HPLC-UV法测定比格犬血浆中吡非尼酮浓度及其药代动力学

!"#$%&’法测定比格犬血浆中吡非尼酮浓度及其药代动力学王永升，赵小平，钟皎，陈燕，柳晓泉!，王广基（中国药科大学药物代谢与动力学研究中心，南京()***+）摘要目的：建立测定比格犬血浆中吡非尼酮浓度的，用于研究其在比格犬体内的药代动力学。方法：血浆样品用)*,高氯酸沉淀蛋白后取上清液直接进样，采用!"#$%&’法测定。色谱柱为汉邦#-./0123/40$)5柱（(6*7789:;77<=，6!7），流动相为乙腈%*:(,醋酸水（(>?@@），流速):*7#A7-B，检测波长>)*B7，内标为水杨酸。结果：线性范围为*:*@6C@;:;@!DA7#，方法回收率在)**:(,C)*>:>,之间，日内和日间的精密度均小于;,。结论：该方法样品前处理过程简便，灵敏度高，重现性好，符合血浆样品的测定要求，可应用于吡非尼酮比格犬体内的药代动力学研究。关键词吡非尼酮；!"#$；比格犬；药代动力学中图分类号E+;+F)文献标识码G文章编号)***H6*95（(**;）*(H*)9;H*9!"#"$%&’(#&)’)*+&$*"’&,)’"&’-"(./",).01+/(1%(23456789:(’,1#;,3)*&#1+<($%(=)>&’"#&=1IGJKL1BD%2/4BD，M!GNO-P1%3-BD，M!NJKQ-P1，$!RJLPB，#<&O-P1%STPB，IGJKKTPBD%U-!"#$"%&’(%)*+"$,-&./01,#234,%1,5&6/#"$/50，!4/#,34,%1,5")$/5,.7#/8"%0/$9，:,#;/#*<=>>>?，!4/#,!"#$%&’$!()：V1W4X4Y13P!"#$%&’74Z/1W[10Z/4W4Z407-BPZ-1B1[3-0[4B-W1B4-B\4PDY4W1D]23YP27PPBW[10Z/42ZTW-421[-Z23/P07P.1^-B4Z-.2-B\4PDY4W1D2F*+$,-.#："YP27P_P2304.-3-ZPZ4W_-Z/340./Y10-.P.-W（)*,）P[Z40PWW-Z-1B1[Z/4-BZ40BPY2ZPBWP0W2PY-.‘Y-.P.-W，PBWZ/4T3340PY-ST1Z_P2W-04.ZY‘-BU4.Z4W1BZ1!"#$2‘2Z47Fa43P0PZ-1B_P2P./-4X4W1BP#-./0123/40$)5.1YT7B（(6*7789:;77<=，6!7）_-Z/Z/471b-Y43/P241[P.4Z1B-Z0-Y4%_PZ40.1BZP-B-BD*:(,P.4Z-.P.-W（(>?@@），PZP[Y1_%0PZ41[)7#A7-BFV/44YT4BZ_P2W4Z4.Z4WPZ>)*B7F/+#01$#：#-B4P0W4Z4.Z-1B04231B242[103-0[4B-W1B4-BZ/43YP27P_4041bZP-B4W[1030-[4B-W1B4.1B.4BZ0PZ-1B0PBD-BD[017*:*@6Z1@;:;@!DA7#FV/4304.-2-1BWPZP，bP24W1B-BZ0P%PBW-BZ40%WP‘XP0-PZ-1B21X406WP‘2，_404Y1_40Z/PB;,PBWZ/474PB04.1X40-421[30-[4B-W1B40PBD4W[017)**:(,Z1)*>:>,F2-3’10#(-3：V/442ZPbY-2/4W!"#$74Z/1W-22-73Y4，24B2-Z-X4，04Y-PbY4PBWP33Y-.PbY4[103/P07P.1^-B4Z-.2ZTW-421[3-0[4B-W1B4:4+56-%.#3-0[4B-W1B4；!"#$；\4PDY4W1D；3/P07P.1^-B4Z-.2V/-22ZTW‘_P22T3310Z4Wb‘Z/4JPZ-1BPY!