等位特异PCR方法检测IL-6基因启动子区-634C%2fG多态性 (1)

昆明医学院学报2005。(4)：2I～23 AcadeIlIicJo啪lalofKu眦虹llgMedicalCo¨ege CN53一1049／R 蒸簇鬻鬻誉藜 等位特异PCR检测IL一6基因启动子区一634C／G多态性 安新焕¨，宋滇平¨。王玉明2’ (I)昆明医学院第一附属医院糖尿病科；2)检验科，昆明650032) [摘要]目的：应用等位特异PCR法检测IL一6启动子区一634位C／G变异，以探讨贼R应用的可行 性．方法：应用AsPCR法和PCR一融?LP法同时检测10l例研究对象IL一6启动子区一634位C／G变异的多 态性，并对二者的结果进行比较研究．结果：(1)除一个Cc基因型结果不一致外，其余的0G、GG和CC基 因型两种方法的结果都一样；(2)ASPCR在单点突变多态性的检测中，具有省时、快速和成本低等优点，结 论：APCR方法检测基因的已知突变，具有快速、准确、省时、价格低等优点，在满足引物模板间碱基错配 能阻止引物延伸的条件下，可优先选用此法． [关键词]等位特异P(、R；白介素6基因；多态性；聚合酶链反应限制性片断长度多态性 [中图分类号](175[文献标识码]A[文章编号]1003—4706(2005)04一0021—03 AlleleSpecificPCRMethodDetecting theP01)1【norphismofIL一6GenePrImloterR℃gion一634C／G AN)(jn-huan¨，SoNDDian—ping¨，wANGYu—r11in孑’ (1)I砌．o厂D池施舀；2)D班．盯L砌嗍删，1k15￡蛳妇删H0咖越谚K“n碱咏M反i碰僦比ge， K孔九"矗7曙650032，Cm竹口) [Abstract]0bjective：Todetectthe—ymorphismofIL一6genepronloterregion一634c／Gbyallele specificPCRmethcHd．Methods：nlepolymorphismofIL一6genepromoterregion一634C／Gin101sub— jectswhosegenotypesweredetectedbyPCR—RFLPweredetectedbyallelespecificPCRmethod，theresults ofthetwomethodswereteStedandvedfiedwitheachother'andthetwomethodswereaSSessed．ReSults： (1)ThereSultsofCG、GGand(℃genotypeswereidemicaJexceptonecaseofCCgenotypeinthetwometh— odS．(2)～lelespecificPCRmethod、^mspeedyandaccuratewithaklwc∞t．C钿clusion：Whendetectinga known嘶ntmutationofcertaingene，alldespecificPCRmethodwillbe西venpd谢tyoverPCR—RFLP methodifrnjsmatchingofbaseandprimerS∞uldpreventprimereXtension． [Keywords]～lelespecificPCR；IL一6鲫e；POIyTnorp}1iSm；PCR—RFLP 等位特异PCR(ASPCR)方法是检测DNA 片段是否存在已知位点变异的常用方法，具有快 速、省时、价格低廉、检出率高¨j等优点，分别 使用与突变位点碱基相匹配的引物同时进行两个 P(、R扩增，扩增产物电泳后，根据条带的有无来 判断相应的基因型．现用ASPCR方法对IL一6— 634C／G多态性进行检测，与PCR—RFLP所得的 结果互相验证，并比较两种方法的优劣，为以后 的科研工作提供更多的方法学的参考． 1材料与方法 1．1研究对象 选取研究对象共101例，其中正常对照组43 例，糖尿病组58例．这些研究对象均已用PCR [基金项目]云南省教育厅基金资助项目(042021c) [作者简介]安新焕(1969～)，女，河南洛阳人，主治医师，医学硕士，主要从事糖尿病及其并发症的相关研究 和临床工作．现在广东省中山市人民医院内分泌科工作． 万方数据 Administrator 文本高亮工具 Administrator 文本高亮工具 Administrator 文本高亮工具 Administrator 文本高亮工具 昆明医学院学报 第26卷 一RFLP方法检测过其IL一6—634C／G基因型． 1．2材料 主要仪器：PE9600基因扩增仪(美国Perkin EImer公司)；P0werPac3000型电泳仪和Gd 【)0c1000紫外图像分析系统和配套的分析软件 (美国BIO—RAD公司)． 