测 定血清 HI效价。 2．3．2卵黄：采取两种方法进行 HI效价测定。 一 是卯黄直接进行稀释．测定卯黄中 Hl效价。卵 黄直接稀释方法为：将收集的每枚鸡蛋弃去蛋清， 分别吸取 200微升蛋黄 ．加入 200微升 PBS液做 1：1稀释用以测定 HI效价 ，其测定方法同测定 血清 Hl效价的方法。二是卵黄经过萃取后测定 HI效价。卵黄萃取方法为：取卵黄 200微升，加 PBS液 200微升做 1：1稀释．然后再加等量氯仿 (400微升)萃取 ，充分振荡均匀，室温静置 30分 钟，最后 3000转／分离心5分钟，取上清进行 Hl 效价测定 ，其i贝0定方法同测定血清 HI效价的方 法。 3试验结果分析 固定采样组共配对采集鸡血清和鸡蛋 13次． 共监测血清和卵黄禽流感 HI抗体 180组份．随机 采样组共配对采集鸡血清和鸡蛋 23次．共监测血 清和卵黄禽流感 HI抗体462组份，通过数据统计 后表明．可分两个阶段进行分析．即免疫抗体上升 阶段和免疫抗体处于保护阶段。 3．1免疫抗体 上升阶段 两组试验结 果均表 明．免疫后 2l天 HI抗体达到高峰，且三种方法测 得结果接近。本试验 2l天前监测两次．即免后 lO 天、l5天两组共监测血清和卵黄5l组份．HI抗体 处于上升阶段．且卵黄 Hl抗体明显低于血清 HI 抗体．说明卵黄抗体的上升滞后于血清抗体的上 升。其中血清 HI抗体高于和等于卵黄直接测得 HI抗体的有49份，占96．1％，血清 Hl抗体高于和 等于萃取后测得 Hl抗体的有 5O份，占98％，说明 免疫抗体上升阶段卵黄抗体的上升滞后于血清抗 体的上升。 血清 HI效价均值为 7．96 Log2，卵黄 Hl效价 均值为 6．157 Log2，卵黄萃取后 Hl效价均值为 6．059 Log2，血清 与 卵黄 测得 HI效 价 相 差 1．8 Log2．与卵黄萃取后测得结果差 1．9 Log2，j种方 法测得结果均值经 t检验．P<0．01差异极显著。说 明免后 2l天前也就是抗体达到高峰前血清与卵 黄抗体差异大，不能用卵黄代替血清进 行免疫抗体监测。 3．2免疫抗体处于保护阶段 免疫后2l天至 220天，固定采样组共监测 l2 次．169组份，随机采样组共监测 21次，422组份。 从数据统计中不难看出，这段时间 HI抗体效价处 于免疫保护有效阶段，且三种方法测得结果比较 接近，具体分析如下。 3．2．1相关系数分析：对免后 2l天至220天测 得结果计算相关系数．两组三种方法测得结果均 呈强相关．两组相关系数rl和r2、rl和r3、r2和r3 进行t检验 ，结果 P>0．05，差异均不显著。相关系 数分析说明三种方法测得结果相关性基本一致 ， 所以用卵黄直接稀释和卵黄经萃取进行 HI抗体 监测都是可行的。 用卵黄直接稀释进行抗体监测操作简便．成 本低廉，便于推广，因此在一般临床抗体监测时可 选择用卵黄直接稀释进行 Hl抗体监测，但在科研 项 目或较重要试验应采用卵黄萃取的方法更好。 3．2．2个值分析：对两组三种方法监测结果个 值差异进行统计。 固定采样组血清和卵黄直接测得 Hl效价相 比．效价相差一个滴度以内的占90．54％，血清和 卵黄萃取后测得 HI效价相差一个滴度以内的占 88．14％．两组个值所占百分比经 t检验．P>0．05，差 异不显著。 随机采样组血清和卵黄直接测得 Hl效价相 ● 比．