-D/V4./B1Y1D‘E424P0./PBW=4X4Y1374BZ"01D0P71[$/-BP（5;>"01D0P7）（J1:(**>GG(M>9@G）PBWQ-PBD2Tc4‘#Pb10PZ10‘1[=0TDd4ZPb1Y-27e"/P07P.1^-B4Z-.2（J1:\d(**)(*)）吡非尼酮（3-0[4B-W1B4，"=），化学名为6%甲基%)%苯基%(（)@）吡啶酮，是一种新型抗肺纤维化药物。体内药效学实验表明它在多种药物致纤维化动物模型中均显示有减少肺纤维化的作用，连续给予模型动物"=可减少肺中胶原的蓄积［)，(］。体外药效学研究也显示"=能明显地减少肺纤维化的增生，临床上可用于治疗闭塞性细支气管炎［>］。临床试验中发现"=对人的特发性肺间质纤维化（<"f）具有明显的治疗作用［9］。有关"=的测定方法和药代动力学研究国外文献很少，国内尚未见文献报道。VPB-‘P7P等［6］使用\1BW%RYTZ固相萃取柱预处理血浆样品后用!"#$%&’法测定血浆中的"=，但是这种方法需要使用昂贵的固相萃取柱，样品前处理过程复杂、费时，不适合大批量样品的处理。K-0-;9)!收稿日期(**6%*+%*;"通讯作者V4Y：*(6H5>(@)(;*R%7P-Y：Y-Tg-P1STPBh‘P/11:.17基金项目国家高技术研究发展（“八六三”计划）资助项目（JN:(**>GG(M>9@G）；江苏省药物代谢动力学重点实验室资助项目（J1:\d(**)(*)）学报Q1T0BPY1[$/-BP"/P07P.4TZ-.PY&B-X402-Z‘(**;，!"（(）：#################################################################)9;H)9+万方数据等［!］使用乙睛沉淀蛋白法同时测定了小鼠血浆内的"#及其代谢物，但是该法样品前处理过程复杂，且需采用梯度洗脱才能同时测定"#及其代谢物，这使得样品的分析测定十分费时，不适合于大批量样品的测定。另外，$%&’’等［(］采用液)液萃取血清样品后用荧光测定"#，但该法不能同时检测其代谢物，且最低检测浓度只有*+,-./01，无法满足药代动力学的研究需要。本文建立了一种简单、可靠的2"13方法，测定比格犬口服单剂量"#后的血药浓度，并研究其在犬体内的药代动力学。!材料454仪器岛津13)4,67高效液相色谱仪，岛津8"#)4,69:紫外检测器，2;)*,,,色谱工作站，汉邦1<=>%?’:>@%34A柱（*+,00BC5!00D#，+!0）。45*药品与试剂吡非尼酮（含量为EEF），由中国药科大学有机化学教研室提供，内标为水杨酸。乙腈为色谱纯，实验中所用其他试剂为分析纯。45G动物比格犬!只，由中国药科大学动物房提供，雌雄各半，体重为AH4*I.。"方法的建立与考证*54色谱条件汉邦1<=>%?’:>@%34A柱（*+,00BC5!00D#，+!0），流动相为乙腈)水（含,5*F醋酸）（*GJ((），流速45,01/0<-，柱温+,K，检测波长G4,-0，灵敏度,5,,46LM8，进样量*,!1。*5*血浆样品处理取抗凝血浆4+,!1，加入内标*,!1（4*4!./01）振荡4,’，加入4,F高氯酸+,!1，涡旋振荡G0<-，离心4+,,,%/0<-4,0<-，取上清液，再次离心4+,,,%/0<-4,0<-，取第*次的上清液*,!1直接进样，用样品与内标峰面积比进行定量分析。*5G方法的特异性考证取比格犬空白血浆4+,!1，按“*5*”项下的方法处理，并与给药后的生物样品及品对照，所得的色谱图见图4。由图4可见，血浆中的内源性物质、吡非尼酮（保留时间为*G0<-）、吡非尼酮代谢产物（保留时间为4,0<-）和内标（保留时间为4(0<-）均互不干扰。#$%&!3>%?0NO?.%N0’?P（6）：QRO%N=O@STUN-I$@N.U@S?.:UN’0N；（$）：$@N.U@S?.TUN-I:UN’0N’:<I@SV<O>"#（4E54(!./01，!WX**5A!