主要试剂：自行设计三条引物上游引物5’一 GCAGGCCAACC唧CTAAG一37，下游两条引 物分别为5乞TGGCTC姗TGAGG一37和 57～TGGCTCTl姗G，rGAGC一37，上下游引物 分别组成C、G两个反应体系．TaqDNA聚合酶、 dNTP和100bp递增的DNA分子量标记(Mark． er)均购于华美生物工程公司；Naa、Ka、Mg— C12、Tns、EDTA和SDS均为国产分析纯． 实验方法：模板、Dr姐的抽提：用酚／氯仿法提 取正常人外周血白细胞中基因组Ⅸ蛆12]为模板． PCR反应体系：模板1止，其余组分的最终 浓度分别为dNTP167肚mol／L，引物(一对) 0．3肛mol／L、TaqDNA聚合酶1．5U'10倍的反应 缓冲液5肛L，镁离子1．5m01／L，加双蒸水至 50肛L． PCR循环程序：95℃预变性5rIlin，然后 94℃变性45s，61℃退火45s，72℃延伸60s， 共33个循环，终未延伸72℃5l】1in． PCR扩增产物的分析及基因型结果的判断： 制备2％琼脂糖凝胶(含0．5肚∥n1L溴化乙锭)， 取PCR产物10弘L与Marker3弘L分别加样，在 80V电压下电泳30min，电泳结束后在＆lD0c 1000紫外检测系统观察电泳结果．根据C、G两 个反应体系扩增产物的有无即可判断基因型． DNA测序：为鉴定由电泳图形推断扩增产物 及基因型是否正确，选取CC、GG基因型的PCR 产物进行双向测序． 2结果 2．1 PcR扩增产物及检测基因型的结果 PCR扩增的目的片段长度为161bp，CC基 因型的电泳谱为只有G的反应体系有161bP片 段．CG基因型的电泳谱为CG两反应体系均有 161bp片段，GG基因型的电泳谱为只有C反应 体系有161bp片段，见图1，表1． c代表c反应体系，G代表G反应体系．1、3、4为 CC基因型，2为GG基因型，5、6为CG基因型。7为阳 性对照，8为阴性对照，M为Dl姐分子量标记 圈1 AsPcR产物琼脂糖凝胶电泳图 F培1Thea舯segeldect姊horesispictureofPCRp尊0duction 表1两种方法所得基因型频率 Tab．1IL一6群md嘲pefre【Iu∞cies谢th“∞methods 2．2 DNA测序结果 CC、GG基因型测序见图2 图2 OC和GG基因型测序图谱 F嘻2These(1uencingpictureof0CandGGgenotype 瓢 万方数据 第4期 安新焕，等．等位特异PcR方法检测IL一6基因启动子区一634dG多态性 23 注：图中箭头所指左为IL一6—634位点C右为IL一6—634位点G 通过与＆nebank序列相对比，可以看出图 中箭头所指为IL一6—634位点碱基，利用双向测 序，既可证实所扩增产物的正确性，又可证实由 扩增产物有无来判断基因型的正确性． 2．3两种方法所得基因型结果 由表1可见：CG和GG基因型两种方法所得 结果相同，CC基因型只有1例误判为CG基因 型． 3讨论 ASPCR和PC—RFI，P是检测是否存在DNA 已知位点变异的两种常用方法．利用PCR— RFIJ方法来检测已知的点突变，需先将待测片 段用适当的引物扩增含有突变点的序列，用特定 的限制性内切酶消化PCR产物，通过电泳图谱直 接判断碱基发生突变与否，如果发生突变的位点 不是某种限制性内切酶的识别位点，则不能用此 方法进行基因多态性及遗传病的检测分析．并且 此种方法耗时较长，价格昂贵【1J．实验中涉及的 因素较多，如果某一环节条件把握不准，就会造 成判断结果的失误．√蟠PCR方法也称为37碱基特 异PCR，是为检测点突变而设计的PCR技术，它 分别在一端设计两条引物，一条是野生型，另一 条为突变型引物，另一端设计一条共同引物，突 变型引物的突变碱基设计在引物的3’端．它利用 Taq酶缺乏3’一5’外切酶活性的特点，在以突变 型引物扩增正常DI她模板时，在其3’端就形成 r错配，延伸反应就会因磷酸二酯键形成困难而 不能进行，也就得不到特异长度的条带，从而表 明模板DNA无此突变，如果PCR结果能得到特 异长度扩增条带，表明模板DNA上具有与引物 3’硷基相应的突变．此种技术也称为扩增受阻突 变体系(删S)．野生型引物与突变型模板之 间以及突变型引物与野生型模板之间均可发生扩 增受阻．若将野生型与突变型引物分别用于同一 DI姐样品的扩增。即可根据扩增片段的电泳谱定 出样品的基因型．IL一6—634C／G多态性是p G突变，所以在扩增片段5’端设计一共同引物， 在37端设计两条引物，此两条引物37末端分别为 C、G，对同一份模板同时进行两次扩增。根据 C、G两反应体系(引物3’末端为C的是C反应 体系。引物3’末端是G的为G反应体系)有无出 现161bp的片段，即可判断基因型，此种方法可 由凝胶电泳结果直接做出基因型的判断。省去了 任何形式的DNA探针分子杂交或限制性内切酶 酶切，也不需要标记引物[3I．