PDGFRα的高表达在人脊柱裂胚胎中的研究

PDGFRot的高表达在人脊柱裂胚胎中的研究 赵虹张俊涛张悦红解军 【摘要】 目的探究血小板源性生长因子受体仪(PDGFRa)在人脊柱裂胚胎中的表达情况。方法 应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT．PCR)检测PDGFRa基因在人脊柱裂胚胎中的表达，以GAP- DH作为内参照，并同时检测PD眺的上游调控因子PAXl的表达，免疫组织化学法检测PDGFRa蛋 白在人脊柱裂胚胎中的表达。应用统计学软件(ID—advanced)分析图像结果。结果人脊柱裂胚胎中的 PDGFRa基因及蛋白的表达高于正常对照组(P<0．01)。结论PDGFRa的高表达在人脊柱裂发病中 起重要作用。 【关键词】 脊柱裂；血小板源性生长因子受体俚；逆转录PCR TheOver·expressionofPDGFRninHuman’SSpinaBifidaZHAOHong，ZHANGJun·tao，ZANGYue— hong，XIEJun．(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology，ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan 030001，China) Correspondingauthor：XIE胁E-mail：茗蚵岬yahoo．corn 【Abstract】ObjectiveToexplorethemRNAexpressionofplatelet-derivedgrowthfactorreceptor-al- pha(PDGFRa)inthehumanspinabifida(SB)embryos．MethodsSemi—quantityreversetranscriptasepoly- merasechainreaction(RT—PCR)WaSusedonneuraltissueofhumanspinabifidaembryotodetectthedynam— icsexpressionofPDGFRaandupstreamregulatorfactorPAXl．GAPDHW8$usedashousekeepinggene．The immunohistochemiealWasusedtOverifytheprotein’SexpressionofPDGFRa．Theleveloftheexpressionof PDGFRamRNAinscannedimageWasanalyzedwithID-advancedsoftware．ResultsTheresultsofRT—PCR showthattheexpressionofPDGFRamRNAandprotein’a弛bothhigherinspinabifidaembryosthanincontrols (P<0．01)．ConclusionTheover-expressionofPDGFRaplayBallimportantroleinhuman’Sspinabifida． 【Keywords】Spin,,bifida(SB)；Hatelet．derivedgrowthfactorreceptor—alpha(PDGFRa)；Reverse transeriptascpolymerasechainreaction(RT-PCR) 脊柱裂和无脑儿是人类出生缺陷的常见类型 (1／1000新生儿)，全球每年约有300000例病患， 中国山西省脊柱裂的发病率约为美国的10倍⋯。 NTDs的病因是多种的，包括遗传因素(多基因 遗传)和环境因素(维生素叶酸缺乏、高热、酒精及 药物致畸等)共同干扰神经管的闭合。NTDs初期 研究发现叶酸、维生素B12摄取不足或代谢障碍会 导致神经管发育异常而引发NTDs。对叶酸代谢通 路中的关键酶，例如5，10一亚甲基四氢叶酸还原酶 (5，10，methyleneterahydrofolatereductase．MTI-IFR)¨j、 DOl：10．3760／cma．j．issn．1673-4386．2009．04．002 作者单位：030001太原，山西医科大学生物化学与分子生物学 教研室 通信作者：解军(E．matI：xlejtmty逾yahoo．㈣) ·249· ·论著· 甲硫氨酸合酶还原酶(methioninesythasereducetase， MTRR)”1、甲硫氨酸合酶(me山ioninesynthase， MS)、胱硫醚合酶(cyseathioninel3synthase，CBS)等 的研究表明【4-61，这些酶基因特异性位点的突变可 能与神经管畸形有关，但某些位点的等位基因频率 具有地域和种族的差异，所以研究缺乏一致性结论， 而且它们之间协同作用的影响还没有得到合理的阐 释。近年来，在经典的NTDsPatch鼠模型中证实编 码血小板源性生长因子受体a(platelet．derived growthfactorreceptor—Mpha，PDGFRa)的基因缺失 或低表达会引起先天性神经管畸形【_¨，而Joosten 等¨’91发现PDGFRa单体型启动子的融合与人 NTDs发病有相关性，实验数据表明PDGF№的高 转录和高表达会导致神经管的异常闭合而引发 NTDs。 