(0<-）N-SO>@<-O@%-NU’ON-SN%S（4*4!./01，!WX4(5*C(0<-）；（3）："UN’0N’N0:U@’?TON<-@SNO,5+>NPO@%N’<-.U@S?’@?PG(0./I."#P%?0N$@N.U@S?.*5C血浆中"#标准工作曲线制备在空白血浆中加入不同浓度的吡非尼酮标准液，使其浓度分别为,5,(+，,54+，,5!,，*5C,，C5(E，4E54(，GA5GG和(!5!(!./01，按“*5*”项下的方法处理，用样品峰面积与内标峰面积比"对样品浓度#作线性回归，得回归方程"X,5,!!!#Y,5,,4G（$Z,5,4，%X+）。在上述条件下，"#的最低检测浓度为*G-./01，最低定量浓度为(+-./01。*5+方法的回收率试验在空白血浆中加入不同浓度的吡非尼酮标准液，使血浆吡非尼酮浓度为,54+，C5(E，GA5GG!./01，按“*5*”项下的方法处理，以血浆样品标准曲线吡非尼酮测得量与吡非尼酮加入量之比求算回收率，结果见表4。’()&!W@=?9@%<@’?P"#<-$@N.U@S?.[’:UN’0N（%X+）6SS（!./01）M?&-S（!./01）W@=?9@%\（F）W8#（F）,54+,54+],5,44,G5*E]!5E+!5(C5(EC5AE],5,E4,*5,4]45A445AGA5GGGA5C*],5(G4,,5*C]45E445E(C4第*期王永升等：2"13)L^法测定比格犬血浆中吡非尼酮浓度及其药代动力学万方数据!"#方法的精密度试验在空白血浆中加入不同浓度的吡非尼酮标准液，使血浆吡非尼酮浓度为$"%&，’"()，*+"**!,-./，按“!"!”项下的方法处理，测定日内和日间变异，结果见表!。!"#$%012345647416812935647:4::47;438428<1:<=>?81@94,A96<,B:CA4:.4（!D&）"（!,-./）012345647#E$FG?（H）012935647:#E$FG?（H）$"%&$"%&E$"$%’"($"%’E$"$%#"$’"()’"+)E$"$)%"+&"%(E$"!*’"&*+"***+"’!E$"(*%")’%"%&E$"++!"%!"(冻融稳定性试验取干净试管，加入空白比格犬血浆，加不同浓度的标准品，使血浆浓度分别为$"%&，’"()，*+"**!,-./，放置于I($J冰箱冷藏%周，*(J水浴解冻后，测定药物浓度，结果分别为（$"%#E$"$%），（’"+’E$"$#），（*+"*!E$"#%）!,-./。&比格犬口服>?后的药代动力学研究*"%给药及血样采集比格犬#只，禁食过夜，次日以*(.,-K,剂量口服>?胶囊，于给药后$"%#(，$"!&，$"&，%，!，*，’，#，+L前肢静脉取血，肝素抗凝，*&$$3-.81离心%$.81，分离上层血浆，按“!"!”项下的方法处理后测定。*"!药代动力学研究药代动力学参数采用非房室方法计算。#只比格犬口服>?（*(.,-K,）后的血药浓度5时间曲线见图!，主要药代动力学参数见表*。’()$%M941CA4:.4N<1N9123428<1528.9NO3;9<=>?=<AA<P81,<34A46.818:23428<1<=*(.,-K,>?81@94,A96<,*讨论本文建立的Q>/R5ST法采用%$H高氯酸沉淀蛋白后直接进样。高氯酸既有很高的沉淀效率，又可以最大限度的降低样品的稀释度，同时也可以减少样品处理过程中代谢物的丢失，沉淀后经两次高速离心，保证了样品的纯净度。与国外文献［&I(］报道的方法相比，本文所建立的测定方法具有操作简单、选择性强和灵敏度高（最低检测浓度为!*1,-./）等特点，并可用等度洗脱以较短的时间（每个样品约!&.81）同时检测>?及其代谢物，应用此方法连续测定多份血样，均取得良好结果。!"#$&>L43.4N<K81928NC434.9293:81@94,A96<,4=2934:81,A9<34A6<:9<=*(.,-K,>?