但这一方法在目前 尚存在引物模板间的某些碱基错配类型不能(或 不能完全)阻止引物延伸．在具体应用时需考虑 到37末端的设计，要避免A：G，G：A。C：C错 配[3|，所使用的DI蛆聚合酶应缺乏3’一5’外切酶 活性． 我们的研究结果表明：用PCR—RFLP方法 确认是CG和GG基因型的41例中，A卵CR方 法也得到r同样的结果，只有1例CC基因型结 果判断可疑，在C反应体系中也出现161bp的片 段，使我们误判为CG基因型． 对IL一6基因启动子区域一634c／G多态性 的检测，我们同时运用A卵CR和PCR—I疆LP方 法，并且得到了一致的结果，这就为后期得出准 确而科学的结论奠定了基础． AsPCR方法检测基因的已知突变，具有快 速、准确、省时、价格低等优点，在满足引物模 板间碱基错配能阻止引物延伸的条件下，可优先 选用此法．PCR—RFLP方法耗时较长，价格昂 贵，但具有较高的特异性，重复性好．适当的条 件下可选用此法． [参考文献] [1] 朱志刚，张秀珍．00LI趾基因Spl结合位点多态 性与原发性骨质疏松症[J]．国外医学内分泌学分 册，2004，24(4)：236 [2]段勇，王玉明，赵淮，等．从血细胞快速抽提 研蛆的方法探讨[J]．昆明医学院学报，1998， 19(2)：28 [3] 张维铭．现代分子生物学实验手册[M]．北京： 科学出版社，2003．305 (2005—09—18收稿) 万方数据 等位特异PCR方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性 作者： 安新焕， 宋滇平， 王玉明， AN Xin-huan， SOND Dian-ping， WANG Yu-ming 作者单位： 安新焕,宋滇平,AN Xin-huan,SOND Dian-ping(昆明医学院第一附属医院糖尿病科,昆明 ,650032)， 王玉明,WANG Yu-ming(昆明医学院第一附属医院检验科,昆明,650032) 刊名： 昆明医学院学报 英文刊名： ACADEMIC JOURNAL OF KUNMING MEDICAL COLLEGE 年，卷(期)： 2005,26(4) 参考文献(3条) 1.朱志刚;张秀珍 COLIAI基因Spl结合位点多态性与原发性骨质疏松症[期刊]-国外医学(内分泌学分册) 2004(04) 2.段勇;王玉明;赵淮 从血细胞快速抽提DNA的方法探讨 1998(02) 3.张维铭 现代分子生物学实验手册 2003 本文读者也读过(10条) 1. 贾彦红.于君.JIA Yan-hong.YU Jun 白细胞介素6基因多态性与消化道肿瘤发生的关系[期刊论文]-国际消 化病杂志2009,29(3) 2. 刘晓琳 中国北方地区人群白细胞介素—6基因多态性与肺癌关联性的研究[学位论文]2007 3. 陈江辉.李登清.陈子华.CHEN Jiang-hui.LI Deng-qing.CHEN Zi-hua 结直肠癌患者IL-6基因启动子- 174G→C多态性研究[期刊论文]-中国普通外科杂志2007,16(4) 4. 罗建海.廖福干.廖志鹏.LUO Jian-hai.LIAO Fu-gan.LIAO Zhi-peng IL-6基因多态性与变应性鼻炎的关联 性[期刊论文]-解剖科学进展2010,16(5) 5. 周媛.王丽.任美英.王兵.张为远 子宫内膜异位症、子宫肌瘤患者IL-6基因启动子Mbi Ⅰ多态性的研究[期 刊论文]-中国妇幼保健2007,22(7) 6. 何秀萍.王丽丽.赵辉.吴迪.汤海蒂.曹峰林.HE Xiu-ping.Wang Li-li.ZH Hui.WU Di.TANG Hai-di.CAO Feng-lin 白细胞介素-6基因多态性与卵巢癌的相关性研究[期刊论文]-中国优生与遗传杂志2007,15(12) 7. 安新焕.宋滇平.王玉明.AN Xin-huan.SONG Dian-ping.WANG Yu-ming PCR-RLFP方法检测IL-6基因启动子区 -634C/G多态性的实验条件研究[期刊论文]-昆明医学院学报2007,28(4) 8. 肖莹 GM130基因外显子以及IL-6基因多态性与中国西北人群胃癌易患风险相关性的研究[学位论文]2008 9. 刘晓琳.李岩.梁婧.孙殿水.戴悦.曹邦伟 白细胞介素-6基因多态性与肺癌易感关联性的研究[期刊论文]-中 国肿瘤临床2007,34(10) 10. 李岩.刘晓琳.梁婧.孙殿水.刘海荣.LI Yan.LIU Xiao-lin.HANG Jing.SUN Dian-shui.LIU Hai-rong 非小 细胞肺癌患者白细胞介素-6基因多态性研究[期刊论文]-国际肿瘤学杂志2008,35(2) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_kmyxyxb200504005.aspx