本次实验旨在于探究人类PD觎Ra基因与中 万方数据 国山西吕梁地区脊柱裂新生儿发病的相关性。此地 区的脊柱裂新生儿发病率为文献报道的高发区(约 12％o—16‰)，除此之外还要证明究竟是PDGFRa 的高表达还是低表达在脊柱裂的发病起重要作用。 1材料和方法 ljl人胚脑组织总RNA的抽提：依据知情同意原 则，所有样本包括脊柱裂(n=28)以及对照组(n= 19)在周龄16—24周取材于山西吕梁医院。中期引 产采用米非司酮方法，B超确诊为脊柱裂。将胚胎 脑组织取出，提取总RNA。采用TRIzolTM试剂(GIB． COBRL)。纯化总RNA采用RNeasyMiniKit试剂 盒(QIAGEN)。测定A260／A280比值为1．8-2．0。 1．2 PDGFRa和PAX．在人脊柱裂胚胎中的表达： 采用RNAPCRKIT(AMV)VER3．0两步法反转录 试剂盒(TAKARADRR019A)进行RT．PCREX- 如1”埘0．25“L(TaKaRa)，PDGFRa弓I物Forword： 5’TACTGTI'GGAGCTACAGGGAGAGAAA．3’／Revers： 5’-7rACCrI’】rCTCC’rCCGATG，IfI'ATTCCGG-3’；PAXl引 物Forword：57一CrrCAGGGGGCAGfrrGA-3’／Revers： 5’一GCAcccAGGCGcAc哪-3’；GAPDH引物For- word：5’．ACGGATITGGTCGTA’兀1GGG-3’／Revers：5’． TCAllWrGGAGGGATCTCGC-3’。按照以下反应循 环：①94℃2min；(多94。C30s；③50～600C30s；④ 72℃lmin。其中②．④循环25～30次。取PCR产 物5—10灿进行2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后一 70℃冻存。扫描图像后应用计算机软件分析电泳条 带灰度值进行单因素方差分析统计学处理。 1．3免疫组化：PDGFRa一抗(兔抗人PDGFRa武 汉博士德BA0275)l：1500稀释，4。C过夜。二抗 (羊抗兔IgG，武汉博士德)1：150稀释。DAB显色 试剂盒(武汉博士德)。蒸馏水洗后进行苏木素复 染2rain、盐酸酒精分化最后脱水、透明、封片、镜检。 图像结果在计算机软件处理，测定吸光度值(OD)行 t检验分析。 2结果 2．1 人胚脑组织总RNA的提取：电泳结果显示每 个样本都显示出rRNA的28s、18s和5．8s条带， 证明总RNA提取完整。 2．2 PDGFRa以及PAXl在脊柱裂胚胎中的表达 2．2．1 人脊柱裂胚胎脑组织内参照GAPDH (568bp)的表达文献报道在脊柱裂发病过程中其 B：M也有改变【l0l，据此我们选用GAPDH作为内参 照而不选用B2M。GAPDH在各样本间无差异表达， 即可作为内参照(P>0．05)(见图1)。 2．2．2人脊柱裂胚胎脑组织中PDGFRa的表达 PDGFR仅在人脊柱裂胚胎样本中的表达高于对照组 (P<0．01)(见图1)。 2．2．3人脊柱裂胚胎脑组织中PDGFRa的表达 PAXl在人脊柱裂胚胎样本中的表达高于对照组(P <0．01)(见图1)。 2．3 PDGFRa蛋白在人脊柱裂胚胎脑组织中的表 达：免疫组化染色结果显示正常对照组神经上皮发 育良好，排列整齐，胞质DAB轻度着色；而脊柱裂组 神经上皮细胞排列不甚规则，胞核小而浓集，胞质 DAB着色深，呈PDGFRa免疫组化强阳性棕色着 色。图象分析结果显示，脊柱裂组胚胎神经上皮的 OD值与对照组相比，均明显增高(P<0．01)(见图 2)。 2．4数据统计学分析：经过图像灰度扫描，且数据 经过统计学处理后，数据显示PDGFRa以及其上游 调控因子PAX。在人神经管畸形胚胎脑组织中的表 达均高于对照组(P<0．01)(见图3及表1)。 图1 人脊柱裂胚胎脑组织PDGFRa和PAXl的表达 魄．1 1k麟掣蜘0fGAPDHandPAXIinhumanspinabifidambryes 1-3：对照组胚胎样本；4-6：脊柱裂胚胎样本 i-3：controls；4-6：Spinabifida 万方数据 国匪遗篮堂盈麦兰Q塑生堡旦!§旦箜丝鲞筮兰翅丛』鱼里坠堕叁坚：!§：至Q鲤，!型：丝。№：堡 ¨ hn 羞 韩 神 圈2人脊柱裂胚胎PDGFBa蛋白的表达(x400) 酶2Theexpression0fthe圈lG豫qpreteininSpinsbifida(x400) 。 A对照组胚胎；B脊柱裂胚胎 A．Control；B．Spinabifida． ·25l· 1-3Control A B C D 豳3统计数据分析图 Fig．3Staticaldamanalysis l-3：对照组胚胎样本；4．6：脊柱裂胚胎样本 A：灰度值扫描后统计学分析，l击样本无差异(P>O．05)，表明样本之间没有明显差异；B：取PDGFRa灰度值／GAPDH灰度值之比作为统 计数据分析，脊柱裂样本的PDGFRa表达明显高于对照组(Po．05)betweendifferentsamples(P>0．05)；B：TheexpressionofPDGFRaishigherin Spinabifidathanincontrols(P