（!D#）>434.9293#E$%%-!（L）$"()E$"!&&’(（L）%"’’E$"*!".4U（!,-./）’*"$*E#"#$%.4U（L）$"’*E$"*!)*-V（/-L·K,I%）$"&$E$"%’+,)（$521）（!,·L-./）(("!(E%#"+(+,)（$5W）（!,·L-./）(("*+E%#")%比格犬口服单剂量>?后，血药浓度迅速达到峰值且浓度较高，%.4U和".4U分别为$"’*L和’*"$*!,-./，表明药物的口服吸收良好。血药浓度达峰值后，>?的浓度迅速下降，+L后已低于(&1,-./，末端相消除半衰期%%-!仅为$"()L，显示>?在体内的消除迅速。文献［#］报道>?在小鼠体内的消除半衰期%%-!为+"#.81，并在血浆中检测到两个"相代谢物M%和M!，M%为>?吡啶环上甲基的羟化代谢物，其质荷比（-./）为!$!，M%可被进一步氧化为羧酸代谢物M!，其-./为!%#。本实验中，在给药后的犬体内也检测到两个代谢的物质，经/R5MG测定，其-./分别为!%#和*(+。-./为!%#的物质可初步确定为>?的羧酸代谢产物M!，而-./为*(+的物质从相对分子质量上推断可能是>?及其"相代谢物的#相代谢物，这仍需进一步的确证。上述结果表明>?在比格犬体内的消除明显慢于其在小鼠体内的消除，两者的消除半衰期相差&"&倍。同时，>?在犬体内和小鼠体内生成的代谢物也不完全相同，这提示>?的代谢消除可能存在种属差异，这一现象值得引起重视。因为这种代谢的种属差异可能会对其疗效和毒性产生直接或间接的影响，这有待进一步研究。参考文献［%］0793GX，Y8A6ZG，GNL8962MZ，0%12[?8924378124K9<=C83=9186<194.9A8<3429:\A9.7N815816ON96AO1,=8\3<:8:81L4.:293:［Z］[3*14)25!&06，%))&，+%,（#）：(()I(+&"+’%学报3789!127:);5!1<;19-1"08%5"12,!5=09$5%>第*(卷万方数据［!］"#$%&’，()%*+,-.&/，0#1$2(，!"#$%34.*5-6%+7-7-7)8$,-+%)9$16#:-%5$.-1+.$5$1-.1-$9)59$%9;$7$<+.11+7$-.)9;%$$=1+7$6,$+8#<-.=;)879$%8+1$,［>］?&’()*+,-!.，@AAB，!"（@）：@@AC@D!E［D］2+7).F;G，H)./，I;%+.17$9&，!"#$%J-%5$.-1+.$：).+K$,).9-5-6%+7-7)*$.9L-9;-8:,-<)9-+.75+%9;$9%$)98$.9+5+6,-9$%)9-K$6%+.<;-+,-9-7［>］?/0#+.($#+"1023，@AAB，#$（M）：@A@NC@A@@E［O］P)*;4Q，>+;.7+.HR，3+<S;+%92，!"#$%I%$)98$.9+5-1-+:)9;-<:4,8+.)%#5-6%+7-7L-9;).$L).9-5-6%+9-<)*$.9，:-%5$.-1+.$：%$74,97+5):%+7:$<9-K$，+:$.=,)6$,:;)7$!7941#［>］?456-!.(70807"8#0!9!:，@AAA，%&’（O）：@NT@C@NTAE［M］I).-#)8)(，U;6)#)7;-&，’)%-9)(，!"#$%J;)%8)<+S-.$9-<7+5).).9-=5-6%+9-<)*$.9，:-%5$.-1+.$，-.;$8+1-),#7-7:)9-$.97［>］?&*068$7+1;#05#32$，@AAV，&!（@）：VVCVBE［T］Q-%-&’，H).*W>，X-$Y，!"#$%J;)%8)<+S-.$9-<7).18$9)6+,-78+5).+K$,).9-5-6%+9-<1%4*:-%5$.