效价相差一个滴度以内的占91．47％，血清和 卵黄萃取后测得 HI效价相差一个滴度以内的占 88．14％．两组个值所占百分比经t检验，P>0．05，差 异不显著。 个值分析说明．血清与卵黄直接稀释测得结 果的差异与血清与卵黄萃取测得结果的差异相 比，结果不显著 ，血清与卵黄(直接稀释和经过萃 取)测得结果个值相差一个滴度以内占绝大多数， 因此可以用卵黄(直接稀释和经过萃取)来监测免 疫抗体．其结论与相关系数分析结论一致。 3．2．3均值分析：对两组测得结果均值进行 t 检验，结果显示，两组三种试验方法测得结果均存 在不同程度的差异．根据抗体均值差可以看出，卵 黄萃取后测得 Hl值最高，卵黄直接稀释次之，血 清最低，其差异均不超过半个滴度，(下转第 12页) 10 0 ～⋯一 一 ，一一～ ，一 一1一～～ ^ 一 一 一 2007年 第 8期 E_rT1∞il=jD(rT1们 ．corT1 维普资讯 http://www.cqvip.com 今日畜牧兽医 实验研究 试验见表 2。 表 1 疫苗的安全性试验 4．1此次分离的大肠杆菌078 菌株．经动物接种试 验证明，是一株致病性的大肠杆 菌。利用此菌株制备的自家灭油 乳剂灭活疫苗，疫苗安全性检验 和免疫效力检验证明此菌株免疫 原性 良好。 4．2大肠杆菌由于耐药性的 普遍存在，而且新的耐药菌株不 断出现．给本病的药物治疗带来 了很大的困难。而疫苗免疫预防 又由于大肠杆菌的血清型较多， 不同血清型菌株问的相互交叉免 表 2 疫苗效 力检验结果 批次 动物 数量(只)剂量(毫升)免疫部位 攻毒时间 攻毒剂量 保护结果 对照 结果 注：保护数／免疫数。 4结论 (上接第 10页)说明用卵黄进行 HI抗体监测是可 行的，同时也说明卵黄抗体的下降略滞后于血清。 4结论 4．1蛋鸡禽流感 HI抗体上升阶段，也就是二 免后 2l天以前 ，卵黄抗体的上升滞后于血清中 HI抗体的上升，且三种方法测得 HI均值经 t检 验，差异极显著，因此，上升阶段不能用卵黄代替 血清进行免疫抗体的监测。 4．2蛋鸡禽流感免疫 2l天后，直到免疫抗体 维持7个多月这一阶段，综合均值、个值和相关系 数分析结果 ，用卵黄(两种方法)代替血清进行 HI 测定．即可代表当前鸡群免疫水平。 5讨论 疫差。一般常规疫苗很 难面面俱到．往往免疫 效果不好。因此，能及 时分离本地区的的优 势血清型。制取自家灭 活疫苗．因疫苗针对性 强，能收到较较好的免 疫效果 。 4．3大肠杆菌是条 件致病菌，搞好饲舍的 卫生条件．会大大降低 本病的发生。 5．1该试验只进行了蛋鸡免疫禽流感 H N (Re一1株)的免疫效果监测，其他毒株疫苗有否差 异．有待进一步研究。 5．2 免疫抗体一般在 20天左右达到高峰，上 升阶段时间比较短．本试验监测次数少，对于三种 方法监测结果未做相关性分析，有待进一步研究。 生产实践中一般在免疫抗体达到高峰前没必要进 行免疫抗体监测。 5．3本次试验免疫抗体上升到高峰后，监测 时间超过疫苗说明书规定免疫时间，但还没跟踪 到免疫抗体降到临界水平，其抗体变化规律有待 进一步研究。I，。：茹 赫 赫 {赫 吝‘ ．三 罂 尊 o+．+．． 12 o o 2007年 第 8期 鎏 m．j∞ r)(j∞《 0．coj 维普资讯 http://www.cqvip.com