-1+.$，-.8-<$5+,,+L-.*-.9%)K$.+47)18-.-79%)9-+.［>］?<72(;#05=0*,=7.(2.，!NN!，!#（M）：!NDC!@@E［V］/%477(3，()%*+,-.&/，Q-%-&’?J;)%8)<+S-.$9-<7+5+%),,#)18-.-79$%$1:-%5$.-1+.$-.8),$).15$8),$/$)*,$7［>］?6>!"1;#05#32$/;!0，!NNO，!(（M）：DT@CDTVE·新进展·我国新药筛选及关键技术研究取得进展我国药物新靶点的研究取得一定进展。发现了一些针对原发性肝癌、与肿瘤发生相关的信号转导途径、胆固醇代谢调节和动脉粥样硬化症、老年性痴呆症等疾病相关的特异蛋白，为进一步研究奠定了基础。高通筛选模型数量、质量及筛选技术水平明显提高。针对重要疾病的关键靶点，研究建立了BD个分子和细胞水平的高通量筛选模型，超过预定指标@倍多，其中包括核受体等我国过去所缺乏的新型靶点。模型的数量和质量较“九五”期间有了明显提高，注重可靠性和新颖性，体现了研究水平的提高，同时也兼顾了医疗和市场需求。这些模型与原有的模型一起，构成了比较完整、配套的筛选模型体系。通过引进和创新相结合，建立和发展了一批新的高通量筛选技术和方法，包括@N=XY轴向阵列测试方法、钙离子浓度检测技术、亲近闪烁检测法以及生物芯片技术等@N多种新方法、新技术，提高了高通量筛选的速度和准确性。筛选样品库的规模迅速扩大。在天然产物样品方面，共收集了DNNN多种药用植物，得到了DMTD个植物提取物，从中分离得到TOV@M个组分或部位；经纯化和结构鉴定，获得了近MNNN个纯化合物。在微生物来源的样品方面，采集海洋和陆地的土壤样品@NNN多份，从中分离得到小单孢菌等菌株!MNNN株，制备发酵液O!BTV份；使得累计保藏的菌株达DONNN多株，发酵液样品MNNNN多份。在合成化合物样品方面，合成了结构新颖的化合物OVNNN多个。开展了大量的药物筛选工作。针对@NN多种模型，开展了@DN多万药次的高通量筛选，发现了一大批具有生物活性的样品。大部分活性化合物正在进行结构优化和深入评价，一些化合物已被确定为先导化合物或候选药物，有的已进入临床前研究，显示出较好的发展前景。在此基础上，申请专利@N!项（国际专利A项），获得专利授权O项。获国家科技进步二等奖与上海市科技进步一等奖。（中国高技术研究发展计划网）AO@第!期王永升等：0J3R=Z[法测定比格犬血浆中吡非尼酮浓度及其药代动力学万方数据HPLC-UV法测定比格犬血浆中吡非尼酮浓度及其药代动力学作者：王永升，赵小平，钟皎，陈燕，柳晓泉，王广基，WANGYong-sheng，ZHAOXiao-ping，ZHONGJiao，CHENYan，LIUXiao-quan，WANGGuang-ji作者单位：中国药科大学药物代谢与动力学研究中心,南京,210009刊名：中国药科大学学报英文刊名：JOURNALOFCHINAPHARMACEUTICALUNIVERSITY年，卷(期)：2006,37(2)被引用次数：3次参考文献(7条)1.IyerSN;WildJS;SchiedtMJDietaryintakeofpirfenidoneamelioratesblemycin-inducedlungfibrosisinhamsters1995(06)2.IyerSN;MargolinSB;HydeDMLungfibrosisisamelioratedbypirfenidonefedindietaftertheseconddoseinathree-dosebleomycin-hamstermodel[外文期刊]1998(01)3.DosanjhA;WanB;ThrondsetSPirfenidone:anovelantifibrosisagentwithimplicationsforthetreatmentofobliterativebronchiolitis[外文期刊]1998(05)4.RaghuG;JohnsonWC;LockhortDTreatmentofidiopathicpulmonaryfibrosiswithanewantifibroticagent,pirfenidone:resultsofaprospective,open-labelphaseⅡstudy1999(04)5.TaniyamaM;OhbayashiS;NaritaMPharmacokineticsofananti-fibroticagent,pirfenidone,inhemodialysispatients1997(01)6.GiriSN;WangQJ;XieYPharmacokineticsandmetabolismofanovelantifibroticdrugpirfenidone,inmicefollowingintravenousadministration[外文期刊]2002(05)7.BrussML;MargolinSB;GiriSNPharmacokineticsoforallyadministeredpirfenidoneinmaleandfemaleBeagles[外文期刊]2004(05)本文读者也读过(8条)1.章晓玲.马凤余.宗国军.高嵩.查大俊.ZHANGXiao-ling.MAFeng-yu.ZONGGuo-jun.GAOSong.ZHADa-jun高效液相色谱法测定吡非尼酮的含量及有关物质[期刊论文]-安徽医药2009,13(11)2.赵小平.王永升.钟皎.陈燕.柳晓泉.王广基.ZHAOXiao-ping.WANGYong-sheng.ZHONGJiao.CHENYan.LIUXiao-quan.WANGGuang-jiLC-MS法测定比格犬血浆中长春氟宁浓度及其药代动力学[期刊论文]-中国药科大学学报2006,37(3)3.吴际吡非尼酮的大鼠药物动力学及对细胞色素P450酶活性的影响[学位论文]20054.田大丰.李英.田晓琳.王中彦.TiLANDa-feng.LIYing.TIANXiao-ling.WANGZhong-yan万氏牛黄清心缓释胶囊在比格犬体内药动学研究[期刊论文]-现代生物医学进展2008,8(6)5.张蓓蓓.张尊建.田媛.汪洋.李先霞.ZHANGBei-bei.ZHANGZun-jian.TIANYuan.WANGYang.LIXian-xia洛索洛芬钠缓释片在比格犬体内的药代动力学[期刊论文]-中国药科大学学报2006,37(4)6.弓全胜.周铁玲.李慧义.田颂九.冯芳.GongQuansheng.ZhouTieling.LiHuiyi.TianSongjiu.FengFang气相色谱法测定吡非尼酮原料药中的残留溶剂[期刊论文]-中国药事2006,20(9)7.皮喜田.肖霄.彭承琳.刘洪英.郑小林.刘明.PIXi-tian.XIAOXiao.PENGCheng-lin.LIUHong-ying.ZHENGXiao-lin.LIUMingHPLC测定比格犬血浆中的盐酸二甲双胍及其药物动力学研究[期刊论文]-华西药学杂志2008,23(5)8.吴健鸿抗肺纤维化新药吡非尼酮的药代动力学研究[学位论文]2006引证文献(4条)1.刘和凤.高嵩HPLC法测定吡菲尼酮片的含量及有关物质[期刊论文]-中国药师2011(5)2.王茂湖.陈敏纯.李海燕.贾艳艳.周伦.丁莉坤.文爱东吡非尼酮片在中国健康人体的药动学研究[期刊论文]-中国药师2013(1)3.章晓玲.马凤余.宗国军.高嵩.查大俊高效液相色谱法测定吡非尼酮的含量及有关物质[期刊论文]-安徽医药2009(11)4.柴逸峰.朱臻宇.李翔药物分析(Ⅰ)[期刊论文]-分析试验室2008(8)本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgyaokdxxb200602011.aspx